La isquemia reperfusión renal: un modelo de ratón de la lesión y regeneración

Resumen

The mouse model of renal ischaemia reperfusion injury described here comprises of a right nephrectomy that provides control tissue and clamping of the left renal pedicle to induce ischaemia that results in acute kidney injury. This model uses a midline laparotomy approach with all steps performed via one incision.

Resumen

Renal lesión por isquemia de reperfusión (IRI) es una causa frecuente de lesión renal aguda (LRA) en pacientes y oclusión del flujo sanguíneo renal es inevitable durante el trasplante renal. Los modelos experimentales que precisa y reproducible recapitulan IRI renal son cruciales en la disección de la fisiopatología de la lesión renal aguda y el desarrollo de nuevos agentes terapéuticos. Se presenta aquí un modelo de ratón de IRI renal que resulta en reproducible AKI. Esto se consigue mediante un enfoque de la laparotomía de la línea media para la cirugía con una incisión que permite tanto una nefrectomía derecha que proporciona tejido de control y de sujeción del pedículo renal izquierda para inducir isquemia del riñón izquierdo. Por un control cuidadoso de la posición de sujeción y la temperatura corporal durante el período de isquemia este modelo alcanza una lesión funcional y estructural reproducible. Ratones sacrificados 24 horas después de la cirugía demostrar la pérdida de la función renal con la elevación del nivel de creatinina en suero o plasma, así como estructurasdaño renal estructural con necrosis tubular aguda evidente. La función renal mejora y la lesión tisular aguda se resuelve en el transcurso de 7 días después de IRI renales tales que este modelo puede ser usado para estudiar la regeneración renal. Este modelo de IRI renal se ha utilizado para estudiar la fisiopatología molecular y celular de AKI así como el análisis de la regeneración renal posterior.

Introducción

La isquemia lesión por reperfusión (IRI) es un modo común de lesión para múltiples órganos, incluyendo el riñón, corazón y cerebro. Renal IRI puede conducir a una lesión renal aguda (LRA) en pacientes y no hay tratamiento específico disponible. AKI como resultado de IRI tiene una patogénesis complicado que implica tanto la respuesta inmune innata y adaptativa ^1. Un modelo experimental de IRI renal ofrece el potencial para diseccionar las células clave y mediadores implicados en la patogénesis de la lesión renal aguda, así como la regeneración renal posterior que se produce en los días subsecuentes. Además, los efectos de los agentes terapéuticos novedosos sobre los procesos de enfermedad pueden ser evaluados.

El objetivo general del modelo experimental de IRI renal se describe aquí es para inducir tanto la lesión aguda del riñón funcional y estructural. Algunos investigadores han utilizado un modelo que implica la inducción de IRI bilaterales ^2. Aunque el modelo bilateral IRI renal es de uso, el ren unilateralmodelo al IRI tiene la ventaja de una nefrectomía derecha está llevando a cabo en el momento de la cirugía. El tejido nefrectomía derecha sirve como valiosa tejido de control en los estudios que implica una etapa de tratamiento previo que induzca o suprime la expresión de un gen o proteína. Por ejemplo, hemos utilizado este modelo para evaluar los efectos de preacondicionamiento de arginato hemo (HA) de inyección de 24 horas antes de IRI renal ^3. La inducción exitosa de la enzima citoprotector hemo-oxigenasa-1 (HO-1) por HA antes de IRI se confirmó en el tejido de control nefrectomía derecha ^4. HA reduce IRI renal en ratones viejos, en parte, a través de un mecanismo de HO-1 dependiente. Del mismo modo, se ha utilizado el modelo en estudios de agotamiento de los macrófagos para examinar el papel de los macrófagos en el IRI renal ^5. El análisis inmunohistoquímico del tejido nefrectomía derecha se puede utilizar para confirmar la eficacia de la metodología de la ablación. Por consiguiente, el tejido de nefrectomía derecha se puede utilizar para confirmar y cuantificar el nivel de induction o inhibición de la molécula de interés en cada animal de experimentación individuo. Este modelo será de interés para los investigadores que están utilizando medicamentos u otros compuestos que modulan la expresión de genes o proteínas, etc antes de la inducción de la IRI renal.

Otros estudios han utilizado incisiones flanco para acceder a los riñones. El modelo descrito aquí utiliza una sola cirugía abdominal en la línea media para llevar a cabo tanto la nefrectomía derecha e inducir isquemia reperfusión del riñón izquierdo. Este abordaje quirúrgico proporciona una excelente visualización del campo quirúrgico que incluye los pedículos renales y cambios de color que siguen de sujeción pedículo renal. Nuestra experiencia publicada con el modelo ^4-6 indica que los ratones que se recuperan rápidamente de la cirugía con una tasa de supervivencia de casi el 100%.

Por último, el análisis cinético del modelo durante un período de 7 días indica que este modelo presenta la restauración de tanto la función renal y la integridad tubular, conla proliferación de las células tubulares significativa.

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Protocolo

NOTA:. Los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con los lineamientos y regulaciones impuestas por la Ley de 1986 Animales (Procedimientos Científicos) Los procedimientos se llevaron a cabo utilizando (en autoclave) instrumentos y consumibles quirúrgicos estériles. Mientras que el modelo murino de IRI renal presenta aquí se realizó en un ratón Balb / c que puede aplicarse de forma reproducible en una variedad de cepas murinas de cualquier género típicamente entre 7 8 semanas de edad, macho - 15 semanas, siendo el óptimo edad 8 semanas. Los datos presentados en la sección de resultados representativos se obtuvo de tanto ratones Balb / c y ratones FVB. La aplicación de la solución salina calentada se utiliza para mantener los intestinos y el área quirúrgica húmedo, pero que se debe monitorizar cuidadosamente y se mantiene a un mínimo como la aplicación excesiva de líquidos puede conducir a una reducción de los artefactos del suero o plasma los niveles de creatinina, que es un importante lectura experimental.

1. Preparación de los animales y laparotomía

1. Se anestesia el ratón con clorhidrato de ketamina (70 mg / kg) y clorhidrato de medetomidina (1 mg / kg) por vía intraperitoneal y confirmar la profundidad de la anestesia por la pérdida de los reflejos por ejemplo pizca dedo del pie. La duración del plano anestésico resultante es de 4 horas. Esto es suficiente para llevar a cabo todo el procedimiento quirúrgico y no se requiere anestesia suplementaria.
2. Quite el pelo que rodea el área de la incisión, asegúrese que el área esté libre de cabello suelto, y desinfectar la piel del abdomen con una solución de clorhexidina diluida.
3. Coloca el ratón sobre un cojín quirúrgico climatizada en posición supina y fijar los miembros superiores e inferiores a la plataforma con cinta adhesiva de baja adherencia. Asegúrese de que las extremidades superiores se mantienen en una posición normal para evitar la compresión de pulmón. Durante todo el procedimiento monitorizar el ratón para quemaduras térmicas. Si es posible, se recomienda utilizar una fuente de calor no eléctrica.
4. Administrar el hidrocloruro de buprenorfina analgésica (0,06 mg / kg)subcutánea y aplicar lubricante ocular para los ojos para evitar que se seque la córnea. Los analgésicos se administran antes de la cirugía con el fin de ayudar a la recuperación post-quirúrgica.
5. Uso de una hoja de bisturí de separación tijeras tejido o hacer una incisión de laparotomía media y sin rodeos separa la piel del peritoneo. Esto permite que la piel y el peritoneo a ser suturadas por separado durante el cierre de la herida. Una incisión de la línea alba avascular se hace que da acceso a la cavidad peritoneal.
6. Para crear una vista clara del área quirúrgica insertar un retractor y cuelgue el ratón.

2. División del uréter y nefrectomía derecha

1. Empuje suavemente los intestinos hacia el lado izquierdo de la cavidad abdominal con hisopos de algodón esterilizados en autoclave humedecidos con solución salina para exponer el riñón derecho y el uréter. Cubra los intestinos con cortinas humedecidas para evitar la desecación.
2. Levante el uréter derecho con una pinza en ángulo. Se une el uréter derecho dos veces con 6/0 silsutura trenzada a k. Para los experimentos a largo plazo, utilizar suturas absorbibles para todas las cirugías abdominales.
3. Divida el uréter entre las suturas. Mientras que la unión vesicoureteral debe evitar que la orina se escape en el peritoneo de la vejiga al uréter se une como una salvaguarda contra cualquier fuga después de la operación durante los experimentos a largo plazo.
4. Para permitir un acceso más fácil al realizar la nefrectomía derecha, empuje suavemente hacia arriba hígado y hacia la derecha con un bastoncillo de algodón humedecido y mantener en su lugar con una gasa humedecida para exponer la arteria renal derecha y la vena.
5. Francamente diseccionar el tejido conjuntivo y la grasa a lo largo de la cara medial del riñón derecho hasta la arteria renal derecha y la vena.
6. Crear un canal debajo de la arteria renal y la vena deslizando cuidadosamente las pinzas en ángulo por debajo de los vasos sanguíneos. Guía de los fórceps por debajo con las puntas cerradas y retire suavemente con la punta abierta con el fin de facilitar la formación de la canal.
7. Repita el paso 2.6 hasta que las puntas de la pinza son visibles a través de los tejidos conectivos justo por encima de la arteria y la vena renal. Una vez visibles frotar suavemente las puntas de la pinza contra la punta de otro conjunto de pinzas en ángulo para romper suavemente el tejido conectivo.
8. Con la arteria renal y la vena claramente accesible que ahora pueden ser ocluidos. Deslice con cuidado forceps en ángulo por debajo de la arteria y vena renal con las puntas cerradas. Una vez en su lugar abrir las puntas de la pinza y guiar el aplicador del clip hemostático entre las puntas y firmemente aplicar un clip hemostático en la arteria y vena renal cerca de los riñones. Alternativamente, la arteria renal y la vena se pueden ligar utilizando sutura 6/0 de seda trenzada.
9. Divida la arteria renal obstruida y la vena cerca del riñón, que ahora puede ser removido con cualquier tejido conectivo adherente restante.
10. Retire cualquier gasa se utiliza para mantener el hígado y reemplazar los intestinos con hisopos de algodón.

3. La isquemia del riñón izquierdo y reperfusión

1. Empuje suavemente los intestinos hacia el lado derecho de la cavidad abdominal con hisopos de algodón para exponer el riñón izquierdo y el uréter y cubrir con paños humedecidos. Si es necesario que el páncreas pueden ser desviados con una gasa humedecida para facilitar la tarea.
2. Utilice una disección roma para romper suavemente los tejidos conectivos anterior y posterior a la arteria renal izquierda y la vena, y luego crear un canal por debajo de los buques en una manera similar a la descrita en la División del uréter y nefrectomía derecha el paso 2.4.
3. Inducir la isquemia del riñón izquierdo mediante la aplicación de un clip de micro serrafine sobre la arteria y la vena renal. Isquemia exitosa puede ser confirmada visualmente por un oscurecimiento uniforme gradual del riñón. Los vasos sanguíneos en Además de la arteria renal izquierda y la vena ocasionalmente pueden suministrar el riñón. Si está presente, también tendrán que ser ocluida usando micro clips serrafine con el fin de éxito estos vasos sanguíneos adicionalesinducir isquemia de todo el riñón.
4. Vuelva a colocar los intestinos y cuidadosamente asegurar que no hay giros bruscos que pueden conducir a resultados comprometedores isquemia intestinal. Temporalmente cerrar el peritoneo con una sola sutura.
5. Después de la inducción de isquemia colocar inmediatamente el ratón sobre una manta homeotérmica con un termistor rectal conectada a una unidad de control que mantenga la temperatura corporal a 37 º C durante la duración requerida de la isquemia. Para definir la longitud adecuada de la isquemia necesario para inducir el grado deseado de lesión renal e insuficiencia renal se recomienda que se realice una valoración para cada cepa y el operador quirúrgico.
6. Poco antes del final del período isquémico de re-abrir el peritoneo y cuidadosamente la posición de los intestinos para permitir el acceso a la abrazadera y ver el riñón. La inserción del retractor, como se muestra en el video, no es necesario y se lleva a cabo únicamente para fines de presentación.
7. Retire el clamp después del período de isquemia ha concluido. Inmediatamente después de la extirpación del riñón va a cambiar con rapidez de color de un marrón oscuro a un color rosa oscuro sana indicando reperfusión exitosa.
8. Una vez más asegurarse de que los intestinos no están trenzados antes de cerrar el peritoneo con una puntada manta usando 6/0 sutura de seda trenzada. A continuación, cierre la piel con clips metálicos de la piel.
9. Para minimizar el riesgo de infección post-operatoria, aplicar un antiséptico tal como una solución de yodo / alcohol para el área quirúrgica.

4. Recuperación y cuidado post-operatorio

1. Anestesia parcialmente inversa con clorhidrato de atipamezol (2 mg / kg) por vía subcutánea y administrar líquidos con una inyección subcutánea de 1 ml de solución salina calentado para prevenir la deshidratación después de la cirugía.
2. Controle cuidadosamente los ratones hasta que se hayan recuperado la conciencia, aparecerá la alerta y son capaces de enderezarse.
3. Permitir que los ratones para recuperar en una caja climatizada mantuvieron a 29 ° C, locATED en un entorno tranquilo, durante 24 horas. Los ratones tienen un deterioro de la capacidad para regular la temperatura debido a la anestesia, por lo que es crucial que se alojan a una temperatura elevada para permitir la recuperación efectiva. Comida humedecida también se puede proporcionar para fomentar fluido y la ingesta de nutrición.
4. Para los experimentos de recuperación a largo plazo proporcionan analgésicos en curso y eliminar clips de la piel 7 días después de la cirugía.

5. Evaluación Funcional y Estructural Lesión del riñón y Regeneración

1. La sangre se puede recoger de la vena de la cola durante los experimentos o por punción cardiaca en el momento de la eutanasia al final del experimento. Medir la función renal mediante la creatinina sérica, usando un método basado creatinasa, y el nitrógeno de urea en sangre (BUN) en un analizador centrífugo bioquímica como se ha descrito previamente ^7. La función renal de los ratones sanos normales debe ser determinado antes de establecer un modelo de insuficiencia renal, ya que puede variar notablemente depending en el método de análisis utilizado por ejemplo, la reacción de Jaffe y métodos creatinasa basado para medir la creatinina dar resultados diferentes.
2. Examinar la estructura renal por histopatología en secciones de tejidos embebidos en parafina de riñón teñidas con hematoxilina y eosina (H & E) o ácido periódico de Schiff (PAS). Captura de entre 5 - 10 Imágenes aumento de 200x dentro de la franja exterior de la médula exterior (OSOM) para cada ratón. Evaluar el nivel de la lesión en el OSOM ya que esta región se lesiona en este modelo, ya que es altamente vulnerable a la hipoxia.
3. Utilice uno de los dos sistemas de puntuación que se detallan a continuación para medir la necrosis tubular aguda (NTA) o regeneración. Morfología Representante de las clasificaciones utilizadas en estos sistemas se ilustra en la Figura 1.
4. Utilice un sistema binario sencillo para anotar ATN. Sobre la base de la integridad celular y la marca de la morfología y contar túbulos como sea viable (morfología intacta de células) o necrótico (integración célula comprometidagridad, morfología celular anormal o pérdida de células).
   1. Expresar el número de túbulos necróticas como un porcentaje del número total de túbulos (túbulos necrótico%).
5. Clasifique la regeneración utilizando otro sistema basado en la integridad celular, la morfología y el número de núcleos. Marcar y contar túbulos tan saludable, necrótico, lesionados o recuperándose de acuerdo con los criterios enumerados en los siguientes pasos.
   1. Al igual que con el sistema de puntuación ATN (se detalla en el paso 5.4) Marcar túbulos con células normales intactas como sanos, mientras que túbulos que muestran integridad de la célula comprometida, morfología celular anormal o pérdida de células abierta deben ser marcados como necrótico.
   2. Clasifique túbulos como heridos si tienen un citoplasma adelgazada contiene pocos núcleos. Por el contrario, designar túbulos que contienen más núcleos con más morfología celular normal como en recuperación.
   3. Expresa cada clasificación túbulo como un porcentaje del número total de túbulos.

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Resultados

Lesión tubular y la recuperación pueden ser evaluados por H & E o tinción PAS de las secciones de tejidos siguientes IRI renal. Túbulos situados dentro de la OSOM se clasifican como sano, lesionado, necrótico o recuperación de acuerdo con la morfología celular, la integridad y el número de núcleos (Figura 1). La lesión estructural y funcional en este modelo depende de la duración de la isquemia. Un aumento progresivo de la gravedad de la disfunción renal, evaluada por la creatinina plasm...

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Discusión

Renal IRI es una causa importante de lesión renal aguda con tratamiento específico disponible. El estudio experimental de IRI renal ha sido muy informativo con trabajos anteriores que demuestran el papel de los macrófagos, células dendríticas, linfocitos, células T reguladoras, así como otras células y mediadores en la inducción tanto de la lesión aguda y fase de curación ^{5,8 - 16.} Además, el IRI renal experimental se ha utilizado para evaluar el efecto de diversos agentes terapéuticos ^4,17-...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tissue scissors	Fine Science Tools	14072 - 10
Micro-Adson forceps (Rat toothed)	Fine Science Tools	11019 - 12
S&T JFA-5bTC Forceps - SuperGrip Angled	Fine Science Tools	00649-11
Colibri retractor	Fine Science Tools	17000 - 04
Micro clip applicator	Fine Science Tools	18057-14
Micro serrafines	Fine Science Tools	18055-04
Olsen-Hegar needle holder	Fine Science Tools	12002 - 12
Hemoclip Plus Ligating Clips Small	Weck	533837
Autoclip Wound Clip System, 9mm	Harvard Apparatus	PY2 52-3748
Silk Black Braided Suture, Size 6-0	Harvard Apparatus	723288
Standard Heat Matt
Homeothermic Blanket & Control Unit	Harvard Apparatus
Lacri-Lube	Allergan
Vetasept Chlorhexidine	AnimalCare
Vetalar : Ketamine hydrochloride			100 mg/ml solution
Domitor : medetomidine hydrochloride			1 mg/ml
Vetergesic : Buprenorphine hydrochloride			0.3 mg/ml
Antisedan : Atipamezole hydrochoride			5 mg/ml