Renal İskemi Reperfüzyon Hasarı: Yaralanma Fare Modeli ve Rejenerasyon

Özet

The mouse model of renal ischaemia reperfusion injury described here comprises of a right nephrectomy that provides control tissue and clamping of the left renal pedicle to induce ischaemia that results in acute kidney injury. This model uses a midline laparotomy approach with all steps performed via one incision.

Özet

Renal iskemi reperfüzyon hasarı (IRI) hastalarda ve böbrek kan akımının tıkanması akut böbrek hasarı (ABH) ortak bir nedenidir böbrek nakli sırasında kaçınılmazdır. , Doğru ve tekrarlanabilir renal IRI özetlemek deneysel modeller AKI patofizyolojisi ve yeni terapötik maddelerin geliştirilmesi diseksiyon çok önemlidir. Tekrarlanabilir AKI sonuçlanan böbrek IRI bir fare modeli burada sundu. Bu bir kesi kontrol dokusu ve sol böbrek iskemi ikna etmek için sol renal pedikül kenetlenmesini sağlayan bir sağ nefrektomi hem izin ile ameliyat için bir orta hat laparotomi yaklaşımı ile elde edilir. Iskemi döneminde kelepçe pozisyonu ve vücut sıcaklığının dikkatli izleyerek bu modeli tekrarlanabilir işlevsel ve yapısal hasarı ulaşır. Fareler, serum veya plazma kreatinin seviyesinin yüksekliği hem de böbrek fonksiyon kaybı gösteren ameliyattan sonra 24 saat kurban yapılarbelirgin akut tübüler nekroz ile sal böbrek hasarı. Böbrek fonksiyonu artırır ve akut doku hasarı bu model böbrek rejenerasyon çalışması için kullanılabilir şekilde böbrek IRI izleyen 7 gün süresince giderir. Renal IRI Bu model, moleküler ve hücresel AKI patofizyolojisi hem de daha sonraki böbrek rejenerasyon analiz incelemek için kullanılmıştır.

Giriş

Iskemi reperfüzyon hasarı (IRI) böbrek, kalp ve beyin dahil olmak üzere birden organları için yaralanma yaygın biçimidir. Böbrek IRI hastalarda akut böbrek hasarı (ABH) yol açabilir ve hiçbir spesifik tedavi mevcuttur. IRI sonucu AKI doğal ve adaptif immün yanıtı ¹ hem de içeren karmaşık bir patogenezi. Böbrek IRI bir deneysel model anahtar hücreleri ve AKI patogenezinde hem de sonraki günlerde gelişir sonraki böbrek rejenerasyon yer arabulucular incelemek için potansiyel sunmaktadır. Bundan başka hastalık süreçleri üzerine yeni terapötik maddelerin etkisi değerlendirilebilir.

Böbrek IRI deneysel modelinin genel amacı burada tarif hem akut fonksiyonel ve yapısal böbrek hasara yol etmektir. Bazı araştırmacılar bilateral IRI ^2'nin uyarılmasını içeren bir modeli kullanmışlardır. Bilateral renal IRI modeli, kullanım tek taraflı ren olmasına rağmenal IRI modeli cerrahi anda yapılmakta olan bir sağ nefrektomi avantajına sahiptir. Sağ nefrektomi doku ya da yol açma ya da bir gen ya da proteinin ekspresyonunu bastıran bir ön-muamele aşamasını içeren çalışmalarda olduğu gibi değerli kontrol doku vermektedir. Örneğin, biz 24 saat böbrek IRI ³ önce heme arjinatın önşartlama etkilerini (HA) enjeksiyonu değerlendirmek için bu modeli kullandık. IRI önce HA ile sitokoruyucu enzim heme oksijenaz-1-(HO-1) başarılı bir şekilde indüksiyon doğru nefrektomi kontrol dokusu ⁴ doğrulanmıştır. HA bir HO-1 bağımlı mekanizma yoluyla kısmen yaşlı farelerde böbrek IRI azalttı. Benzer şekilde, böbrek IRI ⁵ makrofajların rolünü incelemek için makrofaj tükenmesi çalışmalarda modelini kullandık. Sağ nefrektomi dokusunun immünohistokimyasal analizi, ablasyon metodoloji etkinliğini teyit etmek için kullanılabilir. Sağ nefrektomi doku hem de bu nedenle onaylamak için kullanılan ve seviyesini ölçmek edilebilirnduction ya da her bir deneysel hayvan içinde, ilgi konusu moleküle inhibisyonu. Bu model önce renal IRI indüklenmesine genlerin veya proteinlerin vs ekspresyonunu modüle etmek için ilaçlar veya diğer bileşikler kullanan araştırmacılar, ilgi çekici olacaktır.

Diğer çalışmalar böbrekleri erişmek için yan kesiler kullandık. Burada açıklanan model sağ nefrektomi hem gerçekleştirmek ve sol böbrek iskemi reperfüzyon ikna etmek için tek bir orta hat karın ameliyatı kullanır. Bu cerrahi yaklaşım böbrek pedikül sıkılmasına takip böbrek pediküller ve renk değişiklikleri de dahil olmak üzere, cerrahi alanında mükemmel görselleştirme sağlar. Modeli ^4-6 ile yayınlanan deneyim fareler hızlı bir şekilde neredeyse% 100 hayatta kalma oranı ile cerrahi kurtarmak olduğunu gösterir.

Son olarak, 7 günlük bir süre boyunca, modelin kinetik analizi, bu model, renal fonksiyon ve boru bütünlüğü hem de geri yükleme sergiler gösterir, ileönemli ölçüde boru şeklinde bir hücre çoğalması.

Protokol

NOT:. Hayvan deneyleri Hayvanlar (Scientific Procedures) Act 1986 dayattığı kurallara ve yönetmeliklere uygun olarak yapıldı Prosedürleri steril (otoklav) cerrahi aletler ve sarf malzemeleri kullanılarak yapılmıştır. Uygun yaş olmak üzere, 15 hafta - renal IRI murin modeli Burada yer iken, bir 8-haftalık, erkek yeniden üretilebilir, tipik olarak 7 arasında değişen bir cinsiyet ya murin soylarının çeşitli gerçekleştirilebilir Balb / c fare üzerinde gerçekleştirilmiştir 8 hafta. Temsilcisi sonuç bölümünde sunulan veriler, Balb / c ve FVB farelerinin hem de elde edilmiştir. Isıtılmış salin uygulaması nemli bağırsak ve cerrahi alanda tutmak için kullanılır ama dikkatle izlenir ve sıvıların aşırı uygulama olarak, bir minimumda tutulması gereken önemli olan serum veya plazma kreatinin, düşürücü bir suni yol açabilir deneysel okuma.

1.. Hayvan Hazırlama ve Laparotomi

1. Intraperitonal ketamin hidroklorür (70 mg / kg) ve medetomidin hidroklorür (1 mg / kg) ile anestezi fare ve refleksler, örneğin ayak tutam kaybı ile anestezi derinliğini. Elde edilen anestezi düzleminin süresi 4 saattir. Bu tüm cerrahi prosedürü gerçekleştirmek için yeterli olduğunu ve herhangi bir ek anestezi gereklidir.
2. , Kesi alanı çevreleyen saç kaldırmak alan gevşek saç serbest olmasını sağlamak, ve bir seyreltilmiş klorheksidin solüsyonu kullanarak karın cildi dezenfekte.
3. Sırtüstü pozisyonda ısıtılmış bir cerrahi pad üzerinde fare yerleştirin ve düşük-tack yapışkan bant kullanarak pad, üst ve alt ekstremite düzeltmek. Üst ekstremiteler akciğer sıkıştırma önlemek için normal bir pozisyonda tutulmasını sağlamak. Prosedür boyunca termal yanıklar için fareyi izlemek. Mümkünse olmayan bir elektrikli ısı kaynağı kullanılması önerilir.
4. Analjezik buprenorfin hidroklorür yönetme (0.06 mg / kg)subkutan ve kornea kurumasını önlemek için gözler için göz yağ uygulanır. Analjezikler, ameliyat sonrası iyileşme yardımcı olmak amacıyla önceden işlevsel tatbik edilmektedir.
5. Doku makas ayrılması veya bir neşter bıçak kullanarak bir orta hat laparotomi kesi yapmak ve açık açık periton cilt ayırmak. Bu cilt ve periton yara kapanması sırasında ayrı olarak dikilir sağlar. Avasküler linea alba bir kesi periton boşluğuna erişim sağlayarak yapılır.
6. Cerrahi alanda net bir görünüm oluşturmak için Retraktörün yerleştirin ve fare asmak.

2.. Üreter Bölümü ve Sağ nefrektomi

1. Yavaşça sağ böbrek ve üreter maruz serum ile nemlendirilmiş otoklava sterilize pamuklu çubuklarla karın boşluğunun sol tarafına doğru bağırsakları itin. Kurumayı önlemek için nemli örtüler ile bağırsakları örtün.
2. Açılı forseps ile sağ üreter kaldırın. Iki kez, 6/0 sil kullanarak sağ üreter ligatek-örgülü sütür. Uzun süreli deneyler için, tüm abdominal ameliyatlar için emilebilir dikişlerle kullanın.
3. Sütür arasındaki üreter bölün. Vezikoüretral kavşak mesane periton içine sızmasını idrar önlemek gerekir iken üreter uzun süreli deneyler sırasında ameliyat sonrası herhangi bir sızıntıya karşı bir koruma olarak bağlandı.
4. Sağ nefrektomi yapılırken kolay erişim sağlamak için, hafifçe nemlendirilmiş bir pamuklu çubuk kullanarak karaciğer yukarı ve sağa doğru itin ve sağ renal arter ve ven maruz nemlendirilmiş gazlı bez kullanılarak yerinde tutun.
5. Açık açık kadarıyla sağ renal arter ve ven olarak sağ böbreğin medial boyunca bağ dokusu ve yağ teşrih.
6. Dikkatli kan damarlarının altında açılı forseps kaydırarak renal arter ve ven altında bir kanal oluşturun. Uçları kapalı ve yavaşça kanalın oluşumunu kolaylaştırmak amacıyla, açık uçları ile çıkarın ile alt kılavuz forseps.
7. Forseps ipuçları sadece renal arter ve ven yukarıda bağ dokuları yoluyla görünene kadar adımı 2.6 tekrarlayın. Bir kez görünür hafifçe aşağı bağ dokusu kırmak için açılı forseps başka bir dizi ipuçları karşı forseps ipuçları ovalayın.
8. Renal arter ve ven açıkça erişilebilir ile onlar artık tıkalı olabilir. Dikkatle renal arter altına açılı forseps slayt ve ipuçları kapalı damar. Bir kez yerinde forseps ipuçları açın ve uçları arasındaki hemostatik klip aplikatör rehberlik ve sıkıca renal arter üzerine hemostatik klip uygulamak ve yakın böbrek ven. Alternatif olarak, renal arter ve ven 6/0 örgülü ipek sütür kullanılarak bağlanabilir.
9. Şimdi kalan yapışık bağ dokusu ile kaldırılabilir tıkalı renal arter ve böbrek yakın ven, bölün.
10. Karaciğer tutun ve pamuklu bağırsakları değiştirmek için kullanılan herhangi bir gazlı bez çıkarın.

3. Sol Böbrek iskemi ve reperfüzyon

1. Yavaşça sol böbrek ve üreter maruz ve nemli örtüler ile karşılamak için pamuklu karın boşluğunun sağ tarafına doğru bağırsakları itin. Gerekirse, pankreas daha kolay erişim sağlamak için nemli bir gazlı bez ile saptırılır edilebilir.
2. Yavaşça bağ dokuları sol renal arter ve ven anterior ve posterior kırmak için künt diseksiyon kullanın, ve sonra 2.4 Üreter Bölümü ve Sağ Nefrektominin adım tarif edilene benzer bir şekilde gemilerin altında bir kanal oluşturmak.
3. Renal arter ve ven üzerine bir mikro serrafine klip uygulayarak sol böbrek iskemi Induce. Başarılı iskemi görsel olarak böbrek kademeli bir muntazam koyulaşması ile teyit edilebilir. Sol renal arter ve ven ek olarak kan damarları bazen böbrek kaynağı olabilir. Eğer varsa, bu ek kan damarları da başarıyla amacıyla mikro serrafine klipleri kullanılarak tıkalı gerekirtüm böbrek iskemi neden olur.
4. Bağırsak değiştirin ve dikkatle bağırsak iskemi ödün sonuçlara yol açabilir ani bükülme olmadığından emin olmak. Geçici olarak tek sütür ile periton kapatın.
5. Iskemi indüksiyon sonrasında hemen iskemisi gereken süre boyunca 37 ° C 'de, vücut ısısını muhafaza edecek bir kontrol birimine bağlı bir rektal direnç ile bir eşit sıcaklık battaniyesi üzerine fare. Böbrek hasarı ve böbrek yetmezliğinin istenen derecede uyarılması için gerekli iskemisi uygun uzunluğu tanımlamak için bir titrasyon, her bir suş ve cerrahi operatör için yapılması önerilir.
6. Kısa bir süre iskemik sürenin bitiminden önce periton yeniden açın ve dikkatle kelepçe erişim izin ve böbrek görüntülemek için bağırsakları yerleştirin. Ekartörün yerleştirilmesi, video gösterildiği gibi, gerekli değildir ve sadece sunum amaçlı olarak uygulandı.
7. Cl çıkarıniskemi süre sonra amfi sonucuna varmıştır. Hemen çıkarılmasından sonra böbrek hızla başarılı reperfüzyon gösteren sağlıklı bir koyu pembe bir koyu kestane gelen rengi değişecektir.
8. Yine bağırsak önceki 6/0 örgü ipek sütür kullanılarak bir battaniye dikiş ile peritonunu kapanış bükülmüş değil emin olun. Sonra metalik deri klipleri kullanarak cilt kapatın.
9. , Ameliyat sonrası enfeksiyon riskini en aza indirmek gibi cerrahi bölgeye iyot / alkol çözeltisi gibi bir antiseptik uygulayın.

4. Post-operatif Kurtarma ve Bakım

1. Atipamezol hidroklorür ile kısmen geri anestezi (2 mg / kg) deri altından ve 1 ml lik bir deri altından enjeksiyon ile tatbik sıvıları ameliyattan sonra su kaybını önlemek için tuz ısıtıldı.
2. Onlar bilinç iyileşene kadar dikkatlice fareleri izlemek, uyarı görünür ve kendilerini sağa edebiliyoruz.
3. Isıtılmış bir kutuya kurtarmak için fareler 29 ° C, loc muhafaza izin ver24 saat boyunca, sessiz bir ortamda ated. Fareler nedeniyle anesteziye thermoregulate için zarar görmüş bir yeteneğine sahip olacak ve bu da etkin bir iyileşme sağlamak için yüksek bir sıcaklıkta muhafaza edilir bu nedenle çok önemlidir. Nemlendirilmiş gıda da sıvı ve besin alımını teşvik sağlanabilir.
4. Uzun vadeli kurtarma deneyleri devam eden analjezik sağlamak ve ameliyat sonrasında 7 gün cilt klipleri kaldırmak için.

5.. Fonksiyonel ve Yapısal Böbrek Yaralanma ve Rejenerasyon değerlendirilmesi

1. Kan deney sonunda ötenazi sırasında deneyler sırasında ya da kardiyak ponksiyonu ile kuyruk damarından toplanabilir. Önce ⁷ açıklandığı gibi bir biyokimyasal santrifüj analizörü bir creatinase tabanlı bir yöntem ve kan üre azotu (BUN) kullanılarak, serum kreatinin böbrek fonksiyonunu ölçün. Normal sağlıklı farelerin renal fonksiyonu, bu böbrek yetmezliği modeli oluşturmak önce tespit edilmesi gerekmektedir dependi ölçüde değişebilirJaffe reaksiyonu ve kreatinin ölçümü için creatinase dayalı yöntemler, örneğin kullanılan analiz metodu üzerinde ng farklı sonuçlar verir.
2. Hematoksilen ve Eosin (H & E) veya Periyodik Asit Schiff (PAS) ile boyandı parafin böbrek doku kesitlerinde histopatolojik tarafından böbrek yapısını inceleyelim. Her bir fare için, dış medulla (Osom) dış şerit içinde 200x büyütmede 10 görüntü - 5 arasında yakalar. Bu bölgede bu modelde yaralı gibi hipoksi derece savunmasız olduğundan Osom yaralanma düzeyini değerlendirin.
3. Akut tübüler nekroz (ATN) veya rejenerasyon ölçmek için aşağıda ayrıntılı iki skorlama sistemlerinin birini kullanın. Bu sistemlerde kullanılan sınıflandırmaların Örnek morfolojisi, Şekil 1 'de gösterilmiştir.
4. ATN skoru basit bir ikili sistemi kullanın. Hücresel bütünlük ve morfolojisi işareti temelinde ve canlı (sağlam hücre morfoloji) ya da nekrotik (tehlikeye hücre inte olarak ya tübüller saymakgrity, anormal hücre morfolojisi ve hücre kaybı).
   1. Tübül toplam sayısı (nekrotik tübüller%) bir yüzdesi olarak nekrotik tübül sayısını ifade eder.
5. Hücre bütünlüğü, morfolojisi ve çekirdekler sayısına dayalı bir sistemi kullanılarak rejenerasyon sınıflandırır. Mark ve saymak tübüller gibi, sağlıklı nekrotik, yaralı ya da aşağıdaki adımlarda listelenen kriterlere göre kurtarma.
   1. (Adım 5.4 ayrıntılı) ATN skorlama sistemi olduğu gibi tehlikeye hücre bütünlüğünü gösteren tübüllerine iken sağlıklı olarak bozulmamış, normal hücreler ile işareti tübüller, anormal hücre morfolojisi veya aşikar hücre kaybı nekrotik olarak atılır gerekir.
   2. Yaralı olarak onlar birkaç çekirdek içeren bir inceltilmiş sitoplazmasını varsa tübüllerini sınıflandırır. Bunun aksine, geri kazanılması üzerine daha fazla Normal hücre ile daha fazla çekirdek ihtiva eden tübüller işaret etmektedir.
   3. Tübül toplam sayısının bir yüzdesi olarak, her borucuk sınıflandırma ifade eder.

Sonuçlar

Borulu yaralanma ve kurtarma H & E tarafından değerlendirilecek veya böbrek IRI aşağıdaki doku kesitlerinin PAS boyama olabilir. Osom içinde bulunan Tübüller hücre morfolojisi, bütünlük ve çekirdekler numarası (Şekil 1) göre, sağlıklı yaralı, nekrotik veya kurtarma olarak sınıflandırılır. Bu modelde fonksiyonel ve yapısal hasarı, iskemi süresine bağlıdır. Iskemi süresi (Şekil 2), 2 dakika artışlarla arttırılır plazma kreatinin ve BUN ile değer...

Tartışmalar

Böbrek IRI hiçbir spesifik tedavi ile AKI önemli bir nedenidir. Renal IRI deneysel çalışma makrofajlar, dendritik hücreler, lenfositler, düzenleyici T-hücreleri ve aynı zamanda başka hücreler ve akut yaralanma ve faz ^5,8 iyileşme her iki indüklenmesinde aracılar rolünü gösteren önceki çalışma ile, son derece bilgilendirici olmuştur ^{- 16.} Buna ek olarak, deneysel renal IRI çeşitli terapötik maddelerin ^4,17-19 etkisini değerlendirmek için kullanılmıştır.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tissue scissors	Fine Science Tools	14072 - 10
Micro-Adson forceps (Rat toothed)	Fine Science Tools	11019 - 12
S&T JFA-5bTC Forceps - SuperGrip Angled	Fine Science Tools	00649-11
Colibri retractor	Fine Science Tools	17000 - 04
Micro clip applicator	Fine Science Tools	18057-14
Micro serrafines	Fine Science Tools	18055-04
Olsen-Hegar needle holder	Fine Science Tools	12002 - 12
Hemoclip Plus Ligating Clips Small	Weck	533837
Autoclip Wound Clip System, 9mm	Harvard Apparatus	PY2 52-3748
Silk Black Braided Suture, Size 6-0	Harvard Apparatus	723288
Standard Heat Matt
Homeothermic Blanket & Control Unit	Harvard Apparatus
Lacri-Lube	Allergan
Vetasept Chlorhexidine	AnimalCare
Vetalar : Ketamine hydrochloride			100 mg/ml solution
Domitor : medetomidine hydrochloride			1 mg/ml
Vetergesic : Buprenorphine hydrochloride			0.3 mg/ml
Antisedan : Atipamezole hydrochoride			5 mg/ml