신장 허혈 재관류 상해 : 상해의 마우스 모델 및 재생

요약

The mouse model of renal ischaemia reperfusion injury described here comprises of a right nephrectomy that provides control tissue and clamping of the left renal pedicle to induce ischaemia that results in acute kidney injury. This model uses a midline laparotomy approach with all steps performed via one incision.

초록

신장 허혈 재관류 손상 (IRI)가 환자와 신장 혈류의 폐쇄 급성 신장 손상 (AKI)의 일반적인 원인은 신장 이식 동안 피할 수 없다. 정확하고 재현성 신장 IRI 요점을 되풀이 실험 모델은 AKI의 병태 생리 및 새로운 치료제의 개발을 해부에서 매우 중요하다. 재현 AKI 결과 신장 IRI의 마우스 모델은 여기에 제시했다. 이것은 하나의 절개 제어 조직과 왼쪽 신장의 허혈을 유도하는 왼쪽 신장 작은 꽃자루의 클램핑을 제공하는 권리 신장 절제술을 모두 허용과 수술에 대한 중간 선 개복술 방법에 의해 달성된다. 허혈의 기간 동안 클램프 위치와 체온의주의 감시함으로써,이 모델은 재현성 기능적 및 구조적 손상을 달성한다. 마우스는 혈청 또는 혈장 크레아티닌 상승 등으로 신장 기능의 손실을 보여 수술 후 24 시간을 희생 구 조분명 급성 관 괴사 투랄 신장 손상. 신장 기능을 향상시키고 심각한 조직 손상이 모델은 신장 재생을 연구하는 데 사용 될 수 있도록 신장 IRI 다음 칠일의 과정에서 해결합니다. 신장 IRI의이 모델은 분자 및 세포 AKI의 병태 생리뿐만 아니라 이후의 신 재생 분석을 연구하기 위해 활용되고 있습니다.

서문

허혈 재관류 손상 (IRI)는 신장, 심장, 뇌 등의 여러 장기에 대한 손상의 일반적인 모드입니다. 신장 IRI는 환자에서 급성 신장 손상 (AKI)으로 이어질 수 있으며, 특정 치료는 사용할 수 없습니다. IRI의 결과로 AKI는 타고난 및 적응 면역 반응 ^한 모두를 포함하는 복잡한 기전을 가지고 있습니다. 신장 IRI의 실험 모델은 키 세포와 AKI의 발병 기전뿐만 아니라 이후의 일 동안 계속된다 후속 신 재생에 관여 매개체를 해부 할 수있는 가능성을 제공합니다. 또한 질병 프로세스에 따라 새로운 치료제의 효과가 평가 될 수있다.

신장 IRI의 실험 모델의 전반적인 목표는 여기에 설명이 급성 구조와 기능 신장 손상을 유발하는 것입니다. 일부 연구자들은 양자 IRI ^2의 유도를 포함하는 모델을 사용했다. 양측 신장 IRI 모델은 사용의 일방적 인 르네이지만앨라배마 IRI 모델은 수술시에 수행되는 오른쪽 신장 절제술의 이점을 갖는다. 오른쪽 신장 절제 조직 중 하나를 유도하거나 유전자 또는 단백질의 발현을 억제하는 전처리 단계를 포함하는 연구에서와 같이 중요한 제어 조직을 제공합니다. 예를 들어, 우리는 24 시간 신장 IRI ³ 전 헴 알긴산의 사전 조정 효과 (HA) 주입을 평가하기 위해이 모델을 사용하고 있습니다. IRI 전에 HA에 의한 세포 보호 효소 헴 시게나 제 -1 (HO-1)의 성공적인 유도는 오른쪽 신장 절제술 제어 티슈 ^4에서 확인되었다. HA는 HO-1에 의존 메커니즘을 통해 부분에 세 생쥐의 신장 IRI를 감소. 마찬가지로, 우리는 신장 IRI ⁵ 대 식세포의 역할을 검토하는 대식 세포 고갈 연구 모델을 사용했다. 오른쪽 신장 절제술 조직의 면역 조직 화학적 분석은 절제 방법의 효능을 확인하기 위하여 사용될 수있다. 오른쪽 신장 절제 조직 따라서 확인에 모두 사용하고 난의 수준을 정량화 할 수있다nduction 또는 각각의 실험 동물에 대한 관심의 분자의 억제. 이 모델은 사전 신장 IRI 유도하는 유전자 나 단백질 등의 발현을 조절하는 약물 또는 다른 화합물을 사용하는 연구자가 관심을 가질 것이다.

다른 연구는 신장에 액세스하는 측면 절개를 사용했습니다. 여기에 설명 된 모델은 오른쪽 신장 절제술을 모두 수행하고 남은 신장 허혈 재관류를 유도하는 하나의 중간 선 복부 수술을 사용한다. 이 수술 방법은 신장 척추 경 클램핑을 따라 신장 pedicles 및 색상 변경을 포함하여 수술 분야의 뛰어난 시각화를 제공합니다. 모델 ^4-6 게재 된 경험이 마우스는 빨리 가까운 100 %의 생존율과 수술에서 회복을 나타냅니다.

마지막으로, 7 일의 기간 동안 모델의 운동 분석이 모델은 신장 기능과 관 양측 모두 복원을 나타내는 것을 나타냅니다로심각한 관상 세포 증식.

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프로토콜

참고 :. 동물 실험 동물 (과학적인 절차) 법 1986에 의해 부과 된 지침과 규정에 따라 수행되었다 절차가 살균 (멸균) 수술기구 및 소모품을 사용하여 수행 하였다. 최적의 연령 존재로, 15 주 - 신장 IRI의 쥐 모델은 여기에 제시하는 동안은 8 주 된 남성이 재현 일반적으로 7 세 사이의 남녀 하나의 쥐의 변종의 다양한 수행 할 수 있습니다을 Balb / C 마우스에서 수행되었다 팔주. 대표적인 결과 섹션에 제시된 데이터의 Balb / C 및 FVB 마우스 모두에서 얻었다. 따뜻하게 식염수의 응용 프로그램이 촉촉한 장 및 수술 영역을 유지하는 데 사용하지만,주의 깊게 모니터링 및 유체의 과도한 응용 프로그램으로 최소한으로 유지해야하는 것은 중요하다 혈청 또는 혈장 크레아티닌 수준의 저하 인공적으로 이어질 수 있습니다 실험 판독.

1. 동물 준비 및 개복술

<올>

복강 케타민을 하이드로 클로라이드 (70 ㎎ / ㎏)과 medetomidine 염산염 (1 ㎎ / ㎏)와 마우스를 마취 및 반사 예를 들면 발가락 핀치의 손실에 의해 마취의 깊이를 확인합니다. 얻어진 마취 평면의 재생 시간을 4 시간이다. 이것은 전체 수술 절차를 수행하기에 충분하며, 제공된 보충 마취가 필요하지 않다.

, 절개 주변 지역 머리카락을 제거 영역이 느슨한 머리 무료입니다 있는지 확인하고 희석 클로르헥시딘 용액을 사용하여 복부의 피부를 소독.

앙와위에서 가열 된 수술 패드에 마우스를 놓고 낮은 압정 접착 테이프를 사용하여 패드에 상부 및 하부 사지를 고정합니다. 상지는 폐의 압축을 방지하기 위해 정상 위치에서 유지되어 있는지 확인합니다. 절차 전반에 걸쳐 열 화상에 대한 마우스를 모니터링 할 수 있습니다. 가능한 경우가 아닌 전기 열원을 사용하는 것이 좋습니다.

진통 부 프레 노르 핀 염산염 관리 (0.06 ㎎ / ㎏)피하 및 각막 건조를 막기 위해 눈에 눈 윤활제를 적용. 진통제는 수술 후 회복을 돕기 위해 사전에 작동 관리됩니다.

조직 가위를 분리 또는 메스 블레이드를 사용하여 중간 선 개복술의 절개를하고 퉁명스럽게 복막으로부터 피부를 구분합니다. 이는 피부와 복막 상처 폐쇄 중에 별도로 봉합 할 수있다. 무 혈관의 리네아 알바의 절개 복강에 대한 액세스를 제공한다.

외과 영역의 명확한 뷰를 만들려면 트랙터를 삽입하고 마우스를 주름 잡아 드리운다.

2. 요관 부문과 오른쪽 신장 절제술

1. 오른쪽으로 천천히 신장과 요관을 노출하는 생리 식염수에 적신 멸균 멸균 면봉을 사용하여 복강의 왼쪽으로 내장을 밀어 넣습니다. 건조를 막기 위해, 습 커튼과 내장을 커버.
2. 각도 집게로 오른쪽 요관를 들어 올립니다. 두 번 6 / 0 SIL을 사용하여 올바른 요관을 결찰K-꼰 봉합. 장기 실험을 위해, 모든 복부 수술에 대한 흡수성 봉합사를 사용합니다.
3. 봉합 사이의 요관을 나눈다. vesico-ureteric 접합 방광 복막으로 새는 소변을 방지해야한다 반면 요관 장기적인 실험을하는 동안 수술 후 누출에 대한 보호로 결찰한다.
4. 오른쪽 신장 절제술을 수행 할 때 쉽게 액세스 할 수 있도록하기 위해, 가볍게 적신 면봉을 사용하여 간 오른쪽 위로 밀어 오른쪽 신장 동맥과 정맥을 노출 적신 거즈를 사용하는 장소에서 개최.
5. 퉁명스럽게까지 오른쪽 신장 동맥과 정맥으로 오른쪽 신장의 안쪽면을 따라 결합 조직과 지방을 해부하다.
6. 조심스럽게 혈관 아래 각진 집게를 밀어 신장 동맥과 정맥 아래 채널을 만듭니다. 팁 폐쇄 부드럽게 채널의 형성을 촉진하기 위해 오픈 팁을 제거와 함께 아래의 집게를 안내합니다.
7. 집게의 끝이 바로 신장 동맥과 정맥 위의 결합 조직을 통해 볼 수 있습니다 때까지 단계 2.6를 반복합니다. 일단 볼을 부드럽게 부드럽게 결합 조직을 깰 각도 집게의 또 다른 세트의 팁에 대해 포셉의 팁을 문질러.
8. 신장 동맥과 정맥을 명확하게 접근으로 그들은 지금 폐색 할 수있다. 조심스럽게 신장 동맥 아래 각도 집게를 밀어 팁 닫힌 정맥. 일단 자리에 집게의 끝을 열고 끝 사이의 지혈 클립 도포 구를 안내하고 단단히 신장 동맥에 지혈 클립을 적용하고 가까운 신장에 정맥. 또는 신장 동맥과 정맥 6 / 0 실크 꼰 봉합사를 이용하여 결찰 할 수 있습니다.
9. 지금 남아있는 접착 결합 조직으로 제거 할 수있는 폐색 신장 동맥과 신장에 가까운 정맥을 나눕니다.
10. 간을 잡고 면봉 내장을 대체하기 위해 사용되는 거즈를 제거합니다.

3. 왼쪽 신장의 허혈 및 재관류

1. 부드럽게 왼쪽 신장과 요관을 노출하고 습 커튼 커버하기 위해 면봉과 복강의 오른쪽으로 내장을 밀어 넣습니다. 필요한 경우 췌장은 더 쉽게 액세스 할 수 있도록 습윤 가제로 편향 될 수있다.
2. 부드럽게 결합 조직이 왼쪽 신장 동맥과 정맥에 전방 및 후방 휴식 무딘 절개를 사용하고 2.4이 요관 부문과 오른쪽 신장 절제술의 단계를 설명하는 것과 유사한 방식으로 혈관 아래에 채널을 만듭니다.
3. 신장 동맥과 정맥에 마이크로 serrafine 클립을 적용하여 왼쪽 신장의 허혈을 유도한다. 성공적인 허혈 외형 신장의 점진적인 균일 검은 얼룩에 의해 확인 될 수있다. 좌측 신장 동맥 및 정맥 이외에 혈관 때때로 신장을 공급할 수있다. 존재하는 경우, 이러한 추가 혈관도 성공적으로 위해 마이크로 serrafine 클립을 사용하여 폐색해야합니다전체 신장의 허혈을 유도한다.
4. 창자를 교체하고 신중하게 장 허혈의 타협의 결과로 이어질 수 있습니다 갑작스런 왜곡이 없는지 확인합니다. 일시적으로 하나의 봉합과 복막을 닫습니다.
5. 허혈의 유도에 따라 즉시 허혈 필요한 기간 동안 37 ° C의 체온을 유지하는 제어 장치에 부착 된 직장 서미스터와 homeothermic 담요에 마우스를 놓습니다. 신 손상 및 신부전의 원하는 정도를 유도 할 필요가 허혈의 적절한 길이를 정의하려면 그것은 적정 각각의 변형 및 수술 운영자 수행하는 것이 좋습니다.
6. 곧 허혈성 기간이 종료되기 전에 복막을 다시 열고 조심스럽게 클램프에 대한 액세스를 허용하고 신장을 보려면 내장을 배치합니다. 권취 장치의 삽입은, 영상에 도시 된 바와 같이, 필요가없고 오직 표상적인 목적으로 수행되었다.
7. CL을 제거허혈의 기간이 지난 후 앰프는 결론을 내렸다. 즉시 제거 후 신장이 빠르게 재관류를 나타내는 건강한 진한 핑크에 어두운 적갈색의 색상을 변경합니다.
8. 다시 장내는 이전 6 / 0 꼰 실크 봉합사를 사용하여 담요 스티치 복막을 닫기에 트위스트되지 않도록. 그런 금속 피부 클립을 사용하여 피부를 닫는다.
9. , 수술 후 감염의 위험을 최소화하는 등의 외과 영역에 요오드 / 알코올 용액으로 소독을 적용합니다.

4. 수술 후 회복 및 관리

1. atipamezole 염산염 부분적으로 역 마취 (2 ㎎ / ㎏) 피하 및 1 ㎖의 피하 주사와 유체 관리는 수술 후 탈수를 방지하기 위해 식염수를 따뜻하게.
2. 그들은 의식을 회복 할 때까지 조심스럽게 마우스를 모니터링, 경고 표시와 스스로를 잘 할 수 있습니다.
3. 가열 상자에 복구 할 수있는 마우스는 29 ° C에서, LOC로 유지 허용24 시간 동안, 조용한 환경에서 ated. 쥐 때문에 마취에 온도 조절하는 장애인 능력을 가질 것이고 그것은 그들이 효과적인 복구를 가능하게 상승 된 온도에서 보관하는 것이 때문에 매우 중요하다. 적신 음식은 유체 및 영양 섭취를 장려하기 위해 제공 될 수있다.
4. 장기 복구 실험 진행 진통제를 제공하고 수술 후 칠일 피부 클립을 제거 들어.

5. 기능과 구조 신장 손상과 재생을 평가

1. 혈액은 실험의 끝에 안락사시 실험 도중 또는 심장 천자에 의해 꼬리 정맥으로부터 수집 될 수있다. 앞서 설명한 바와 같이 ⁷ 원심 생화학 분석기 creatinase 기반 방법, 및 혈액 요소 질소 (BUN)를 사용하여, 혈청 크레아티닌으로 신장 기능을 측정한다. 정상적인 건강한 쥐의 신장 기능이 같이 신부전 모델이 확립되기 전에 결정되어야하는 dependi 현격히 다를 수제피 반응과 크레아티닌을 측정하기위한 creatinase 기반 방법 예를 들어, 사용 된 분석 방법에 NG가 다른 결과를 제공합니다.
2. 헤 마톡 실린 및 에오신 (H & E) 또는 요오드 산 쉬프 (PAS) 염색 파라핀 신장 조직 섹션에 조직 병리학 신장의 구조를 검사합니다. 각 마우스의 외부 수질 (OSOM)의 외부 스트라이프 내에서 200 배 확대 한 이미지가 10 - 5 사이를 캡처합니다. 이 지역이 모델에서 부상으로 저산소증에 매우 취약하기 때문에 OSOM 부상의 수준을 평가합니다.
3. 급성 관 괴사 (ATN) 또는 재생을 측정하기 위해 아래 설명 된 두 채점 시스템 중 하나를 사용합니다. 이러한 시스템에 사용되는 분류의 대표적인 형태는도 1에 도시되어있다.
4. ATN 점​​수 간단한 이진 시스템을 사용합니다. 셀룰러 무결성 및 형태학 마크에 기초하여 실행 가능한 (손상 세포 형태) 또는 괴사 (손상 세포 INTE 하나로서 세뇨관 카운트grity 비정상적인 세포 형태 또는 세포의 손실).
   1. 세관의 총 수 (괴사 세관의 %)의 비율로 괴사 세관의 수를 표현한다.
5. 셀 무결성, 형태학 및 핵 수에 기반 다른 시스템을 사용하여 재생을 분류. 마크와 계산 세관 등, 건강한 괴사, 부상 또는 다음 단계에 나열된 기준에 따라 복구.
   1. (단계 5.4에서 설명) ATN 채점 시스템으로 손상된 세포의 무결성을 보여주는 세관 동안 건강한 그대로 정상 세포와 마크 세관은 비정상적인 세포 형태 또는 명백한 세포의 손실은 괴사로 득점해야한다.
   2. 부상으로 그들은 몇 가지 핵을 포함하는 박형의 세포질이있는 경우 세관을 분류합니다. 대조적으로, 회수로보다 정상 세포 형태와 더 핵을 함유 세뇨관 지정.
   3. 총 세관의 수의 비율로 각 세관 분류를 표현한다.

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결과

관 손상 및 복구는 H & E에 의해 평가 또는 신장 IRI 다음 조직 섹션의 PAS 염색 할 수있다. OSOM 내에있는 세관은 세포 형태, 무결성 및 핵 번호 (그림 1)에 따라, 건강 손상, 괴사 또는 복구로 분류됩니다. 이 모델의 구조와 기능 손상은 허혈의 지속 시간에 따라 달라집니다. 허혈의 기간 (그림 2) 2 분 단위로 증가함에 따라 혈장 크레아티닌 및 BUN에 의해 평가 신장 기능 장애?...

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토론

신장 IRI는 사용할 수없는 특정 치료 AKI의 중요한 원인이다. 신장 IRI의 실험 연구는 대 식세포, 수지상 세포, 림프구, 규제 T 세포뿐만 아니라 다른 세포와 급성 손상 및 위상 ^{5,8 치유} 모두의 유도에 중재자의 역할을 보여주는 이전의 연구와 매우 유익했습니다 ^{- 16.} 또, 실험 신장 IRI 여러가지 치료제 ^4,17-19의 효과를 평가하기 위해 사용되었다.

여기에 ?...

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자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tissue scissors	Fine Science Tools	14072 - 10
Micro-Adson forceps (Rat toothed)	Fine Science Tools	11019 - 12
S&T JFA-5bTC Forceps - SuperGrip Angled	Fine Science Tools	00649-11
Colibri retractor	Fine Science Tools	17000 - 04
Micro clip applicator	Fine Science Tools	18057-14
Micro serrafines	Fine Science Tools	18055-04
Olsen-Hegar needle holder	Fine Science Tools	12002 - 12
Hemoclip Plus Ligating Clips Small	Weck	533837
Autoclip Wound Clip System, 9mm	Harvard Apparatus	PY2 52-3748
Silk Black Braided Suture, Size 6-0	Harvard Apparatus	723288
Standard Heat Matt
Homeothermic Blanket & Control Unit	Harvard Apparatus
Lacri-Lube	Allergan
Vetasept Chlorhexidine	AnimalCare
Vetalar : Ketamine hydrochloride			100 mg/ml solution
Domitor : medetomidine hydrochloride			1 mg/ml
Vetergesic : Buprenorphine hydrochloride			0.3 mg/ml
Antisedan : Atipamezole hydrochoride			5 mg/ml