خطوة محددة الفرز ماوس Spermatids بواسطة التدفق الخلوي

Summary

We describe a sorting strategy for mouse spermatids using flow cytometry. Spermatids are sorted into four highly pure populations, including round (spermiogenesis steps 1-9), early elongating (spermiogenesis steps 10-12), late elongating (spermiogenesis steps 13-14) and elongated spermatids (spermiogenesis steps 15-16). DNA staining, size and granulosity are used as selection parameters.

Abstract

تمايز spermatids الفأر هو عملية حاسمة واحدة لإنتاج الأمشاج الذكور وظيفية مع الجينوم سليمة إلى أن تنتقل إلى الجيل التالي. حتى الآن، وقد أعاق الدراسات الجزيئية لهذا التحول الصرفي بسبب عدم وجود طريقة السماح للفصل الكافي لهذه الخطوات الهامة للتمايز النطف للتحليلات لاحقة. المحاولات السابقة في النابضة السليم لهذه الخلايا باستخدام التدفق الخلوي قد يكون صعبا بسبب زيادة غريبة في مضان DNA في spermatids تمر ونين التجديد. وبناء على هذه الملاحظة، ونحن نقدم تفاصيل تدفق بسيط الخلوي المخطط، مما يسمح تنقية استنساخه من أربعة سكان spermatids الماوس ثابتة مع الإيثانول، يمثل كل دولة مختلفة في عملية إعادة عرض النووية. وأكد تخصيب السكان الذين يستخدمون علامات خطوة محددة ومعيارا المورفولوجية. وspermatids النقاء يمكن استخدامها لالجينومية وproteomيحلل جيم.

Introduction

Haploid round spermatids differentiate into spermatozoa by a process called spermiogenesis. This involves many different steps including the acquisition of a flagellum, chromatin and cytoskeleton remodeling, condensation of the nucleus as well as the loss of most of the cytoplasm. These unique cellular events must be finely regulated in order to produce a mature functional gamete with an intact genome suitable for fertilization. Spermiogenesis can hardly be studied in vitro since no reliable cell culture system has so far been able to support progression through the different steps of the process. Moreover, actual in vitro techniques lead to a poor yield^1,2. In vivo, proper transitions through the different steps of spermiogenesis are crucial for the natural functional integrity of the male gamete. Successful purification of spermatids according to their differentiation steps has never been accomplished with a level of enrichment sufficient to allow molecular characterization of spermiogenesis. For instance, purification of key steps of the spermatidal differentiation would be especially useful to study the developing acrosome, formation of the midpiece³, cell junction dynamics⁴, RNA dynamics⁵, chromatin remodeling process^6,7 or genomic stability⁸. Purification of spermatids has been hampered by their progressive morphological transformation, the lack of known stage-specific external biomarkers, and their peculiar shape and size.

Although most male germ cells display a direct relationship between DNA staining and ploidy (DNA content), we noticed that such positive correlation is no longer applicable to spermatids. This stems from our early observation that seminiferous tubule sections show variable intensity of DNA staining throughout the different spermiogenesis steps. Although DNA staining is consistent with their haploid set of chromosomes from spermiogenesis steps 1 to 7 (round spermatids), we observed a sharp increase in fluorescence intensity with DAPI or SYTO 16 around the onset of nuclear reorganization and chromatin remodeling (spermiogenesis step 8) reaching a peak at the onset of nuclear condensation (spermiogenesis steps 11-12). Following condensation of the nucleus, DNA staining intensity decreases until spermiation (spermiogenesis step 16). We surmised that this was likely associated with the formation of their peculiar chromatin structure transition where histones are replaced by protamines. We therefore developed a reliable flow cytometry method that allows the separation of spermatids using the variation of DNA intensity of spermatids as a main selection parameter.

A simple flow cytometry approach is described to separate mouse spermatids with high purity (95-100%) based on their apparent DNA content (SYTO16 staining), size and granulosity. Spermatids are separated into four populations; spermiogenesis steps 1-9, 10-12, 13-14 and 15-16. Purified spermatids are suitable for genetic/genomic analysis, as well as proteomic applications as described in a recent publication from our group⁹.

Protocol

وكانت رعاية الحيوان وفقا للجنة رعاية الحيوان واستخدام جامعة شيربروك.

1. أنبوب إعداد

1. قبل يوم واحد فرز الخلايا، إضافة 1-2 مل من الحرارة المعطل مصل بقري جنيني (FBS) إلى 5 مل من مادة البولي بروبيلين أنابيب أسفل الجولة، وإلى 15 مل و 50 مل أنابيب البولي بروبلين المخروطية.
   خطوة حاسمة: تأكد من أن كل أنبوب المستخدمة في البروتوكول هو المغلفة.
   ملاحظة: FBS طلاء يمنع الخلايا الجرثومية من الالتصاق على جدران الأنبوب.
2. مزيج ببطء O / N التي كتبها قلب في 4 ° C إلى معطف الأنابيب موحد باستخدام المدورة.
3. في اليوم التالي، وإزالة FBS من الأنابيب المغلفة من قبل الصب.
   1. * خطوة حاسمة: تأكد من أن 5 مل من مادة البولي بروبيلين أنابيب أسفل جولة و15 و 50 مل أنابيب تستخدم لإعداد الخلية (بروتوكول الخطوات 2،1-2،11) يتم تفريغ تماما من FBS لمنع تأجيج (أي انحراف غير دقيق من تيارات الجانب). استخدام الماصة P200 لإزالة FBS.
      ملاحظة: FBS المتبقية في أنابيب قبل الفرز قد يؤدي إلى فقدان الخلايا أو تلوث أنابيب الأخرى المستخدمة خلال الخلية الفرز،
   2. ترك حجم صغيرة متبقية من FBS (حوالي 100-200 ميكرولتر) في الجولة البولي بروبلين 5 مل أنابيب أسفل المستخدمة لجمع خلايا النقاء.

2. خلية التحضير

1. التضحية الماوس واحد من الذكور تحت التخدير باستخدام _O 2 / الأيزوفلورين (الحث على 5٪ ثم الحفاظ على 2٪)، يليه CO ₂ الاختناق.
2. المكوس وdecapsulate كلا الخصيتين واللحم المفروم مع مقص صغير في 500 ميكرولتر من فرز العازلة في أنبوب 1.5 مل.
3. الخلايا الجرثومية دافق من الأنابيب المنوية التي كتبها طيف pipetting صعودا وهبوطا في أنبوب 1.5 مل، أولا مع اقتطاع 100-1،000 ميكرولتر الحافة، ثم مع سليمة طرف 100-1،000 ميكرولتر.
4. إزالة الأنقاض وكتل خطوة الترشيح واحد باستخدام مصفاة الخلية 40 ميكرومتر وجمع الرشاحة إلى 50 مل السابق أنبوب مخروطيالمغلفة iously مع FBS في الخطوة 1.
5. غسل الفلتر مرة مع فرز عازلة تصل إلى الحجم الكلي لل3 مل ونقل الترشيح إلى 15 مل أنبوب مخروطي المغلفة سابقا في الخطوة 1.
6. إضافة 16 ميكرولتر من 50 ملي درجة الحموضة 8 في الملليمتر الواحد من تعليق خلية (48 ميكرولتر لمدة 3 مل) EDTA وذلك للحصول على التركيز النهائي من 0.8 ملي EDTA.
7. لإصلاح الخلايا الجرثومية، إضافة ببطء 3 مجلدات من الجليد الباردة الإيثانول بنسبة 100٪ باستخدام الماصة 10 مل مع الإثارة لطيف (الدوامة بسرعة منخفضة)، والتي سوف تنتج تعليق حليبي.
   خطوة حاسمة: إضافة ببطء الايثانول أمر حاسم ومهم للحفاظ على سلامة إعداد الخلية. لاحظنا أن إضافة السريع من الايثانول تسبب تحلل الخلايا مما أدى إلى انخفاض كبير في فرز الكفاءة. لخلية تعليق 3 مل، وينبغي أن يضاف 9 مل من الايثانول في حوالي 1 دقيقة.
8. احتضان الخلايا على الجليد لمدة 15 دقيقة مع خلط في بعض الأحيان عن طريق الانقلاب.
9. تعليق خلية الطرد المركزي في 800 x ج لمدة 5 دقائق وإزالة واضحةطاف.
10. بلطف resuspend الخلايا الجرثومية الثابتة في 2 مل من فرز العازلة.
11. إضافة 4 ميكرولتر من SYTO16 DNA صبغ (حل 1 ملم في DMSO)، واحتضان لمدة 30 دقيقة على الأقل (محمية من الضوء).
    ملاحظة: يتم الحصول على أفضل النتائج فرز باستخدام SYTO16 لأنها صبغة DNA قابلة للاختراق الذي يسهل إدراجها في نوى المضغوط للغاية من spermatids.

فارز 3. خلية محدد حتى

يستخدم 20 معلمة BDFACSAria III فارز الخلية وهنا 4-الليزر (أحمر 405 نانومتر - البنفسجي، 488 نانومتر - الأزرق، 561 نانومتر - - الأصفر والأخضر، 633 نانومتر): ملاحظة. يتم استخدام BD FACSDiva 6.1.3 برنامج لتصور وتحليل البيانات. قد تختلف إعدادات اعتمادا على نوع فارز المستخدمة.

1. تعقيم فارز FACS عن طريق تشغيل 70٪ من الإيثانول كسائل غمد أثناء إجراء fluidics اغلاق (القائمة "عداد الكريات" في البرنامج) قبل الفرز. حدد "عداد الكريات" في شريط الأدوات من البرنامج واختيار "ش فلويديكutdown ". اتبع الخطوات من العمليات المذكورة.
2. إعداد وتصفية 1X PBS مع مرشح 0.22 ميكرون وذلك للقضاء على أي بلورات والملوثات. ملء خزان غمد إلى خط اللحام العلوي في داخل الخزان.
3. بدء تشغيل البرنامج وتسجيل الدخول. بدء فارز FACS في عملية الاحماء الليزر لمدة 30 دقيقة على الأقل قبل الفرز. تشغيل اثنين عمليات بدء التشغيل الموائعية لطرد الإيثانول من fluidics. حدد "عداد الكريات" في شريط الأدوات من البرنامج واختر "بدء التشغيل فلويديك". اتبع الخطوات من العمليات المذكورة.
   ملاحظة: هذا يعيد fluidics مع الطبيعي السائل غمد (1X PBS).
4. تنظيف كتلة الفرز واللوحات انحراف بالماء المقطر وتجفيفها جيدا. يصوتن فوهة 100 ميكرومتر وضعت في أنبوب من الماء المقطر لمدة 2 دقيقة في حمام صوتنة. مسح فوهة بدقة.
5. أدخل فوهة 100 ميكرومتر في خلية تدفق وتحويل قفل فوهة رافعة عقارب الساعة إلى 12موقف ساعة. ضبط ضغط غمد إلى 20 رطل.
6. بدوره على تيار وضبط السعة للحصول على القيم المستهدفة للتردد (حوالي 30)، قطرة 1 (حوالي 150) وجاب (حوالي 12) وإلى تأسيس نمط قطرة breakoff مستقر (قطرات قليل من الأقمار الصناعية). إيقاف التوهين.
7. تأكد من أن تيار مستقيم ويضرب وسط الشافطة النفايات عن طريق تغيير زاوية من كتلة النوع. ملاحظة: تم اختبار فوهة 130 ميكرومتر في 10 رطل أيضا وتوجد فروق واضحة.
8. تعيين تأخير الليزر ل0 ل-77.39 الأزرق، للأحمر، 37.33 لالبنفسجي و-39.85 ليزر الأصفر والأخضر.
9. المناطق المحددة لرفع 1.14 ل1.0 الأزرق، للأحمر، 0.75 لالبنفسجي و0.96 لأشعة الليزر الأصفر والأخضر.
10. باستخدام ترتيب اختبار (في "الجانب ستريم" نافذة البرنامج)، تأكد من أن تيارات الجانب لا تثيران. في "الجانب ستريم" نافذة، وضبط المتزلجون الجهد من كل تيار الجانب بحيث تصل إلى middl(ه) من أنبوب جمع اختبار. إذا كان تيار الوسط غير محكم، وضبط ^الثاني 2، 3 ^{الثالثة،} وإعدادات قطرة ^ال 4 لكبح تيار الوسط.
11. بدء الإعداد الكريات وتتبع (CS & T) التطبيق في البرنامج ("عداد الكريات" القائمة).
12. استخدام الإعداد وتتبع حبات الكريات في 1 قطرة في 350 ميكرولتر لأتمتة توصيف وتتبع أداء الكريات باستخدام تعليمات الشركة الصانعة.
13. إنهاء التطبيق CS & T. تطبيق الإعداد CS & T، تأكد من المعلمات تيار لا تزال تسمح نمط قطرة breakoff مستقر، وبدوره على زر الحلو بقعة كما هو موضح في تعليمات الشركة الصانعة (في "نافذة Breakoff").
14. تعظيم قيمة قطرة تأخير باستخدام الخرز فلوري (انظر الجدول المواد).
    1. تثبيت أنابيب جمع في حامل. فتح باب كتلة النوع. في "الجانب ستريم" نافذة، بدوره على الجهد ثم حدد "اختبار نوع "وانقر فوق الزر المضخة درج لفتح درج والحصول على أنابيب جمع.
    2. تحسين تيارات جانب ذلك يذهبون إلى وسط الأنبوب. ضبط القيم والمتزلجون حسب الحاجة.
    3. إغلاق كتلة الباب فرزها والتأكد من ضبط الطلب ميكرومتر للحصول على ألمع بقعة حبة في المركز. درج النفايات غير منتقى، اختبار الفرز والجهد. إزالة أنابيب جمع.
    4. تحسين تأخير هبوط وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
       1. لفترة وجيزة، ويهز حبة قارورة بقوة وتمييع 1 قطرة من الخرز في 0.5 مل من برنامج تلفزيوني.
       2. باستخدام تعليمات الصانعين، تعيين التأخير قطرة باستخدام القالب تجربة قطرة تأخير المتاحة في البرنامج. بدلا من ذلك، استخدم ميزة السيارات قطرة تأخير لضبط تأخير الهبوط.
       3. تحميل أنبوب من الخرز الفلورسنت وضبط معدل تدفق حتى معدل عتبة هو ~ 3000 إلى 4000 أحداث / ثانية. تعيين دقة الفرز إلى "الأولية" ونهائيلاي ل"تهذيب" في إطار "تخطيط ترتيب". حدد مرشح بصري وفرز الخرز. ضبط قطرة تأخير حتى ~ يتم فرز 100٪ إلى اليسار.
          ملاحظة: هذه الخطوة الحاسمة للتأكد من أن الخلايا التي تهم النوع الى تيار الجانب. يتم استخدام الخرز ومرشح بصري لتحقيق ما يقرب من 100٪ قطرة الانحراف.
15. وضع FSC 1.5 ND (الكثافة المحايدة) مرشح في الطرف الأيسر من كتلة كشف FSC. تعيين ملحق نافذة إلى 2.00 ميكرو ثانية والتحجيم FSC منطقة إلى 1.00 (في "ليزر" في علامة التبويب "عداد الكريات" نافذة).
16. قبل تحميل أنبوب عينة، ضع خط مرشح عينة من 50 ميكرون في نهاية السطر عينة لتجنب تراكمها. للقيام بذلك، حدد "تغيير نموذج تصفية" في القائمة "عداد الكريات".
17. اختبار تكوين السائل عينة لتحقيق فصل جيد من دون اثارة بين تيار الجانب ومنع الخلايا من الالتصاق على بولي بروبلينأنابيب ني.
    1. تحميل أنبوب عينة، بدوره على لوحات انحراف واختر "اختبار النوع" مع درج مغلق. ننظر إلى تيارات الجانب في حال حدوث الانفصال دون الكثير من تأجيج.
       ملاحظة: من المحتمل فانينغ بسبب تركيز نسبة عالية من البروتين في عينة العازلة.
18. تحميل أنبوب العينة إلى أداة FACS. حدد التحريض عينة من 300 دورة في الدقيقة ودرجة حرارة العينة من 4 ° C. حدد "الحصول على البيانات" في "اقتناء لوحة".
19. إذا لزم الأمر، وتمييع العينة إلى تحقيق معدل الحدث المناسب إلى حد أقصى قدره 5000 أحداث / ثانية (بمعدل تدفق الأقصى من 3.0). بدقة احترام هذه الحدود وذلك للحفاظ على نقاء خلايا فرزها.
20. لتحليل وفرز الخلايا، وتحسين قيمة عتبة FSC للقضاء على الحطام دون التدخل مع السكان من الاهتمام. في مقياس لوغاريتمي، وضبط الجهد من الأنبوب الصور المضاعف (PMT) كاشف مع فلتر 530/30 من أجل جعلالتأكد من أن إشارة مضان من مجموع السكان يناسب داخل نطاق، وبوابة على السكان الإيجابي (الشكل 1، بوابة 1).
21. إنتاج مبعثر في منطقة الأمام (FSC-A) / جانبية مبعثر في منطقة (SSC-A) قطعة من السكان إيجابي SYTO16 وضبط FSC-A إلى حوالي 110 V في مقياس خطي، وSSC-A إلى حوالي 150 V في مقياس لوغاريتمي لتصور كل الأحداث مع استبعاد الخلايا الكبيرة جدا والمجاميع الخلية.
22. في إطار "ترتيب تخطيط"، تعيين "وضع الدقة ترتيب" إلى "النقاء 4-الطريق" (قناع الغلة: 0، الطهارة قناع: 32، قناع المرحلة: 0). حدد "مستمر" من "أحداث الهدف" القائمة على الفرز مستمر.
23. إضافة السكان لفرز في مجال المطابقة للأنابيب (في إطار "ترتيب تخطيط"). سكان المكان مع ترددات أعلى في الوسط، وتلك مع ترددات منخفضة نسبيا في نهايات. ضبط لوحات الجهد ل2500 V. أثناء الفرز، والحفاظ على تي جمع العيناتubes على الجليد.

4. خلية الفرز

1. على الفور قبل الفرز، والخلايا مرشح باستخدام فلتر 50 ميكرون في المغلفة سابقا 5 مل البولي بروبلين الجولة أنبوب أسفل.
2. غسل المرشح على نطاق واسع مع 1-2 مل من فرز العازلة.
3. الخلايا الجرثومية نوع ثابتة باستخدام مجهزة ليزر فارز خلية 488 نانومتر التالية مخطط النابضة المفصل في الشكل 1. جمع الكسور النقاء في 5 مل من مادة البولي بروبيلين أنابيب أسفل الجولة المغلفة سابقا في القسم 1 على الجليد.
   1. تأكد من 100-200 ميكرولتر من FBS يتم الاحتفاظ بها في أنابيب جمع لتجنب التصاق الخلايا مرتبة على الجدار أنبوب.
   2. تأكد من أن تركيز SYTO16 والإشباع لتجنب تقلبات مضان خلال الفترة الفرز. SYTO16 وتشبع عندما لا يكون هناك تباين المزيد من شدة تلطيخ الخلية في اليكسا فلور 488 معلمة (تلطيخ DNA) في الرسومات الفرز. إذا لزم الأمر، إضافة 1 ميكرولتر منSYTO16 إلى أنبوب الفرز للوصول إلى الإشباع.
   3. عرض مجموع الأحداث على الرسم تظهر المعلمات التالية: عدد من الأحداث مقابل اليكسا فلور 488-A.
   4. حدد الخلايا تلطيخ DNA إيجابية مع بوابة 1، كما هو مبين في الشكل 1.
      1. عرض الخلايا من بوابة 1 على الرسم باستخدام SSC-A مقابل FSC-A كمعلمات
         1. حدد الخلايا مع بوابة 2، أظهرت كما في الشكل 1.
         2. عرض الخلايا من بوابة 2 على الرسم باستخدام FSC-A مباراة اليكسا فلور 488-A كمعلمات.
         3. حدد الخلايا مع بوابة 5 و 6 على بوابة بوابة 2 الرسم، أظهرت كما في الشكل 1.
         4. عرض منفصل بوابة 5 و 6 على بوابة الرسومات باستخدام اليكسا فلور 488-W مقابل اليكسا فلور 488-A كمعلمات.
         5. حدد تكون النطاف الخطوات 1-9 spermatids على بوابة 5 الرسم وتكون النطاف الخطوات 10-12 spermatids على بوابة 6 الرسومات، وأظهرت كما في الشكل 1.
      2. عرضخلايا من بوابة 1 على الرسم باستخدام FSC-A مباراة اليكسا فلور 488-A كمعلمات
         1. حدد الخلايا مع بوابة 3 وبوابة 4، وأظهرت كما في الشكل 1.
         2. عرض منفصل بوابة 3 و 4 على بوابة الرسومات باستخدام اليكسا فلور 488-W مقابل اليكسا فلور 488-A كمعلمات.
         3. حدد تكون النطاف الخطوات 13-14 spermatids على الرسم البوابة رقم 3 وتكون النطاف الخطوات 15-16 spermatids على الرسم بوابة 4، وأظهرت كما في الشكل 1.

النتائج

استراتيجية النابضة استخدامها مع التدفق الخلوي

الشكل 1 يمثل استراتيجية النابضة المستخدمة في التدفق الخلوي لفرز أربعة السكان النطف نقية للغاية. لفترة وجيزة، والخلايا مع تلطيخ DNA الإيج?...

Discussion

الخلايا المنوية دائما تحديا للدراسة نظرا لتعقيد ظهارة المنوية، وكذلك النجاح المحدود للثقافة في المختبر. على مر السنين، وقد وضعت الخلايا الجرثومية من الأنواع المختلفة العديد من الطرق لتنقية. تقنيات الترسيب باستخدام تنقية الجاذبية مع Percoll أو الأبقار مصل الزلال ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Isoflurane	ABBOT	05260-05	For mouse anesthesia before euthanasia
Fetal bovine serum	Wisent	90150	For tube coating
1x PBS
EDTA	BioShop	EDT	For sorting buffer preparation
HEPES	Sigma	H	For sorting buffer preparation
100% Ethanol	Les alcools de commerce	092-09-11N	For cell fixation
SYTO 16	Life Technologies	S7578	DNA staining
5 ml polypropylene round bottom tubes	BD Falcon	352063	Sorted cells collection
15 ml polypropylene conical bottom tubes	PROgene	1500
50 ml polypropylene conical bottom tubes	PROgene	5000
TEC4 anaesthetic vaporizer	Ohmeda	1160526	For mouse euthanasia
CO2 gas tank	Praxair	C799117902	For mouse euthanasia
O2 gas tank	Praxair	O254130501	For mouse euthanasia
Homemade mouse gas chamber			For mouse euthanasia
40 µm Falcon cell strainer	Corning Incorporated	352340
50 μm sample line filters	BD Biosciences	649049
Vortex mixer	Labnet international, inc.	S0200	For cell fixation
Dynac centrifuge	Clay Adams	101
Celltrics 50 µm filters	Partec	04-004-2327
488 nm laser-euipped cell sorter	BD Biosciences	FACSAria III
Accudop Fluorescent Beads	BD Biosciences	345249
Sorting Buffer: 1x PBS, 1 mM EDTA pH 8.0, 25 mM HEPES pH 7.0, 1% FBS			FBS is heat-inactivated. Make fresh solution, 0.22 μm filtered and keep at 4°C.