Adım özgü Fare spermatidlerin Sıralama'yı Akışı Sitometrinin tarafından

Özet

We describe a sorting strategy for mouse spermatids using flow cytometry. Spermatids are sorted into four highly pure populations, including round (spermiogenesis steps 1-9), early elongating (spermiogenesis steps 10-12), late elongating (spermiogenesis steps 13-14) and elongated spermatids (spermiogenesis steps 15-16). DNA staining, size and granulosity are used as selection parameters.

Özet

Fare spermatidler farklılaşması sağlam bir genomu olan bir fonksiyonel erkek gamet üretimi için bir kritik işlem sonraki kuşağa olmaktır. Şimdiye kadar, bu morfolojik geçiş moleküler çalışmalar daha sonraki analizler için spermatid farklılaşma bu önemli adımlardan yeterli ayrılmasını sağlayan bir yöntem olmaması nedeniyle sekteye oylandı. Akış sitometri kullanılarak bu hücrelerin düzgün gating de önceki girişimler için kromatin yenileme geçiren spermatidler DNA floresan kendine özgü bir artış zor olabilir. Bu gözleme dayanarak, biz etanol ile sabit fare spermatid dört popülasyonlarının tekrarlanabilir arıtılmasını sağlayan düzeni sitometri basit bir akış ayrıntıları, her nükleer yeniden şekillenme sürecinde farklı bir durumu temsil. Nüfus zenginleştirme aşaması özgü işaretleri ve morfolojik kriterler kullanılarak teyit edilir. Saflaştırılmış genomik spermatidler ve proteom için kullanılabiliric analizleri.

Giriş

Haploid round spermatids differentiate into spermatozoa by a process called spermiogenesis. This involves many different steps including the acquisition of a flagellum, chromatin and cytoskeleton remodeling, condensation of the nucleus as well as the loss of most of the cytoplasm. These unique cellular events must be finely regulated in order to produce a mature functional gamete with an intact genome suitable for fertilization. Spermiogenesis can hardly be studied in vitro since no reliable cell culture system has so far been able to support progression through the different steps of the process. Moreover, actual in vitro techniques lead to a poor yield^1,2. In vivo, proper transitions through the different steps of spermiogenesis are crucial for the natural functional integrity of the male gamete. Successful purification of spermatids according to their differentiation steps has never been accomplished with a level of enrichment sufficient to allow molecular characterization of spermiogenesis. For instance, purification of key steps of the spermatidal differentiation would be especially useful to study the developing acrosome, formation of the midpiece³, cell junction dynamics⁴, RNA dynamics⁵, chromatin remodeling process^6,7 or genomic stability⁸. Purification of spermatids has been hampered by their progressive morphological transformation, the lack of known stage-specific external biomarkers, and their peculiar shape and size.

Although most male germ cells display a direct relationship between DNA staining and ploidy (DNA content), we noticed that such positive correlation is no longer applicable to spermatids. This stems from our early observation that seminiferous tubule sections show variable intensity of DNA staining throughout the different spermiogenesis steps. Although DNA staining is consistent with their haploid set of chromosomes from spermiogenesis steps 1 to 7 (round spermatids), we observed a sharp increase in fluorescence intensity with DAPI or SYTO 16 around the onset of nuclear reorganization and chromatin remodeling (spermiogenesis step 8) reaching a peak at the onset of nuclear condensation (spermiogenesis steps 11-12). Following condensation of the nucleus, DNA staining intensity decreases until spermiation (spermiogenesis step 16). We surmised that this was likely associated with the formation of their peculiar chromatin structure transition where histones are replaced by protamines. We therefore developed a reliable flow cytometry method that allows the separation of spermatids using the variation of DNA intensity of spermatids as a main selection parameter.

A simple flow cytometry approach is described to separate mouse spermatids with high purity (95-100%) based on their apparent DNA content (SYTO16 staining), size and granulosity. Spermatids are separated into four populations; spermiogenesis steps 1-9, 10-12, 13-14 and 15-16. Purified spermatids are suitable for genetic/genomic analysis, as well as proteomic applications as described in a recent publication from our group⁹.

Protokol

Hayvan bakım Université de Sherbrooke hayvan bakımı ve kullanımı komitesi ile uyumlu idi.

1. Tüp Hazırlığı

1. Hücre sıralama bir gün önce, 5 ml'lik bir polipropilen yuvarlak tabanlı tüpe ısı ile inaktive edilmiş fetal büyükbaş hayvan serumu (FBS) ile 1-2 ml ekleyin ve 15 ml ve 50 ml polipropilen konik tüplere.
   Kritik adım: protokolünde kullanılan her tüp kaplı olduğundan emin olun.
   Not: FBS kaplama boru duvarlarına yapışmasını germ hücrelerine önler.
2. Yavaş yavaş tüpler aynı şekilde bir rotator ile kaplamak için, 4 ° C'de ters çevirme ile O / N karıştırın.
3. Ertesi gün, boşaltılarak kaplanmış tüpler FBS çıkarın.
   1. * Kritik adım: 5 ml polipropilen yuvarlak dipli tüpler ve hücre hazırlanması için kullanılan 15 ve 50 ml tüpler (protokol 2.11 2.1 adımları) tamamen havalandırmak (yan akımlarının, yani belirsiz sapma) önlemek için FBS boşalttı emin olun. FBS kaldırmak için bir P200 pipetlemeyin kullanın.
      Not: önce hücrelerle veya hücre ayırma sırasında kullanılan tüpler kontaminasyon kaybına neden olabilir sıralama için tüplere Kalıntı FBS,
   2. Yuvarlak 5 ml polipropilen saflaştırılmış hücreleri toplamak için kullanılan alt tüpler içinde FBS (yaklaşık 100-200 ul) küçük bir kalıntı hacmi bırakın.

2. Hücre Hazırlanması

1. O CO ₂ boğulma ardından ₂ / izofluran (daha sonra% 2 oranında muhafaza% 5 indüksiyon) ile anestezi altında tek erkek fare Kurban.
2. Tüketim ve açarlar hem testis ve 1.5 ml tüp içine tampon sıralama 500 ul küçük bir makas ile kıyma.
3. Sağlam bir 100-1,000 ul ucu ile daha sonra seminifer ilk kesik 100-1,000 ul ucu ile 1.5 ml tüp nazik yukarı ve aşağı pipetleme tübüllerinde, ve gelen yıkayın germ hücreleri.
4. 40 mikron hücre süzgeç kullanılarak bir filtrasyon adım enkaz ve kümeleri çıkarın ve 50 ml konik tüp prev içine süzülen toplamakiously Aşama 1 FBS kaplanmıştır.
5. Daha önce 1. adımda kaplı 15 ml konik tüp içine toplam 3 ml hacminde ve transfer filtrata kadar tampon sıralama ile bir kez filtreyi yıkayın.
6. 0,8 mM EDTA nihai bir konsantrasyon elde etmek üzere, 50 mM EDTA hücre süspansiyonu mililitre başına pH 8 (3 ml 48 ul) 16 ul ekle.
7. Germ hücreleri düzeltmek için, yavaş yavaş süt süspansiyon üretecek hafif ajitasyon ile 10 mi pipeti (düşük hızda vorteks) kullanılarak buz-soğuğu% 100 etanol içinde 3 hacim ekleyin.
   Kritik adım: yavaşça etanol ilave hücre hazırlama bütünlüğünü korumak için çok önemli ve çok önemlidir. Biz etanol hızlı ekleme etkinliğini sıralama önemli bir düşüşe neden hücre lizizine neden olduğunu kaydetti. 3 ml hücre süspansiyonu için, etanol, 9 ml, yaklaşık 1 dakika içinde ilave edilmelidir.
8. Ters çevirme ile ara sıra karıştırma ile 15 dakika süreyle buz üzerinde inkübe hücreleri.
9. Santrifüj hücre 5 dakika boyunca 800 xg'de süspansiyon ve net çıkarmaksüpernatant.
10. Yavaşça tampon sıralama 2 ml sabit germ hücreleri tekrar süspansiyon.
11. SYTO16 DNA boyası (DMSO içinde 1 mM çözelti) 4 ul ekleyin ve (ışıktan korunarak), en az 30 dakika inkübe edilir.
    Not: iyi sıralama sonuçları kolayca spermatidlerin yüksek oranda sıkıştırılmış çekirdekler dahil edilen geçirgen bir DNA boya olduğu SYTO16 kullanılarak elde edilir.

3. Hücre Ayırıcı Kurma

Not: Burada, bir 4-Lazer (405 nm - menekşe, 488 nm - mavi, 561 nm - sarı-yeşil, 633 nm - kırmızı) 20-parametre BDFACSAria III hücre sıralayıcı kullanılır. BD FACSDiva 6.1.3 yazılımı veri görselleştirmek ve analiz etmek için kullanılır. Ayarları kullanılır sıralayıcı türüne bağlı olarak değişebilir.

1. Fluidik kapatma prosedürü (yazılımında "Sitometre" menüsü) sıralama öncesinde sırasında kılıf sıvısı olarak% 70 etanol çalıştırarak FACS sıralayıcı sterilize edin. Yazılımın araç çubuğundaki "Sitometreyi" seçin ve "Fluidic sh seçin. "utdown süreçler tarafından belirtilen adımları izleyin.
2. Hazırlama ve herhangi bir kristal ve kirletici maddelerin bertaraf edecek şekilde bir 0.22 um filtre ile 1x PBS filtre. Tankın iç üst kaynak hattına kılıf deposunu doldurunuz.
3. Yazılımını başlatın ve oturum açın. Önce sıralama için en az 30 dakika süreyle lazer ısınmak için FACS sıralayıcı başlatın. Akıskanlar tekni˘gi gelen etanol dışarı floş iki akışkan başlangıç ​​süreçlerini çalıştırın. Yazılımın araç çubuğundaki "Sitometreyi" seçin ve "Fluidic başlangıç" ı seçin. Süreçlerle belirtilen adımları izleyin.
   Not: Bu normal bir kılıf sıvısı (1x PBS) ile Fluidics geri yükler.
4. Sıralama blok ve distile su ile saptırma plakaları temizleyin ve iyice kurulayın. Bir sonikasyon banyosu içinde 2 dakika için damıtılmış su içinde bir boru içine yerleştirilmiş bir 100 um ağızlık sonikasyon. Iyice memeyi silin.
5. Akış hücre içine 100 mikron memesini takın ve 12 meme-kilitleme kolunu saat yönünde çevirinhr pozisyonu. 20 psi kılıf basıncını ayarlayın.
6. Dere açın ve (30 civarında) frekans hedef değerleri elde etmek için genlik ayarlayın 1 (150 civarında) bırakın ve (12 civarında) Gap ve istikrarlı bir damlacık kırılması deseni (birkaç uydu damla) kurmak. Zayıflama kapatın.
7. Dere düz ve sıralama bloğunun açısını değiştirerek atık aspiratör merkezini vurur emin olun. Not: 10 psi A 130 mikron meme de test edildi ve belirgin bir fark bulunmuştur.
8. Sarı-yeşil lazerler için, mavi mor kırmızı için -77.39, 37.33 -39.85 ve için 0 olarak ayarlayın lazer gecikme.
9. Sarı-yeşil lazerler için, mavi mor kırmızı için 1.0, 0.75 ve 0.96 için 1.14 ölçekleme ayarlayın alanları.
10. (Yazılım "Yan Akım" penceresinde) Test Sıralama kullanarak, yan akışları havalandırarak olmadığından emin olun. Onlar middl isabet böylece "Yan Akım" penceresinde, her yan akımının gerilim sürgü ayarlamakTest toplama tüpünün e. Merkez akışı sıkı değilse, merkez akışı sınırlamak için 2 ^nd, 3 ^rd ve ^4. damla ayarlarını.
11. Yazılımın ("Sitometre" menüsü) Sitometrenin Kurulum ve İzleme (CS & T) uygulamasını başlatın.
12. Üreticinin talimatlarını kullanarak sitometresinin performans karakterizasyonu ve izleme otomatikleştirmek için 350 ul başına 1 damla sitometresinin kurulum ve izleme boncuk kullanın.
13. CS & T uygulaması çıkın. CS & T ayarı uygulamak, dere parametreleri hala istikrarlı bir damlacık kırılması modelini izin verdiğinizden emin olun, ve ("kırılması penceresinde" olarak) üreticinin talimatlarına açıklandığı gibi Sweet Spot butonuna açın.
14. Floresan boncuklar kullanarak Bırak Gecikme değerini optimize (Malzeme Tablo).
    1. Tutucuya toplama tüpleri yükleyin. Sıralama bloğu kapağını açın. "Yan Akım" penceresinde, "seçeneğini ardından gerilime açınTest sıralama "ve çekmeceyi açın ve toplama tüpleri erişimi için Aspiratör Çekmece düğmesini tıklatın.
    2. Onlar tüp merkezine gitmek böylece yan akışları optimize edin. Gerektiği gibi değer ve kaydırma çubuklarını ayarlayın.
    3. Sıralama bloğu kapağını kapatın ve merkezde parlak boncuk nokta elde etmek mikrometre kadranını ayarlamak için emin olun. Unselect atık çekmece test sıralama ve gerilim. Toplama tüpleri çıkarın.
    4. Üreticinin talimatlarına göre açılan gecikme optimize edin.
       1. Kısaca, boncuk şişe kuvvetlice sallayın ve PBS 0.5 ml boncuk 1 damla sulandırmak.
       2. Üreticinin talimatlarına kullanarak, yazılım mevcuttur Bırak Gecikme deneme şablonu kullanarak damla gecikme ayarlayabilirsiniz. Alternatif olarak, açılan gecikmesini ayarlamak için Otomatik Bırak Gecikme özelliğini kullanın.
       3. Floresan boncuk tüp yerleştirin ve eşik oranı kadar ~ 3.000 4.000 olaylar / saniye akış hızını ayarlayın. Sıralama hassasiyetini ayarlamak için "İlk" ve sonly "Sıralama düzeni" penceresindeki "İnce ayar" için. Optik filtreyi seçin ve boncuk sıralayın. % 100 sola sıralanır ~ kadar Bırak Gecikmesi ayarlayın.
          Not: Bu adım emin olmak için kritik olduğunu bir yan akışına faiz tür hücreler. Boncuk ve optik filtre, bir% 100 damlacık sapma yakın elde etmek için kullanılır.
15. FSC dedektörü bloğunun sol ucundaki bir FSC 1.5 ND (nötr yoğunluk) filtreyi yerleştirin. 2.00 us pencere uzantısı ve ("Sitometre" penceresindeki "Lazer" sekmesinde) 1.00 FSC Alan ölçekleme ayarlayın.
16. Örnek tüpü yerleştirmeden önce, topaklanma önlemek için örnek hattının sonunda 50 um örnek filtre satırı koyun. Bunu yapmak için, "Sitometre" menüsünden "Örnek Filtre değiştirme" seçeneğini seçin.
17. Yan akım arasındaki havalandırmadan iyi bir şekilde ayrılmasını sağlamak ve Polipropilen yapışmasını önlemek için hücrelerin örnek sıvı bileşimin testne tüpler.
    1. , Örnek tüp Yük saptırma plakaları açın ve çekmece kapalı "Test tür" seçeneğini seçin. Ayrılık çok fazla ventilatör olmadan oluşursa yan dereler bak.
       Not: Havalandırma, numune tamponu içinde, yüksek protein konsantrasyonunda muhtemeldir.
18. FACS aracı haline örnek tüp yükleyin. 300 rpm'lik bir ajitasyon örneği ve 4 ° C'de bir örnek sıcaklığı seçin. "Acquisition Dashboard" in "Veri Edinme" seçeneğini seçin.
19. Gerekirse, (3.0 maksimum akış hızında) / saniye 5000 etkinlikleri en fazla, uygun bir olay hızı elde etmek için örnek seyreltin. Sıralanmış hücrelerin saflığını muhafaza edecek şekilde Strictly bu sınırları saygı.
20. Analiz ve hücreleri sıralamak için, faiz nüfusu müdahale etmeden enkaz ortadan kaldırmak için FSC eşik değerini optimize. Logaritmik ölçekte yapmak amacıyla 530/30 filtresi ile foto-çoğaltıcı tüp (PMT) dedektörün voltajını ayarlamakEmin toplam nüfusun floresan sinyal ölçeğinde dahilinde ve pozitif nüfus kapısı (Şekil 1, Kapı 1).
21. Bir Forward Scatter-alanı (FSC-A) / Side Scatter alan SYTO16 pozitif nüfusun (SSC-A) arsa üretin ve yaklaşık 110 V Doğrusal ölçekte için FSC-A ayarlayın ve yaklaşık 150 V SSC-A Çok büyük hücreleri ve hücre agrega hariç ise logaritmik ölçekte tüm olayları görselleştirmek için.
22. "Sıralama Düzeni" penceresinde, "Sıralama Hassas Mode" set "4-yollu saflık" için (Verim maskesi: 0, Saflık Maskesi: 32, Faz Maskesi: 0). Sürekli sıralama için "Hedef Etkinlikler" menüsünden "Sürekli" yi seçin.
23. ("Sıralama Düzeni" penceresinde) tüplere karşılık gelen alanda sıralamak için popülasyonları ekleyin. Yüksek orta frekans ve ucunda düşük frekanslarda olanlar ile yerleştirin popülasyonları. , Sıralama sırasında 2500 V gerilim plakaları ayarlayın örnek toplama t tutmakBuz üzerinde UBE.

4. Hücre Ayırma

1. Hemen sıralamadan önce, yuvarlak dipli tüp önceden kaplanmış 5 ml polipropilen 50 mikron filtre kullanılarak filtre hücreleri.
2. Tampon sıralama 1-2 ml yoğun filtreyi yıkayın.
3. Şekil 1'de detaylı yolluk planı izleyen bir 488 nm lazer donanımlı hücre sıralayıcı kullanılarak sırala sabit germ hücreleri. Daha önce buz üzerinde bölüm 1 kaplı 5 ml polipropilen yuvarlak dipli tüplerde arıtılmış kesirler toplayın.
   1. FBS 100-200 ul tüp duvarına sıralanmış hücrelerin yapışmasını önlemek için toplama tüpleri muhafaza olduğundan emin olun.
   2. SYTO16 konsantrasyonu sıralama döneminde floresan dalgalanmaları önlemek için doygunluğa emin olun. Ayırma Grafiklerdeki Alexa Fluor 488 parametresi (DNA boyama) hücre boyama yoğunluğunun daha fazla değişiklik olduğunda SYTO16 satürasyon. Gerekirse, 1 ulSıralama tüp SYTO16 doygunluk ulaşmak için.
   3. Alexa Fluor 488-A vs olay sayısı: aşağıdaki parametreleri gösteren bir grafik üzerinde toplam etkinlik gösterir.
   4. Şekil 1 'de gösterildiği gibi, Gate 1 pozitif bir DNA boyama hücreleri seçin.
      1. Parametre olarak FSC-A vs SSC-A kullanılarak bir grafik üzerinde kapısı 1 Ekran hücreleri
         1. Şekil 1'de gösterdiği gibi, Gate 2 ile hücreleri seçin.
         2. Parametre olarak Alexa Fluor 488-A vs FSC-A kullanılarak bir grafik üzerinde Gate 2 Ekran hücreleri.
         3. Şekil 1'de gösterdiği gibi, Gate 2 grafik üzerinde Gate 5 ve Gate 6 hücreleri seçin.
         4. Parametre olarak Alexa Fluor 488-A vs 488-W Alexa Fluor kullanarak grafik üzerinde ayrı ayrı Gate 5 ve 6 Gate gösterir.
         5. Seç Spermiyogenez Gate 5 grafikte 1-9 spermatid adımları ve Şekil 1'de gösterdi Spermiyogenez Gate 6 grafik 10-12 spermatid adımları yineleyin.
      2. Ekranparametre olarak Alexa Fluor 488-A vs FSC-A kullanılarak bir grafik üzerinde kapısı 1 hücreleri
         1. Şekil 1'de gösterdiği gibi, Gate 3 ve Gate 4 hücreleri seçin.
         2. Parametre olarak Alexa Fluor 488-A vs 488-W Alexa Fluor kullanarak grafik üzerinde ayrı ayrı Gate 3 ve Gate 4 görüntüler.
         3. Seç Spermiyogenez Kapısı 3 grafik üzerinde 13-14 spermatid adımları ve Şekil 1'de gösterdi Spermiyogenez, Gate 4 grafik üzerinde 15-16 spermatid adımları yineleyin.

Sonuçlar

Yolluk strateji akış sitometri ile kullanılabilir

Şekil 1 dört derece saf spermatid popülasyonları sıralamak için flow sitometri kullanılan yolluk stratejisini temsil eder. Kısaca, pozitif DNA boyama hücreleri (Alexa Fluor 488-A) Birinci boyut vs granulosity (SSC-A) gösteren bir nokta arsa üzerinde Spermiyogenezin 1. spermatid 1-12 seçilir adımlar Kapısı (Gate 2) ile seçilir (FSC Kapı 1. A)...

Tartışmalar

Spermatogenik hücreler her zaman seminifer epitel karmaşıklığı yanı sıra, in vitro kültür sınırlı bir başarı verilen araştırmaya zorlu oylandı. Yıllar boyunca, pek çok yaklaşım, çeşitli türlerden germ hücreleri geliştirildi saflaştırmak için. Percoll ya da sığır serum albümini gradyanları ile gravite arıtma kullanılarak sedimentasyon teknikler genellikle sağlam germinal hücrelerde daha iyi bir verim sağlar, ancak bu mayoz tetraploid hücre ve spermatidler ¹⁰ gi...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Isoflurane	ABBOT	05260-05	For mouse anesthesia before euthanasia
Fetal bovine serum	Wisent	90150	For tube coating
1x PBS
EDTA	BioShop	EDT	For sorting buffer preparation
HEPES	Sigma	H	For sorting buffer preparation
100% Ethanol	Les alcools de commerce	092-09-11N	For cell fixation
SYTO 16	Life Technologies	S7578	DNA staining
5 ml polypropylene round bottom tubes	BD Falcon	352063	Sorted cells collection
15 ml polypropylene conical bottom tubes	PROgene	1500
50 ml polypropylene conical bottom tubes	PROgene	5000
TEC4 anaesthetic vaporizer	Ohmeda	1160526	For mouse euthanasia
CO2 gas tank	Praxair	C799117902	For mouse euthanasia
O2 gas tank	Praxair	O254130501	For mouse euthanasia
Homemade mouse gas chamber			For mouse euthanasia
40 µm Falcon cell strainer	Corning Incorporated	352340
50 μm sample line filters	BD Biosciences	649049
Vortex mixer	Labnet international, inc.	S0200	For cell fixation
Dynac centrifuge	Clay Adams	101
Celltrics 50 µm filters	Partec	04-004-2327
488 nm laser-euipped cell sorter	BD Biosciences	FACSAria III
Accudop Fluorescent Beads	BD Biosciences	345249
Sorting Buffer: 1x PBS, 1 mM EDTA pH 8.0, 25 mM HEPES pH 7.0, 1% FBS			FBS is heat-inactivated. Make fresh solution, 0.22 μm filtered and keep at 4°C.