-Paso específica Clasificación de Ratón Espermátidas por Citometría de Flujo

Resumen

We describe a sorting strategy for mouse spermatids using flow cytometry. Spermatids are sorted into four highly pure populations, including round (spermiogenesis steps 1-9), early elongating (spermiogenesis steps 10-12), late elongating (spermiogenesis steps 13-14) and elongated spermatids (spermiogenesis steps 15-16). DNA staining, size and granulosity are used as selection parameters.

Resumen

La diferenciación de espermátidas de ratón es uno proceso crítico para la producción de un gameto masculino funcional con un genoma intacto para ser transmitido a la siguiente generación. Hasta ahora, los estudios moleculares de esta transición morfológica se han visto obstaculizados por la falta de un método que permite una separación adecuada de estos pasos importantes de la diferenciación espermátide para análisis posteriores. Los anteriores intentos de la selección adecuada de estas células usando citometría de flujo pueden haber sido difícil debido a un aumento en la fluorescencia peculiar ADN en espermátidas sometidos a remodelación de la cromatina. Sobre la base de esta observación, proporcionamos los detalles de un flujo sencillo citometría de esquema, lo que permite la purificación reproducible de cuatro poblaciones de espermátidas de ratón fijados con etanol, cada uno representando un estado diferente en el proceso de remodelación nuclear. Enriquecimiento de Población se confirma el uso de marcadores de pasos específicos y criterios morfológicos. Las espermátidas purificadas se pueden utilizar para genómico y proteomic analiza.

Introducción

Haploid round spermatids differentiate into spermatozoa by a process called spermiogenesis. This involves many different steps including the acquisition of a flagellum, chromatin and cytoskeleton remodeling, condensation of the nucleus as well as the loss of most of the cytoplasm. These unique cellular events must be finely regulated in order to produce a mature functional gamete with an intact genome suitable for fertilization. Spermiogenesis can hardly be studied in vitro since no reliable cell culture system has so far been able to support progression through the different steps of the process. Moreover, actual in vitro techniques lead to a poor yield^1,2. In vivo, proper transitions through the different steps of spermiogenesis are crucial for the natural functional integrity of the male gamete. Successful purification of spermatids according to their differentiation steps has never been accomplished with a level of enrichment sufficient to allow molecular characterization of spermiogenesis. For instance, purification of key steps of the spermatidal differentiation would be especially useful to study the developing acrosome, formation of the midpiece³, cell junction dynamics⁴, RNA dynamics⁵, chromatin remodeling process^6,7 or genomic stability⁸. Purification of spermatids has been hampered by their progressive morphological transformation, the lack of known stage-specific external biomarkers, and their peculiar shape and size.

Although most male germ cells display a direct relationship between DNA staining and ploidy (DNA content), we noticed that such positive correlation is no longer applicable to spermatids. This stems from our early observation that seminiferous tubule sections show variable intensity of DNA staining throughout the different spermiogenesis steps. Although DNA staining is consistent with their haploid set of chromosomes from spermiogenesis steps 1 to 7 (round spermatids), we observed a sharp increase in fluorescence intensity with DAPI or SYTO 16 around the onset of nuclear reorganization and chromatin remodeling (spermiogenesis step 8) reaching a peak at the onset of nuclear condensation (spermiogenesis steps 11-12). Following condensation of the nucleus, DNA staining intensity decreases until spermiation (spermiogenesis step 16). We surmised that this was likely associated with the formation of their peculiar chromatin structure transition where histones are replaced by protamines. We therefore developed a reliable flow cytometry method that allows the separation of spermatids using the variation of DNA intensity of spermatids as a main selection parameter.

A simple flow cytometry approach is described to separate mouse spermatids with high purity (95-100%) based on their apparent DNA content (SYTO16 staining), size and granulosity. Spermatids are separated into four populations; spermiogenesis steps 1-9, 10-12, 13-14 and 15-16. Purified spermatids are suitable for genetic/genomic analysis, as well as proteomic applications as described in a recent publication from our group⁹.

Protocolo

Cuidado de los animales estaba en conformidad con el cuidado de los animales y el uso comité de la Universidad de Sherbrooke.

1. Preparación del tubo

1. El día antes de la clasificación de células, añadir 1-2 ml de suero bovino fetal inactivado por calor (FBS) a 5 ml de polipropileno tubos de fondo redondo, y a 15 ml y 50 ml tubos cónicos de polipropileno.
   Paso crítico: Asegúrese de que todos los tubos utilizados en el protocolo es revestido.
   Nota: recubrimiento FBS evita que las células germinales se pegue a las paredes del tubo.
2. Poco a poco la mezcla de O / N por inversión a 4 ° C para revestir usando los tubos de manera uniforme un rotador.
3. El día siguiente, eliminar FBS a partir de tubos recubiertos por decantación.
   1. * Paso crítico: Asegúrese de que los 5 ml de polipropileno tubos de fondo redondo y los 15 y 50 ml tubos utilizados para la preparación de células (protocolo de los pasos 2.1 a 2.11) están completamente vacíos de FBS para evitar Fanning (es decir, la desviación imprecisa de las corrientes laterales). Utilice una pipeta P200 para eliminar las FBS.
      Nota: Residual FBS en los tubos antes de la clasificación puede conducir a una pérdida de las células o la contaminación de otros tubos utilizados durante la clasificación de células,
   2. Deja un pequeño volumen residual de FBS (alrededor de 100 a 200 l) en el 5 ml de polipropileno ronda tubos de fondo utilizados para la recolección de células purificadas.

2. Preparación de la célula

1. Sacrificar uno ratón macho bajo anestesia usando O ₂ / isoflurano (inducción al 5% después se mantuvo a 2%), seguido por _asfixia con CO2.
2. Impuestos Especiales y desencapsulan ambos testículos y picar con pequeñas tijeras en 500 l de tampón de clasificación en un tubo de 1,5 ml.
3. Células germinales rasantes de túbulos seminíferos de suave pipeteo hacia arriba y abajo en el tubo de 1,5 ml, primero con un tronco de 100-1.000 l punta, y luego con una punta de 100-1.000 l intacta.
4. Retirar los escombros y matas por el paso uno de filtración usando un filtro de células de 40 micras y recoger filtrado en los 50 ml prev tubo cónicoiamente recubierto con FBS en el paso 1.
5. Lavar el filtro una vez con tampón de clasificación hasta un volumen total de 3 ml y la transferencia de filtrado en el tubo cónico de 15 ml previamente recubierto en el paso 1.
6. Añadir 16 l de EDTA 50 mM pH 8 por mililitro de suspensión celular (48 l para 3 ml) para obtener una concentración final de EDTA 0,8 mM.
7. Para fijar las células germinales, se añade lentamente 3 volúmenes de etanol al 100% enfriado con hielo utilizando una pipeta de 10 ml con agitación suave (vórtice a baja velocidad), que producirá una suspensión lechosa.
   Paso crítico: añadiendo lentamente etanol es crucial e importante para preservar la integridad de la preparación celular. Hemos observado que la adición rápida de etanol provoca la lisis celular que resulta en una disminución importante de la clasificación eficiencia. Para obtener una suspensión de células 3 ml, se deben añadir 9 ml de etanol en aproximadamente 1 min.
8. Se incuban las células en hielo durante 15 min con mezcla ocasional por inversión.
9. Suspensión de células Centrifugar a 800 xg durante 5 min y retirar la claraflotante.
10. Resuspender suavemente las células germinales fijos en 2 ml de tampón de clasificación.
11. Añadir 4 l de tinte de ADN SYTO16 (solución 1 mM en DMSO) y se incuba durante al menos 30 min (protegido de la luz).
    Nota: Los mejores resultados de clasificación se obtienen utilizando SYTO16 ya que es un tinte de ADN permeable que se incorpora fácilmente en los núcleos altamente compactadas de espermátidas.

Clasificador 3. Cell Set Up

Se utiliza 20-parámetro clasificador celular BDFACSAria III Aquí, un 4-láser (rojo 405 nm - violeta, 488 nm - azul, 561 nm - - amarillo-verde, 633 nm): Nota. El software BD FACSDiva 6.1.3 se utiliza para visualizar y analizar los datos. Los ajustes pueden variar en función del tipo de clasificador utilizado.

1. Esterilizar el clasificador FACS mediante la ejecución de 70% de etanol como fluido envolvente durante el procedimiento de fluidos de apagado (menú "citómetro" en el software) antes de la clasificación. Seleccione "citómetro" en la barra de herramientas del software y elija "sh neumáticoutdown ". Siga los pasos mencionados por los procesos.
2. Preparar y filtrar 1x PBS con un filtro de 0,22 micras para eliminar cualquier cristal y contaminantes. Llenar el depósito de la vaina a la línea de soldadura superior en el interior del tanque.
3. Inicie el software e ingrese. Inicie el clasificador FACS para calentar el láser durante al menos 30 minutos antes de la clasificación. Ejecutar dos procesos de inicio de fluidos para eliminar el etanol a partir de los fluidos. Seleccione "citómetro" en la barra de herramientas del software y elija "arranque neumático". Siga los pasos mencionados por los procesos.
   Nota: Esto restaura fluidos con fluido envolvente normal (1x PBS).
4. Limpie el bloque de clasificación y las placas de deflexión con agua destilada y secar a fondo. Sonicar una boquilla de 100 micras colocó en un tubo de agua destilada durante 2 min en un baño de sonicación. Limpie la boquilla a fondo.
5. Inserte la boquilla de 100 micras en la celda de flujo y gire la palanca de la boquilla de bloqueo de las agujas del reloj a la 12posición h. Ajuste la presión de funda a 20 psi.
6. Encienda la corriente y ajustar la amplitud de obtener valores objetivo para la frecuencia (alrededor de 30), la gota 1 (alrededor de 150) y Gap (alrededor de 12) y establecer un patrón breakoff gotita estable (gotas pocos satélite). Apague la atenuación.
7. Asegúrese de que la corriente es recta y golpea el centro del aspirador de residuos cambiando el ángulo del bloque tipo. Nota: Una boquilla de 130 micras, con 10 psi también se ensayó y no se encontró ninguna diferencia obvia.
8. Establecer retraso láser a 0 para el -77,39 azul, para el rojo, 37,33 para el violeta y -39.85 por los láseres de color amarillo-verde.
9. Establecer zonas de escala a 1,14 para el 1.0 azul, para el rojo, 0,75 para el violeta y 0,96 para los láseres de color amarillo-verde.
10. El uso de un Ordenar de prueba (en la ventana de "Side Stream" del software), asegúrese de que las corrientes laterales no están Fanning. En la ventana "Side Stream", ajuste los controles deslizantes de tensión de cada corriente lateral para que lleguen al middle de tubo de recogida de prueba. Si la corriente de centro no es apretado, ajustar el ^{2º, 3º} y 4 ^º ajustes de caída para limitar la corriente central.
11. Inicie el programa de instalación citómetro y Seguimiento (CS & T) aplicación en el (menú "citómetro") de software.
12. Utilice la configuración y el seguimiento de cuentas de citómetro a 1 gota por cada 350 l para automatizar la caracterización y el seguimiento de la actuación citómetro siguiendo las instrucciones del fabricante.
13. Salga de la aplicación CS & T. Aplicar configuración de CS & T, asegúrese de que los parámetros de la corriente todavía permiten un patrón breakoff gotita estable, y encienda el botón de Sweet Spot como se describe en las instrucciones del fabricante (en la "ventana Breakoff").
14. Optimizar el valor gota Delay usando perlas fluorescentes (véase la Tabla de Materiales).
    1. Instale los tubos de recogida en el soporte. Abra la puerta del bloque de tipo. En la ventana "Side Stream", active la tensión a continuación, seleccione "Prueba de tipo "y haga clic en el botón aspirador cajón para abrir el cajón y tener acceso a los tubos de recogida.
    2. Optimizar las corrientes laterales así que van hacia el centro del tubo. Ajustar valores y deslizadores, según sea necesario.
    3. Cierre la puerta del bloque de clase y asegúrese de ajustar el micrómetro para obtener el punto de perlas más brillantes en el centro. Cajón de residuos Deseleccionar, prueba de tipo y la tensión. Retire los tubos de recogida.
    4. Optimizar el retraso caída de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
       1. En pocas palabras, agitar vigorosamente el vial de cuentas y diluir 1 gota de los granos en 0,5 ml de PBS.
       2. Usando las instrucciones del fabricante, establecer el retraso gota usando la plantilla experimento de la gota de retardo disponibles en el software. También puede utilizar la función Auto gota retardo para ajustar el retardo de caída.
       3. Cargar el tubo de perlas fluorescentes y ajustar la velocidad de flujo hasta que la tasa de umbral es de ~ 3.000 a 4.000 acontecimientos / segundo. Establecer la precisión de clasificación para "Inicial" y últimamente a "Sintonía fina" en la ventana "Ordenar diseño". Seleccione el filtro óptico y clasificar los granos. Ajuste el retardo gota hasta ~ 100% están ordenadas a la izquierda.
          Nota: Este paso es crítico para asegurarse de que las células de interés especie en una corriente lateral. Las perlas y el filtro óptico se utilizan para lograr cerca de una desviación de gotas 100%.
15. Coloque un filtro ND (densidad neutra) FSC 1.5 en el extremo izquierdo del bloque detector FSC. Establecer la extensión ventana al 2,00 microsegundo y el escalado FSC Área de 1.00 (en la pestaña de "láser" en la ventana "citómetro").
16. Antes de cargar el tubo de la muestra, coloque una línea de filtro de muestra de 50 micras, con el final de la línea de muestreo para evitar la formación de grumos. Para ello, seleccione "Cambiar Filtro de ejemplo" en el menú "citómetro".
17. Prueba de la composición de la muestra de fluido para lograr una buena separación entre avivar sin corriente lateral y para evitar que las células se peguen a la polypropyletubos ne.
    1. Cargue el tubo de la muestra, encender las placas de deflexión y seleccione "prueba tipo" con el cajón cerrado. Mira arroyos secundarios si se produce la separación sin demasiado Fanning.
       Nota: Fanning es probablemente debido a una alta concentración de proteína en el tampón de muestra.
18. Cargar el tubo de muestra en el instrumento FACS. Seleccionar una muestra de agitación 300 rpm y una temperatura de muestra de 4 ° C. Seleccione "Adquirir de datos" en la "Adquisición Dashboard".
19. Si es necesario, diluir la muestra para lograr una tasa de eventos apropiado para un máximo de 5.000 eventos / seg (con un caudal máximo de 3,0). Estrictamente respetar estos límites con el fin de mantener la pureza de las células clasificadas.
20. Para analizar y clasificar las células, optimizar el valor umbral de FSC para eliminar los escombros sin interferir en la población de interés. En escala logarítmica, ajustar el voltaje del detector de tubo fotomultiplicador (PMT) con el filtro de 530/30 a fin de hacerasegurarse de que la señal de fluorescencia de la población total se ajusta dentro de la escala, y la puerta en la población positiva (Figura 1, puerta 1).
21. Producir un Forward Scatter-zona (FSC-A) / dispersión lateral del área (SSC-A) parcela de la población positiva SYTO16 y ajustar el FSC-A a alrededor de 110 V en la escala lineal y la SSC-A a alrededor de 150 V en escala logarítmica para visualizar todos los eventos excluyendo muy grandes células y agregados de células.
22. En la ventana "Ordenar Diseño", establecer el "modo de ordenación de precisión" a "4 vías pureza" (máscara Rendimiento: 0, Pureza Máscara: 32, Máscara Fase: 0). Seleccione "Continuo" en el menú "Eventos objetivo" para la clasificación continua.
23. Añadir poblaciones para ordenar en el campo correspondiente a los tubos (en la ventana "Ordenar Layout"). Coloque las poblaciones con frecuencias más altas en el centro y los que tienen frecuencias más bajas en los extremos. Establecer las placas de voltaje a 2500 V. Durante la clasificación, mantener la recolección de la muestra tUBE en el hielo.

4. Cell Sorting

1. Inmediatamente antes de la clasificación, las células de filtro utilizando un filtro de 50 micras en un 5 ml previamente recubierto de polipropileno ronda tubo inferior.
2. Lave el filtro extensamente con 1-2 ml de tampón de clasificación.
3. Células germinales Ordenar fijos utilizando un 488 nm láser equipado clasificador de células siguiendo el esquema gating se detalla en la Figura 1. Recoger fracciones purificadas en 5 ml de polipropileno tubos de fondo redondo recubiertas previamente en la sección 1 en el hielo.
   1. Asegúrese de que de 100-200 l de FBS se mantiene en los tubos de recogida para evitar la adherencia de las células clasificadas a la pared del tubo.
   2. Asegúrese de que la concentración de SYTO16 está saturando de evitar las fluctuaciones de fluorescencia durante el período de clasificación. SYTO16 está saturando cuando no hay más variación de intensidad de la tinción de células en el parámetro 488 (tinción de ADN) Alexa Fluor en los gráficos de clasificación. Si es necesario, añadir 1 l deSYTO16 al tubo de clasificación para alcanzar la saturación.
   3. Mostrar los eventos totales en un gráfico que muestra los siguientes parámetros: número de eventos vs Alexa Fluor 488-A.
   4. Seleccione las celdas de tinción de ADN positivos con la Puerta 1, como se muestra en la Figura 1.
      1. Mostrar las células de la puerta 1 en un gráfico utilizando SSC-A vs FSC-A como parámetros
         1. Seleccione las celdas con la puerta 2, como se muestra en la Figura 1.
         2. Mostrar las células de la puerta 2 en un gráfico usando FSC-A vs Alexa Fluor 488-A como parámetros.
         3. Seleccionar celdas con Puerta 5 y 6 en la Puerta Puerta 2 gráfico, como se muestra en la Figura 1.
         4. Mostrar separado Puerta 5 y 6 en la Puerta de gráficos usando Alexa Fluor 488-W vs Alexa Fluor 488-A como parámetros.
         5. Seleccione espermiogénesis pasos 1-9 espermátidas en la Puerta 5 gráfico y espermiogénesis pasos 10-12 espermátidas en la puerta 6 gráficos, como se muestra en la Figura 1.
      2. Monitorlas células de la puerta 1 en un gráfico utilizando FSC-A vs Alexa Fluor 488-A como parámetros
         1. Seleccionar las células con la puerta 3 y Puerta 4, como se muestra en la Figura 1.
         2. Mostrar separado Puerta 3 y la puerta 4 de gráficos con Alexa Fluor 488-W vs Alexa Fluor 488-A como parámetros.
         3. Seleccione espermiogénesis pasos 13-14 espermátidas en el gráfico de la Puerta 3 y espermiogénesis pasos 15-16 espermátidas en el gráfico de la puerta 4, como se muestra en la Figura 1.

Resultados

Estrategia de apertura de puerta se usa con citometría de flujo

La Figura 1 representa la estrategia gating utilizado en citometría de flujo para clasificar cuatro poblaciones spermatid altamente puros. Brevemente, las células con tinción de ADN positivo (Alexa Fluor 488-A) se seleccionan en primer lugar con la Puerta 1. Espermátidas de espermiogénesis pasos son seleccionados 1-12 (puerta 2) en un gráfi...

Discusión

Células de espermatogénesis siempre han sido difíciles de estudiar debido a la complejidad del epitelio seminífero, así como el éxito limitado de cultivo in vitro. A través de los años, muchos enfoques para purificar se desarrollaron las células germinales a partir de diversas especies. Utilizando técnicas de sedimentación de purificación de la gravedad con Percoll o gradientes de albúmina de suero bovino por lo general proporcionan un buen rendimiento de células germinales intactas, pero carecen ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Isoflurane	ABBOT	05260-05	For mouse anesthesia before euthanasia
Fetal bovine serum	Wisent	90150	For tube coating
1x PBS
EDTA	BioShop	EDT	For sorting buffer preparation
HEPES	Sigma	H	For sorting buffer preparation
100% Ethanol	Les alcools de commerce	092-09-11N	For cell fixation
SYTO 16	Life Technologies	S7578	DNA staining
5 ml polypropylene round bottom tubes	BD Falcon	352063	Sorted cells collection
15 ml polypropylene conical bottom tubes	PROgene	1500
50 ml polypropylene conical bottom tubes	PROgene	5000
TEC4 anaesthetic vaporizer	Ohmeda	1160526	For mouse euthanasia
CO2 gas tank	Praxair	C799117902	For mouse euthanasia
O2 gas tank	Praxair	O254130501	For mouse euthanasia
Homemade mouse gas chamber			For mouse euthanasia
40 µm Falcon cell strainer	Corning Incorporated	352340
50 μm sample line filters	BD Biosciences	649049
Vortex mixer	Labnet international, inc.	S0200	For cell fixation
Dynac centrifuge	Clay Adams	101
Celltrics 50 µm filters	Partec	04-004-2327
488 nm laser-euipped cell sorter	BD Biosciences	FACSAria III
Accudop Fluorescent Beads	BD Biosciences	345249
Sorting Buffer: 1x PBS, 1 mM EDTA pH 8.0, 25 mM HEPES pH 7.0, 1% FBS			FBS is heat-inactivated. Make fresh solution, 0.22 μm filtered and keep at 4°C.