腎臓虚血再灌流障害：障害のマウスモデルおよび再生

要約

The mouse model of renal ischaemia reperfusion injury described here comprises of a right nephrectomy that provides control tissue and clamping of the left renal pedicle to induce ischaemia that results in acute kidney injury. This model uses a midline laparotomy approach with all steps performed via one incision.

要約

腎臓虚血再灌流障害（IRI）は、患者の急性腎臓損傷（AKI）の一般的な原因であり、腎臓の血流の閉塞は、腎移植の際に避けられない。正確かつ再現性腎IRIを再現実験モデルは、AKIの病態生理及び新規治療薬の開発の分析において重要である。ここで紹介するには、再現可能な、AKI、その結果、腎IRIのマウスモデルである。これは、左腎臓の虚血を誘発する左腎椎弓のコントロール組織とクランプを提供して右腎摘出術の両方を許可する1切開で手術のための正中開腹アプローチによって達成される。虚血期間中のクランプ位置及び体温を注意深く監視することによって、このモデルは、再現性の機能的および構造的損傷を達成する。マウスは、血清または血漿クレアチニン値の上昇だけでなくて、腎機能の喪失を実証手術後24時間を犠牲に構造明らか急性尿細管壊死とtural腎臓損傷。腎機能は改善し、急性組織損傷は、このモデルは、腎臓再生を研究するために使用することができるように、腎臓IRI次の7日間の過程の間に解決されます。腎臓IRIのこのモデルは、分子·細胞AKIの病態だけでなく、その後の腎再生の分析を研究するために利用されている。

概要

虚血再灌流障害（IRI）は、腎臓、心臓や脳を含む複数臓器傷害の一般的なモードです。腎臓IRIが患者の急性腎障害（AKI）につながる可能性や特定の治療法はありません。 IRIの結果、AKIは自然免疫と獲得免疫応答の¹の両方を含む複雑な病因を持っています。腎臓IRIの実験モデルは、AKIの病因と同様に、その後の日にわたって続いて起こるその後の腎再生に関与する重要な細胞やメディエーターを解剖する可能性を提供しています。さらに、疾患プロセスの際に新規な治療剤の効果を評価することができる。

腎臓IRIの実験モデルの全体的な目標は、ここで説明し、急性機能的および構造的腎障害を誘発することがある。一部の研究者は、両側IRI ²の誘導を伴うモデルを利用している。両側腎IRIモデルは、使い一方的RENですが、らIRIモデルは、手術時に実施されて右腎摘出術の利点を有する。右腎摘出組織は、そのいずれか又は誘導する遺伝子またはタンパク質の発現を抑制する前処理工程を含む研究における貴重な対照組織として機能する。例えば、我々はヘムアルギン酸（HA）24時間の腎臓IRI ³前の注射の前処理効果を評価するためにこのモデルを使用している。 IRIの前にHAによって細胞保護酵素ヘムオキシゲナーゼ-1（HO-1）の成功した誘導は、右腎摘出コントロール組織⁴で確認された。 HAは、HO-1依存性機構を介して部分的には、老齢マウスでは腎臓IRIを減少させた。同様に、我々は、腎臓IRI ⁵におけるマクロファージの役割を調べるためにマクロファージ枯渇研究においてモデルを使用している。右腎摘出組織の免疫組織化学的分析は、アブレーションの方法の有効性を確認するために使用することができる。右腎摘出組織は、そのための確認の両方に使用し、私のレベルを定量化することができますnductionまたは個々の実験動物における目的の分子の阻害。このモデルは、前の腎臓IRIの誘導遺伝子またはタンパク質などの発現を調節する薬物または他の化合物を使用している研究者にとって興味深いであろう。

他の研究は、腎臓へのアクセスにフランク切開を使用している。ここで説明するモデルは、右腎摘出術の両方を実行し、左腎臓の虚血再灌流を誘導するために、単一の正中腹部の手術を使用しています。この外科的アプローチは、腎茎クランプに続く腎茎や色の変更など、術野の優れた可視化を提供します。モデル^4-6と当方の経験では、マウスはすぐにほぼ100％の生存率は手術から回復ことを示しています。

最後に、7日間にわたってモデルの動力学的分析は、このモデルは腎機能および管状の整合性の両方の回復を呈することを示す、と重要な管状の細胞増殖。

プロトコル

注：動物実験は動物（科学的処置）法1986によって課せられたガイドラインおよび規制に準拠して実施された手続きは、滅菌（オートクレーブ処理）手術器具や消耗品を使用して行われた。最適な年齢た状態で、15週 - 腎臓IRIのマウスモデルがここに提示されている間は、8週齢の雄、それが再現可能通常は7歳までの男女どちらかのマウス系統のさまざまな実行することができますBALB / cマウスで実施した8週間。代表的な結果の項に示されたデータは、BALB / cマウスおよびFVBマウスの両方から得た。温めた生理食塩水の適用は、湿った腸および手術領域を保持するために使用されるが、流体の過剰なアプリケーションが重要である血清または血漿クレアチニン濃度の低下アーチファクトを引き起こし得るように注意深く監視され、最小に保たれるべきである実験読み出し。

1。動物の準備および開腹

1. 腹腔内に塩酸ケタミン（70 mg / kg）を、およびメデトミジン塩酸塩（1 mg / kg）をして、マウスを麻酔し、反射神経などつま先のピンチの損失によって、麻酔の深さを確認してください。得られた麻酔薬面の持続時間は4時間である。これは、全体の外科的処置を行うのに十分であり、まだ補足麻酔を必要としない。
2. 、切開領域を取り巻く髪を削除するエリアは抜け毛がないことを確認し、希薄クロルヘキシジン液を用いて腹部の皮膚を消毒。
3. 仰臥位で加熱された手術用パッドの上にマウスを置き、低粘着性粘着テープを使用してパッドに上下の手足を固定します。上肢が肺の圧縮を防ぐために、通常の位置に維持されていることを確認します。手順では熱傷のためのマウスを監視します。可能であればそれは非電気熱源を使用することをお勧めします。
4. 鎮痛剤ブプレノルフィン塩酸塩（0.06 mg / kgの）を管理皮下および角膜乾燥を防ぐために、目に目の潤滑剤を塗布。鎮痛薬は、手術後の回復を助けるために手術前に投与される。
5. 組織分離ハサミやメスの刃を使用して、正中開腹切開を行い、ぶっきらぼう腹膜から肌を分離する。これは、皮膚と腹膜の創傷閉鎖の際に、別々に縫合することができます。無血管白線の切開を腹腔へのアクセスを与えることになる。
6. 手術領域の明確なビューを作成するには、リトラクターを挿入し、マウスを羽織る。

2。尿管本部、右腎摘出

1. 静かに右の腎臓と尿管を露出させ、生理食塩水で湿らせたオートクレーブした滅菌綿棒を使用して腹腔の左側に向かって腸を押してください。乾燥を防ぐために湿らせたドレープと腸をカバーしています。
2. 角度のついたピンセットで右尿管を持ち上げます。 6/0 SILを使用して二度、右尿管を結紮K-編組縫合。長期的な実験のために、すべての腹部手術のための吸収性縫合糸を使用しています。
3. 縫合糸の間に尿管を分割。膀胱尿管接合部が膀胱から腹膜に漏れる尿を防ぐ必要がありながら、尿管は、長期実験中、手術後の漏洩に対する保護手段として連結する。
4. 右腎摘出術を行う際に簡単にアクセスを許可するように、ゆっくりと湿らせた綿棒を使用して、右の肝臓を押して右腎動脈と静脈を露出させ湿らせたガーゼを使用して所定の位置に保持する。
5. ぶっきらぼうな限り右腎動脈と静脈、右腎の内側面に沿って結合組織と脂肪を解剖。
6. 慎重に血管の下に角度のついた鉗子をスライドさせることで腎動脈と静脈の下にチャネルを作成します。ヒントを閉じて静かにチャネルの形成を容易にするために開いたヒントを削除して下に鉗子を導く。
7. 鉗子の先端がちょうど腎動脈と静脈上記の結合組織を通して見えるまで、ステップ2.6を繰り返します。一回目に見える優しく優しく結合組織を破壊するために角度のついた鉗子の別のセットの先端に対する鉗子の先端をこする。
8. 腎動脈と静脈を明確にアクセスできると、彼らは今閉塞することができます。慎重にヒントを閉じた状態で、腎動脈と静脈の下に角度のついた鉗子をスライドさせます。一度場所で鉗子の先端を開き、先端間の止血クリップアプリケータを導き、しっかりと腎動脈と腎臓に近い静脈に止血クリップを適用します。あるいは腎動脈と静脈は、6/0シルク編組縫合糸を用いて結紮することができる。
9. 今残っている接着性の結合組織を除去することができ、腎臓の近くに閉塞した腎動脈と静脈を分割します。
10. 肝臓を保持し、綿棒で腸を置き換えるために使用される任意のガーゼを取り除きます。

3。左の腎臓の虚血および再灌流

1. そっと左腎臓と尿管を露出し、湿らせたドレープでカバーするために綿棒と腹腔の右側に向かって腸を押してください。必要であれば、膵臓はより容易なアクセスを可能にするために湿らせたガーゼで偏向させることができる。
2. 優しく結合組織が前方および後方左腎動脈と静脈をした後、尿管本部、右腎摘出ステップ2.4​​と同様の方法で船の下にチャンネルを作成破る鈍い切​​開を使用しています。
3. 腎動脈と静脈にマイクロserrafineクリップを適用することで、左腎臓の虚血を誘発する。成功した虚血は、視覚的に腎臓が徐々に均一な暗色化することによって確認することができる。左腎動脈および静脈に加えて、血管が時折腎臓を供給することができる。存在する場合、これらの追加の血管にも成功するために、マイクロserrafineクリップを使用して閉塞する必要があります全体腎臓の虚血を誘発する。
4. 腸を交換して、慎重に腸の虚血の妥協の結果につながる可能性が急激ねじれがないことを確認してください。一時的に、単一の縫合糸で腹膜を閉じます。
5. 虚血誘導の後にはすぐに虚血に必要な期間を37℃で体温を維持する制御装置に接続され、直腸サーミスタ恒温ブランケット上にマウスを置きます。腎障害や腎不全の所望の程度を誘導するために必要な虚血の適切な長さを定義するには、滴定を各菌株と術者のために実行することをお勧めします。
6. まもなく虚血期間の終了前に腹膜を再度開き、慎重にクランプへのアクセスを可能にし、腎臓を表示するには、腸を配置。開創器の挿入は、ビデオに示すように、必要ではなく、単に表象的な目的のために実施した。
7. CLを削除虚血期間の後アンペアは締結しています。すぐに除去した後に、腎臓は急速に成功した再灌流を示す健全な濃いピンクに濃い栗色から色が変わります。
8. 再び腸前6/0編組絹縫合糸を使用したブランケットステッチで腹膜を閉じるにねじれていないことを確認してください。その後、金属の皮膚クリップを用いて皮膚を閉じます。
9. 術後感染のリスクを最小限に抑えるために、このような外科領域へのヨウ素/アルコール溶液などの消毒を適用します。

4。術後の回復とケア

1. アチパメゾール塩酸塩（2 mg / kg）の皮下投与と部分的に逆麻酔し、1mlの皮下注射で流体を投与手術後の脱水を防ぐために生理食塩水を加温した。
2. 彼らは意識を回復するまで、慎重にマウスを監視、警告が表示され、自分自身を正しくすることができます。
3. 29℃、LOCに保ったマウスは、加熱ボックスに回復することができ24時間、静かな環境でated。マウスは、麻酔に温度調節する能力の障害を持っているし、それは彼らが効果的な復旧を可能にするために高温で収納されていることが非常に重要です。湿らせた食品はまた、流体と栄養摂取を促進するために提供することができる。
4. 長期的な回収実験は、継続的な鎮痛薬を提供し、手術後7日間、皮膚のクリップを削除するため。

5。機能的および構造的腎損傷と再生の評価

1. 血液は、実験終了時に安楽死の時点で実験中または心臓穿刺により尾静脈から採取してもよい。先に説明したように⁷生化学遠心分析に基づく方法クレアチナーゼ、および血中尿素窒素（BUN）を用いて、血清クレアチニンによって腎機能を測定する。正常な健康なマウスの腎機能がこのような腎不全のモデルを確立する前に決定する必要があることdependi著しく変化することができるヤッフェ反応およびクレアチニンを測定するためのクレアチナーゼ基づく方法例えば使用した分析方法のNGは異なる結果を与える。
2. ヘマトキシリン​​およびエオシン（H＆E）または過ヨウ素酸シッフ（PAS）で染色したパラフィン包埋腎臓組織切片上の組織病理で腎の構造を調べます。各マウスについて外部髄質（OSOM）の外側のストライプ内200Xの倍率で10枚の画像 - 5の間にキャプチャします。この領域は、このモデルで負傷したように、それが低酸素症に非常に脆弱であるため、OSOMにおける損傷のレベルを評価する。
3. 急性尿細管壊死（ATN）または再生を測定するために、以下に詳述2スコアリングシステムのいずれかを使用します。これらのシステムで使用される分類の代表的な形態は、 図1に示されている。
4. ATNを獲得する単純なバイナリシステムを使用してください。細胞の完全性と形態マークを基に、生（無傷の細胞形態学）または壊死（妥協細胞統合のいずれかとして細管を数えるgrity、異常な細胞形態や細胞の喪失）。
   1. 細管の合計数（壊死性細管の％）の割合として、壊死細管の数を表現しています。
5. 細胞の完全性、形態および核数に基づいて、別のシステムを使用して再生を分類します。マークとカウント細管など、健康的な壊死性、負傷したか、次の手順に記載されている基準に従って回収することを含む。
   1. （ステップ5.4で詳述）ATNスコアリングシステムと同様に危険にさらさ細胞の完全性を示す尿細管ながら健康な無傷の正常細胞とマーク細管は、異常な細胞形態や明白な細胞の損失は、壊死したとして採点されるべきである。
   2. 負傷したように、彼らはいくつかの核を含む薄くなった細胞質を持っている場合細管を分類する。これとは対照的に、回復し、より正常な細胞形態を有するより多くの核を含む細管を指定します。
   3. 総細管数の割合として各細管分類を表現しています。

結果

細管障害および回復は、腎臓IRI後の組織切片のH＆E又はPAS染色により評価することができる。 OSOM内にある細管は、細胞の形態、整合性と核の数（ 図1）によると、健康的な怪我、壊死または回復に分類される。このモデルでは機能的および構造的損傷は虚血の持続期間に依存している。虚血の持続時間が（ 図2）の 2分ずつ増加されるように、血漿クレアチニンおよ?...

ディスカッション

腎臓IRIが使用可能な特定の治療とAKIの重要な原因である。腎臓IRIの実験的研究は、マクロファージ、樹状細胞、リンパ球、制御性T細胞だけでなく、他の細胞および急性損傷と位相^5,8癒しの両方の誘導におけるメディエーターの役割を示す以前の研究で非常に有益でした^{- 16。}また、実験的腎IRIは、様々な治療薬^4,17-19の効果を評価するために使用されている。

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tissue scissors	Fine Science Tools	14072 - 10
Micro-Adson forceps (Rat toothed)	Fine Science Tools	11019 - 12
S&T JFA-5bTC Forceps - SuperGrip Angled	Fine Science Tools	00649-11
Colibri retractor	Fine Science Tools	17000 - 04
Micro clip applicator	Fine Science Tools	18057-14
Micro serrafines	Fine Science Tools	18055-04
Olsen-Hegar needle holder	Fine Science Tools	12002 - 12
Hemoclip Plus Ligating Clips Small	Weck	533837
Autoclip Wound Clip System, 9mm	Harvard Apparatus	PY2 52-3748
Silk Black Braided Suture, Size 6-0	Harvard Apparatus	723288
Standard Heat Matt
Homeothermic Blanket & Control Unit	Harvard Apparatus
Lacri-Lube	Allergan
Vetasept Chlorhexidine	AnimalCare
Vetalar : Ketamine hydrochloride			100 mg/ml solution
Domitor : medetomidine hydrochloride			1 mg/ml
Vetergesic : Buprenorphine hydrochloride			0.3 mg/ml
Antisedan : Atipamezole hydrochoride			5 mg/ml