Specifiche Step-ordinamento di mouse spermatidi mediante citometria di flusso

Riepilogo

We describe a sorting strategy for mouse spermatids using flow cytometry. Spermatids are sorted into four highly pure populations, including round (spermiogenesis steps 1-9), early elongating (spermiogenesis steps 10-12), late elongating (spermiogenesis steps 13-14) and elongated spermatids (spermiogenesis steps 15-16). DNA staining, size and granulosity are used as selection parameters.

Abstract

La differenziazione di spermatidi topo è uno processo critico per la produzione di un gamete maschile funzionale con un genoma intatto da trasmettere alla generazione successiva. Finora, gli studi molecolari di questa transizione morfologica sono stati ostacolati dalla mancanza di un metodo che consente un'adeguata separazione di queste importanti fasi di differenziazione spermatid per analisi successive. Precedenti tentativi di gate adeguato di queste cellule in citometria a flusso potrebbe essere stato difficile a causa di un particolare aumento della fluorescenza del DNA in spermatidi in fase di rimodellamento della cromatina. Sulla base di questa osservazione, noi forniamo i dettagli di un semplice sistema di citometria a flusso, che permette la purificazione riproducibile di quattro popolazioni di spermatidi topo fissate con etanolo, ognuno dei quali rappresenta uno stato diverso nel processo di rimodellamento nucleare. L'arricchimento della popolazione è confermato per mezzo di marcatori specifici per step e criteri morfologici. Gli spermatidi purificati possono essere utilizzati per genomica e proteomic analisi.

Introduzione

Haploid round spermatids differentiate into spermatozoa by a process called spermiogenesis. This involves many different steps including the acquisition of a flagellum, chromatin and cytoskeleton remodeling, condensation of the nucleus as well as the loss of most of the cytoplasm. These unique cellular events must be finely regulated in order to produce a mature functional gamete with an intact genome suitable for fertilization. Spermiogenesis can hardly be studied in vitro since no reliable cell culture system has so far been able to support progression through the different steps of the process. Moreover, actual in vitro techniques lead to a poor yield^1,2. In vivo, proper transitions through the different steps of spermiogenesis are crucial for the natural functional integrity of the male gamete. Successful purification of spermatids according to their differentiation steps has never been accomplished with a level of enrichment sufficient to allow molecular characterization of spermiogenesis. For instance, purification of key steps of the spermatidal differentiation would be especially useful to study the developing acrosome, formation of the midpiece³, cell junction dynamics⁴, RNA dynamics⁵, chromatin remodeling process^6,7 or genomic stability⁸. Purification of spermatids has been hampered by their progressive morphological transformation, the lack of known stage-specific external biomarkers, and their peculiar shape and size.

Although most male germ cells display a direct relationship between DNA staining and ploidy (DNA content), we noticed that such positive correlation is no longer applicable to spermatids. This stems from our early observation that seminiferous tubule sections show variable intensity of DNA staining throughout the different spermiogenesis steps. Although DNA staining is consistent with their haploid set of chromosomes from spermiogenesis steps 1 to 7 (round spermatids), we observed a sharp increase in fluorescence intensity with DAPI or SYTO 16 around the onset of nuclear reorganization and chromatin remodeling (spermiogenesis step 8) reaching a peak at the onset of nuclear condensation (spermiogenesis steps 11-12). Following condensation of the nucleus, DNA staining intensity decreases until spermiation (spermiogenesis step 16). We surmised that this was likely associated with the formation of their peculiar chromatin structure transition where histones are replaced by protamines. We therefore developed a reliable flow cytometry method that allows the separation of spermatids using the variation of DNA intensity of spermatids as a main selection parameter.

A simple flow cytometry approach is described to separate mouse spermatids with high purity (95-100%) based on their apparent DNA content (SYTO16 staining), size and granulosity. Spermatids are separated into four populations; spermiogenesis steps 1-9, 10-12, 13-14 and 15-16. Purified spermatids are suitable for genetic/genomic analysis, as well as proteomic applications as described in a recent publication from our group⁹.

Protocollo

Cura degli animali era in conformità con la cura degli animali e l'uso comitato Université de Sherbrooke.

1. Preparazione del tubo

1. Il giorno prima separazione delle cellule, aggiungere 1-2 ml di siero inattivato al calore fetale bovino (FBS) a 5 ml in polipropilene provette con fondo arrotondato, e di 15 ml e 50 ml tubi in polipropilene coniche.
   Passaggio fondamentale: Assicurarsi che ogni tubo utilizzato nel protocollo è rivestito.
   Nota: Rivestimento FBS impedisce alle cellule germinali di attaccarsi alle pareti del tubo.
2. Mescolare lentamente O / N per inversione a 4 ° C per rivestire i tubi in modo uniforme con un rotatore.
3. Il giorno successivo, togliere FBS da tubi rivestiti per decantazione.
   1. * Passo critico: Assicurarsi che i 5 ml in polipropilene provette con fondo arrotondato e le 15 e 50 ml tubi utilizzati per la preparazione delle cellule (protocollo passaggi 2,1-2,11) sono completamente svuotati di FBS per prevenire Fanning (ad esempio, deviazione imprecisa dei torrenti laterali). Utilizzare una pipetta P200 per rimuovere le FBS.
      Nota: residua FBS in tubi prima di smistamento può portare a una perdita di cellule o la contaminazione di altri tubi utilizzati durante l'ordinamento delle cellule,
   2. Lascia un piccolo volume residuo di FBS (circa 100-200 ml) in polipropilene da 5 ml tubi tondi fondo utilizzati per la raccolta delle cellule purificate.

2. Preparazione delle cellule

1. Sacrifica un topo maschio in anestesia con O ₂ / isoflurano (induzione al 5% poi mantenuto al 2%), seguito da _CO 2 asfissia.
2. Accise e decapsulate entrambi i testicoli e tritare con piccole forbici in 500 ml di smistamento tampone in una provetta da 1,5 ml.
3. Cellule germinali Flush da tubuli seminiferi di dolce pipettando su e giù nel tubo 1,5 ml, prima con una punta tronca 100-1000 ml, e poi con un intatto punta 100-1000 ml.
4. Rimuovere i detriti e ciuffi dopo passo una filtrazione con un colino cella 40 micron e raccogliere filtrato nei 50 ml prev tubo conicoiously rivestito con FBS al punto 1.
5. Lavare il filtro una volta con tampone di smistamento fino ad un volume totale di 3 ml e trasferimento filtrato nel tubo da 15 ml precedentemente rivestito in passaggio 1.
6. Aggiungere 16 ml di 50 mM EDTA pH 8 per millilitro di sospensione cellulare (48 ml per 3 ml) in modo da ottenere una concentrazione finale di 0,8 mM EDTA.
7. Per risolvere le cellule germinali, lentamente aggiungere 3 volumi di ghiacciata etanolo al 100% con un 10 ml pipetta con agitazione (vortex a bassa velocità), che produrrà una sospensione lattiginosa.
   Step critico: lentamente aggiungendo etanolo è cruciale e importante preservare l'integrità della preparazione cellulare. Abbiamo notato che la rapida aggiunta di etanolo provoca la lisi delle cellule con una conseguente notevole diminuzione dell'efficienza della selezione. Per una sospensione cellulare 3 ml, 9 ml di etanolo dovrebbe essere aggiunto in circa 1 min.
8. Incubare le cellule in ghiaccio per 15 minuti con miscelazione occasionali per inversione.
9. Sospensione cellulare a 800 xg Centrifugare per 5 min e rimuovere il chiarosurnatante.
10. Risospendere delicatamente le cellule germinali fissati in 2 ml di cernita tampone.
11. Aggiungere 4 ml di colorante DNA SYTO16 (soluzione 1 mM in DMSO) e incubare per almeno 30 min (protetto dalla luce).
    Nota: I risultati migliori si ottengono utilizzando ordinamento SYTO16 poiché è un colorante DNA permeabile che è facilmente incorporato in nuclei altamente compattati di spermatidi.

Sorter 3. cellulare Set Up

Viene utilizzato 20 parametri cell sorter BDFACSAria III Ecco, un 4-Laser (rosso 405 nm - viola, 488 nm - blu, 561 nm - - giallo-verde, 633 nm): Nota. Il software BD FACSDiva 6.1.3 viene utilizzato per visualizzare e analizzare i dati. Le impostazioni possono variare a seconda del tipo di sorter utilizzato.

1. Sterilizzare il sorter FACS eseguendo il 70% di etanolo come fluido di trasporto durante la procedura di spegnimento fluidica (menu "Cytometer" del software) prima di smistamento. Selezionare "Citometro" nella barra degli strumenti del software e scegliere "sh Fluidicutdown ". Seguire la procedura citati dai processi.
2. Preparare e filtrata 1x PBS con un filtro da 0,22 micron in modo da eliminare eventuali cristalli e contaminanti. Riempire il serbatoio guaina la linea di saldatura superiore all'interno del serbatoio.
3. Avviare il software ed eseguire il login. Avviare il sorter FACS a scaldare i laser per almeno 30 minuti prima di smistamento. Eseguire due processi di avvio fluidici per scovare l'etanolo dai fluidica. Selezionare "Citometro" nella barra degli strumenti del software e scegliere "avvio Fluidic". Seguire i passaggi indicati dai processi.
   Nota: Questo ripristina fluidica con normale liquido guaina (1x PBS).
4. Pulire il blocco di ordinamento e le piastre di deflessione con acqua distillata e asciugare accuratamente. Sonicare un ugello 100 micron posto in un tubo di acqua distillata per 2 minuti in un bagno di sonicazione. Pulire a fondo l'ugello.
5. Inserire l'ugello 100 micron nella cella di flusso e ruotare l'ugello leva di bloccaggio in senso orario al 12Posizione hr. Impostare la pressione della guaina di 20 psi.
6. Accendere il torrente e regolare l'ampiezza di ottenere valori di riferimento per la frequenza (circa 30), Goccia 1 (circa 150) e Gap (circa 12), e di stabilire un modello di gocce di troncaggio stabile (gocce pochi satellite). Spegnere attenuazione.
7. Assicurarsi che il flusso sia diritto e colpisce il centro dell'aspiratore rifiuti cambiando l'angolo del blocco genere. Nota: Un ugello 130 micron a 10 psi è stato anche testato ed è stato trovato nessuna differenza evidente.
8. Impostare ritardo laser a 0 per il blu, -77,39 per il rosso, 37.33 per il viola e -39,85 per i laser di colore giallo-verde.
9. Impostazione delle aree di scala di 1,14 per il blu, 1.0 per il rosso, 0,75 per la viola e 0.96 per i laser di colore giallo-verde.
10. Utilizzando un Sort Test (nella finestra "laterale Stream" del software), fare in modo che i flussi laterali non sono Fanning. Nella finestra "laterale Stream", regolare i cursori di tensione di ogni flusso lato in modo che hanno colpito il middle di tubo di raccolta di prova. Se il flusso centrale non è stretto, regolare il 2 ^{°, 3 °} e 4 impostazioni ^° drop per limitare il flusso centrale.
11. Avviare l'installazione citometro e tracking (CS & T) applicazione nel (menu "Cytometer") del software.
12. Utilizzare l'Installazione e monitoraggio perline citometro a 1 goccia per 350 ml per automatizzare la caratterizzazione e il monitoraggio delle prestazioni citometro utilizzando le istruzioni del produttore.
13. Chiudere l'applicazione CS & T. Applicare impostazione CS & T, assicurarsi che i parametri di flusso consentono ancora un andamento stabile delle gocce di troncaggio, e attivare il pulsante di Sweet Spot come descritto nelle istruzioni del produttore (nella "finestra breakoff").
14. Ottimizzare il valore di goccia di ritardo utilizzando perline fluorescenti (vedi Tabella dei Materiali).
    1. Installare i tubi di raccolta nel supporto. Aprire la porta blocco tipo. Nella finestra "laterale Stream", accendere la tensione, quindi selezionare "Test di sorta "e fare clic sul pulsante aspiratore cassetto per aprire il cassetto e avere accesso ai tubi di raccolta.
    2. Ottimizzare i flussi laterali così vanno al centro del tubo. Regolare i valori e cursori come necessario.
    3. Chiudere la porta blocco tipo e assicurarsi di regolare il quadrante del micrometro per ottenere il posto tallone luminoso al centro. Cassetto rifiuti deselezionare, prova sorta e la tensione. Rimuovere i tubi di raccolta.
    4. Ottimizzare il ritardo calo secondo le istruzioni del fabbricante.
       1. In breve, agitare tallone fiala vigorosamente e diluire 1 goccia di perline in 0,5 ml di PBS.
       2. Utilizzando le istruzioni del produttore, impostare il ritardo goccia utilizzando il modello esperimento goccia Ritardo disponibili nel software. In alternativa, utilizzare la funzione Auto Goccia Ritardo per impostare il ritardo goccia.
       3. Caricare il tubo di perline fluorescenti e regolare la portata fino a quando il tasso di soglia è ~ 3.000 a 4.000 eventi / secondo. Impostare la precisione sorta di "iniziale" e finalemente a "sintonizzare" nella finestra "Layout Sort". Selezionare il filtro ottico e ordinare perline. Regolare il ritardo di goccia fino ~ 100% sono allineati a sinistra.
          Nota: Questo passaggio è fondamentale per fare in modo che le cellule di interesse specie in un flusso laterale. Le perline e il filtro ottico sono utilizzati per ottenere vicino a una deviazione gocciolina 100%.
15. Posizionare un ND (neutral density) Filtro FSC 1.5 all'estremità sinistra del blocco rilevatore FSC. Impostare l'estensione della finestra di 2.00 ms e il ridimensionamento FSC area a 1,00 (nella scheda "Laser" nella finestra "citometro").
16. Prima di caricare provetta posizionare una linea di filtro campione di 50 um alla fine della linea di campionamento per evitare grumi. Per farlo, selezionate "Modifica filtro campione" nel menu "citometro".
17. Testare la composizione del fluido campione per ottenere una buona separazione senza ventaglio tra flusso laterale e per evitare che le cellule di attaccarsi alla poliprotubi ne.
    1. Caricare la provetta, accendere le piastre di deflessione e selezionare "Test tipo" con il cassetto chiuso. Guardate i flussi laterali in caso di separazione senza troppi Fanning.
       Nota: Fanning è probabilmente dovuto ad un alta concentrazione di proteine ​​nel tampone.
18. Caricare la provetta nello strumento FACS. Selezionare un campione di agitazione 300 rpm ed una temperatura del campione di 4 ° C. Selezionare "Acquisire dati" nella "Acquisizione Dashboard".
19. Se necessario, diluire il campione per ottenere un tasso di evento appropriato ad un massimo di 5000 eventi / sec (ad una portata massima di 3,0). Rigorosamente rispettare questi limiti in modo da mantenere la purezza delle cellule ordinati.
20. Per analizzare e ordinare le celle, ottimizzare il valore di soglia FSC per eliminare i residui senza interferire con la popolazione di interesse. In scala logaritmica, regolare la tensione del rivelatore con il filtro 530/30 tubo fotomoltiplicatore (PMT) per rendereAssicurarsi che il segnale di fluorescenza della popolazione totale si inserisce all'interno della scala, e porta sulla popolazione positivo (Figura 1, Gate 1).
21. Produrre un Forward Scatter-zona (FSC-A) / Side Scatter-zona (SSC-A) diagramma della popolazione positivo SYTO16 e regolare la FSC-A a circa 110 V in scala lineare, e la SSC-A a circa 150 V in scala logaritmica per visualizzare tutti gli eventi escludendo molto grandi cellule e aggregati cellulari.
22. Nella finestra "Ordina Layout", impostare il "modo Ordinamento Precision" a "purezza 4-way" (maschera Yield: 0, Purezza Maschera: 32, Fase Maschera: 0). Selezionare "Continua" dal menu "Target Eventi" per l'ordinamento continuo.
23. Aggiungere popolazioni per ordinare nel campo corrispondente ai tubi (nella finestra "Sort Layout"). Popolazioni posto con frequenze più alte al centro e quelli con frequenze più basse alle estremità. Impostare le piastre di tensione a 2.500 V. Durante l'ordinamento, mantenere la raccolta del campione tUBE su ghiaccio.

4. cella Ordinamento

1. Immediatamente prima di smistamento, celle filtranti usando un filtro 50 micron in un precedentemente rivestito 5 ml in polipropilene tubo tondo fondo.
2. Lavare il filtro a lungo con 1-2 ml di cernita tampone.
3. Cellule germinali Ordina fissi utilizzando un attrezzato laser cell sorter 488 nm secondo lo schema di gating dettagliato in figura 1. Raccogliere frazioni purificate in polipropilene 5 ml provette con fondo arrotondato precedentemente rivestite nella sezione 1 su ghiaccio.
   1. Assicurarsi che 100-200 ml di FBS è conservato nei tubi di raccolta per evitare incollaggio delle cellule ordinati alla parete del tubo.
   2. Assicurarsi che la concentrazione di SYTO16 è saturare per evitare fluttuazioni di fluorescenza durante il periodo di smistamento. SYTO16 è saturare quando non c'è un'ulteriore variazione di intensità di colorazione della cellula al 488 parametro Alexa Fluor (colorazione DNA) nella grafica smistamento. Se necessario, aggiungere 1 ml diSYTO16 al tubo di smistamento per raggiungere la saturazione.
   3. Visualizzare gli eventi totali su un grafico che visualizza i seguenti parametri: numero di eventi vs Alexa Fluor 488-A.
   4. Selezionare le celle colorazione DNA positivi con Gate 1, come mostrato in Figura 1.
      1. Celle di visualizzazione dalla porta 1 su un grafico con SSC-A vs FSC-A come parametri
         1. Selezionare le celle con Gate 2, come mostrato in Figura 1.
         2. Celle di visualizzazione dalla Porta 2 su un grafico utilizzando FSC A vs Alexa Fluor 488-A come parametri.
         3. Selezionare celle con Gate 5 e 6 su Gate Porta 2 grafica, come mostrato in Figura 1.
         4. Visualizza separatamente Gate 5 e Gate 6 sulla grafica che utilizzano Alexa Fluor 488-W vs Alexa Fluor 488-A come parametri.
         5. Selezionare spermiogenesi i passaggi 1-9 spermatidi sul Gate 5 grafica e spermiogenesis passaggi 10-12 spermatidi sul cancello 6 grafici, come mostrato in Figura 1.
      2. Displaycellule dalla porta 1 su un grafico utilizzando FSC A vs Alexa Fluor 488-A come parametri
         1. Selezionare le celle con Gate 3 e Gate 4, come mostrato in Figura 1.
         2. Visualizza separatamente Gate 3 e Gate 4 sulla grafica che utilizzano Alexa Fluor 488-W vs Alexa Fluor 488-A come parametri.
         3. Selezionare spermiogenesi passaggi 13-14 spermatidi sul Gate 3 grafica e spermiogenesis passaggi 15-16 spermatidi sulla Porta 4 grafico, come mostrato in Figura 1.

Risultati

Strategia di gating utilizzato con citometria a flusso

La figura 1 rappresenta la strategia di gating utilizzato in citometria a flusso per ordinare quattro popolazioni spermatidi altamente puri. In breve, le cellule con colorazione del DNA positivo (Alexa Fluor 488-A) sono selezionati prima con Porta 1. spermatidi da spermiogenesis Predellino 1-12 sono selezionati (Porta 2) su un diagramma a punti che mostra ...

Discussione

Cellule spermatogenic sono sempre stati difficili da studiare data la complessità del seminifero, nonché il limitato successo della coltura in vitro. Nel corso degli anni, molti approcci per purificare cellule germinali di varie specie sono stati sviluppati. Tecniche di sedimentazione che utilizzano purificazione gravità con Percoll o bovina siero gradienti di albumina solitamente forniscono una buona resa di cellule germinali intatte, ma mancano di adeguata definizione tra alcuni tipi di cellule come le cel...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Isoflurane	ABBOT	05260-05	For mouse anesthesia before euthanasia
Fetal bovine serum	Wisent	90150	For tube coating
1x PBS
EDTA	BioShop	EDT	For sorting buffer preparation
HEPES	Sigma	H	For sorting buffer preparation
100% Ethanol	Les alcools de commerce	092-09-11N	For cell fixation
SYTO 16	Life Technologies	S7578	DNA staining
5 ml polypropylene round bottom tubes	BD Falcon	352063	Sorted cells collection
15 ml polypropylene conical bottom tubes	PROgene	1500
50 ml polypropylene conical bottom tubes	PROgene	5000
TEC4 anaesthetic vaporizer	Ohmeda	1160526	For mouse euthanasia
CO2 gas tank	Praxair	C799117902	For mouse euthanasia
O2 gas tank	Praxair	O254130501	For mouse euthanasia
Homemade mouse gas chamber			For mouse euthanasia
40 µm Falcon cell strainer	Corning Incorporated	352340
50 μm sample line filters	BD Biosciences	649049
Vortex mixer	Labnet international, inc.	S0200	For cell fixation
Dynac centrifuge	Clay Adams	101
Celltrics 50 µm filters	Partec	04-004-2327
488 nm laser-euipped cell sorter	BD Biosciences	FACSAria III
Accudop Fluorescent Beads	BD Biosciences	345249
Sorting Buffer: 1x PBS, 1 mM EDTA pH 8.0, 25 mM HEPES pH 7.0, 1% FBS			FBS is heat-inactivated. Make fresh solution, 0.22 μm filtered and keep at 4°C.