Passo-específico Seleção de mouse Espermátides por citometria de fluxo

Resumo

We describe a sorting strategy for mouse spermatids using flow cytometry. Spermatids are sorted into four highly pure populations, including round (spermiogenesis steps 1-9), early elongating (spermiogenesis steps 10-12), late elongating (spermiogenesis steps 13-14) and elongated spermatids (spermiogenesis steps 15-16). DNA staining, size and granulosity are used as selection parameters.

Resumo

A diferenciação dos espermatídeos rato é um processo crítico para a produção de uma gâmeta masculina funcional com um genoma intacto para ser transmitido à geração seguinte. Até agora, os estudos moleculares desta transição morfológica têm sido dificultados pela falta de um método que permite uma separação adequada dessas etapas importantes de diferenciação spermatid para análises subsequentes. Tentativas anteriores de gating adequada destas células usando citometria de fluxo pode ter sido difícil por causa de um aumento peculiar na fluorescência DNA em espermátides submetidos à remodelação da cromatina. Com base nesta observação, que fornecem detalhes de um simples fluxo de citometria de regime, permitindo a purificação reprodutível de quatro populações de espermatídeos rato fixas com etanol, cada um representando um estado diferente no processo de remodelação nuclear. Enriquecimento população é confirmado utilizando marcadores específicos passos e critérios morfológicos. Os espermatídeos purificados podem ser utilizados para genómico e proteomic analisa.

Introdução

Haploid round spermatids differentiate into spermatozoa by a process called spermiogenesis. This involves many different steps including the acquisition of a flagellum, chromatin and cytoskeleton remodeling, condensation of the nucleus as well as the loss of most of the cytoplasm. These unique cellular events must be finely regulated in order to produce a mature functional gamete with an intact genome suitable for fertilization. Spermiogenesis can hardly be studied in vitro since no reliable cell culture system has so far been able to support progression through the different steps of the process. Moreover, actual in vitro techniques lead to a poor yield^1,2. In vivo, proper transitions through the different steps of spermiogenesis are crucial for the natural functional integrity of the male gamete. Successful purification of spermatids according to their differentiation steps has never been accomplished with a level of enrichment sufficient to allow molecular characterization of spermiogenesis. For instance, purification of key steps of the spermatidal differentiation would be especially useful to study the developing acrosome, formation of the midpiece³, cell junction dynamics⁴, RNA dynamics⁵, chromatin remodeling process^6,7 or genomic stability⁸. Purification of spermatids has been hampered by their progressive morphological transformation, the lack of known stage-specific external biomarkers, and their peculiar shape and size.

Although most male germ cells display a direct relationship between DNA staining and ploidy (DNA content), we noticed that such positive correlation is no longer applicable to spermatids. This stems from our early observation that seminiferous tubule sections show variable intensity of DNA staining throughout the different spermiogenesis steps. Although DNA staining is consistent with their haploid set of chromosomes from spermiogenesis steps 1 to 7 (round spermatids), we observed a sharp increase in fluorescence intensity with DAPI or SYTO 16 around the onset of nuclear reorganization and chromatin remodeling (spermiogenesis step 8) reaching a peak at the onset of nuclear condensation (spermiogenesis steps 11-12). Following condensation of the nucleus, DNA staining intensity decreases until spermiation (spermiogenesis step 16). We surmised that this was likely associated with the formation of their peculiar chromatin structure transition where histones are replaced by protamines. We therefore developed a reliable flow cytometry method that allows the separation of spermatids using the variation of DNA intensity of spermatids as a main selection parameter.

A simple flow cytometry approach is described to separate mouse spermatids with high purity (95-100%) based on their apparent DNA content (SYTO16 staining), size and granulosity. Spermatids are separated into four populations; spermiogenesis steps 1-9, 10-12, 13-14 and 15-16. Purified spermatids are suitable for genetic/genomic analysis, as well as proteomic applications as described in a recent publication from our group⁹.

Protocolo

Cuidados com os animais foi em conformidade com o cuidado dos animais e uso comissão Université de Sherbrooke.

1. Tubo de Preparação

1. O dia antes da separação de células, adicionar 1-2 mL de soro bovino fetal inactivado pelo calor (FBS) a 5 ml de polipropileno tubos de fundo redondo, e a 15 ml e 50 ml de polipropileno tubos cónicos.
   Passo crítico: Certifique-se de que todos os tubos usados ​​no protocolo é revestido.
   Nota: revestimento FBS impede que as células germinativas de furar a parede do tubo.
2. Lentamente misturar O / N por inversão a 4 ° C para revestir uniformemente os tubos utilizando um rotor.
3. No dia seguinte, retire FBS a partir de tubos revestidos por decantação.
   1. * Passo crítico: Certifique-se de que os 5 ml de polipropileno tubos de fundo redondo e os 15 e 50 ml tubos utilizados para preparação de células (protocolo passos 2,1-2,11) estão completamente esvaziados de FBS para impedir Fanning (ou seja, desvio impreciso dos fluxos laterais). Usar uma pipeta de P200 para remover o FBS.
      Nota: Residual FBS em tubos antes da classificação pode levar a uma perda de células ou contaminação de outros tubos utilizados durante a separação de células,
   2. Deixar um pequeno volume residual de FBS (cerca de 100-200 mL) no 5 ml de polipropileno rodada tubos de fundo utilizados para a recolha de células purificadas.

2. Preparação celular

1. Sacrificar um rato macho sob anestesia com _O2 / isoflurano (indução 5%, em seguida, mantida a 2%), seguida _por asfixia com CO2.
2. Especial e do decapsulate ambos os testículos e mediu com pequenas tesouras em 500 ul de tampão de triagem para um tubo de 1,5 ml.
3. Lavar as células germinativas de túbulos seminíferos por gentil pipetagem cima e para baixo no tubo de 1,5 ml, com um primeiro truncado 100-1.000 ul ponta, e depois com uma ponta intacta 100-1.000 ul.
4. Remover detritos e aglomerados por uma etapa de filtração usando um filtro de células 40 pm e recolher filtrado para 50 ml prev tubo cônicoiously revestido com FBS no passo 1.
5. Lavar o filtro uma vez com tampão de triagem para um volume total de 3 ml e transferência do filtrado em tubo de 15 ml previamente revestida na etapa 1.
6. Adicionar 16 ul de EDTA 50 mM, pH 8 por mililitro de suspensão de células (48 uL de 3 ml) de modo a obter uma concentração final de EDTA a 0,8 mM.
7. Para fixar as células germinativas, adiciona-se lentamente 3 volumes de etanol gelado a 100%, utilizando uma pipeta de 10 ml com agitação suave (vórtice a baixa velocidade), a qual irá produzir uma suspensão leitosa.
   Passo crítico: adição lenta de etanol é importante e crucial para preservar a integridade da preparação de células. Notamos que a rápida adição de etanol provoca a lise celular, resultando em uma importante redução de triagem eficiência. Para obter uma suspensão de células de 3 ml, 9 ml de etanol deve ser adicionado em cerca de 1 min.
8. Incubar as células em gelo durante 15 min, com mistura ocasional por inversão.
9. Centrifugar a suspensão de células a 800 xg durante 5 min e remover a clarasobrenadante.
10. Suavemente ressuspender as células germinativas fixas em 2 ml de tampão de triagem.
11. Adicionar 4 ul de corante de ADN SYTO16 (solução 1 mM em DMSO) e incuba-se durante pelo menos 30 min (protegida da luz).
    Nota: Os melhores resultados são obtidos usando triagem SYTO16 uma vez que é um corante de ADN permeável que é facilmente incorporado nos núcleos altamente compactadas de espermatídeos.

Sorter 3. celular Set Up

Nota: Aqui, a 4 de laser (405 nm - violeta, 488 nm - azul, 561 nm - verde-amarelo, 633 nm - vermelho) 20 parâmetro de separação de células BDFACSAria III é usado. O software BD FACSDiva 6.1.3 é usado para visualizar e analisar os dados. As configurações podem variar dependendo do tipo de classificador utilizado.

1. Esteriliza-se o classificador de FACS através da execução de etanol a 70% como fluido de revestimento durante o processo de encerramento de fluidos (menu "Citómetro" no software) antes da triagem. Selecione "Cytometer" na barra de ferramentas do software e escolha "sh Fluidicutdown ". Siga as etapas mencionadas pelos processos.
2. Preparar e filtrar 1x PBS com um filtro de 0,22 um, de modo a eliminar quaisquer cristais e contaminantes. Encher o reservatório de bainha para a linha de soldadura superior no interior do tanque.
3. Inicie o software e fazer o login. Comece o classificador FACS para aquecer os lasers durante pelo menos 30 minutos antes da classificação. Executar dois processos de inicialização fluídicos para lavar o etanol a partir dos fluidos. Selecione "Cytometer" na barra de ferramentas do software e escolha "startup Fluidic". Siga os passos mencionados pelos processos.
   Nota: Isso restaura fluídica com fluido de revestimento normal (1x PBS).
4. Limpe o bloco de triagem e as placas de deflexão com água destilada e seque-as completamente. Sonicar um bico de 100 | iM colocada num tubo de água destilada durante 2 minutos num banho de ultra-sons. Limpe o bico minuciosamente.
5. Inserir o bocal 100 fim na célula de fluxo e virar a alavanca de bloqueio dos ponteiros do relógio para o bocal 12posição h. Defina a pressão do invólucro a 20 psi.
6. Ligue a corrente e ajustar a amplitude de obter valores-alvo para a freqüência (cerca de 30), queda de 1 (cerca de 150) e Gap (cerca de 12) e para estabelecer um padrão de gotículas breakoff estável (poucas gotas por satélite). Desligue atenuação.
7. Certifique-se de que o fluxo é linear e atinge o centro do aspirador de resíduos, alterando o ângulo do tipo bloco. Nota: Um bocal 130 uM a 10 psi também foi testado e nenhuma diferença óbvia foi encontrado.
8. Definir atraso laser para 0 para o -77,39 azul, para o vermelho, 37,33 para o violeta e -39,85 para os lasers verde-amarelo.
9. Definir áreas de escala para 1.14 para o 1.0 azul, para o vermelho, 0,75 para o violeta e 0,96 para os lasers verde-amarelo.
10. Usando um Sort Test (na "Side Stream" janela do software), certifique-se que os fluxos secundários não são abanando. Na janela "Side Stream", ajuste os controles deslizantes de tensão de cada fluxo de lado para que eles atingiram o middlE de tubo de colheita de teste. Se o fluxo de centro não é apertado, ajustar o ^2º, 3º e 4 configurações ^th gota para restringir o fluxo de centro.
11. Inicie o Setup Cytometer e Rastreamento (CS & T) na aplicação de software (menu "Cytometer").
12. Use a configuração e acompanhamento de contas de citómetro a 1 gota por cada 350 mL de automatizar a caracterização e monitoramento do desempenho citômetro utilizando as instruções do fabricante.
13. Sair da aplicação CS & T. Aplicar configuração CS & T, certifique-se os parâmetros de transmissão ainda permitir um padrão de gotículas breakoff estável e ligue o botão Sweet Spot conforme descrito nas instruções do fabricante (na "janela breakoff").
14. Otimizar o valor Gota Delay utilizando partículas fluorescentes (ver Tabela de Materiais).
    1. Instale os tubos de coleta no suporte. Abra a porta do bloco de classificação. Na janela "Side Stream", ligue tensão, em seguida, selecione "Teste de tipo "e clique no botão Aspirador gaveta para abrir a gaveta e ter acesso aos tubos de coleta.
    2. Otimizar os fluxos laterais de forma que eles vão para o centro do tubo. Ajustar os valores e controles deslizantes conforme necessário.
    3. Feche a porta do bloco de classificação e certifique-se de ajustar o relógio comparador de obter o ponto mais brilhante pérola no centro. Gaveta resíduos Unselect, uma espécie de ensaio e de tensão. Retire os tubos de coleta.
    4. Optimizar a gota atraso de acordo com as instruções dos fabricantes.
       1. Resumidamente, agitar vigorosamente frasco grânulo e diluir 1 gota de contas em 0,5 ml de PBS.
       2. Usando as instruções dos fabricantes, definir o atraso gota usando o modelo experimento Gota Delay disponíveis no software. Como alternativa, use o recurso Auto Gota Delay para definir o atraso queda.
       3. Coloque o tubo de partículas fluorescentes e ajustar a taxa de fluxo até que a taxa limite é de aproximadamente 3.000 a 4.000 eventos / segundo. Defina o tipo de precisão "inicial" e últimaly "afinar" na janela "Ordenar disposição". Selecione o filtro óptico e classificar esferas. Ajustar a gota Atraso até ~ 100% são classificados para a esquerda.
          Nota: Este passo é crítico para certificar-se que as células de interesse espécie numa corrente de lado. Os grânulos e o filtro óptico são usados ​​para alcançar perto de um desvio de gotículas de 100%.
15. Coloque um ND (densidade neutra) filtro FSC 1.5 na extremidade esquerda do bloco detector FSC. Defina a extensão de janela para 2,00 ms e a escala FSC Área de 1,00 (no separador "Laser" na janela "Cytometer").
16. Antes de carregar o tubo de ensaio, colocar um filtro de linha de amostra de 50 um na extremidade da linha de amostra para evitar a aglomeração. Para fazer isso, selecione "Alterar Filtro de exemplo" no menu "Cytometer".
17. Teste a composição da amostra de fluido para alcançar uma boa separação sem abanando entre fluxo de lado e para impedir as células de degola para a Polipropiletubos ne.
    1. Coloque o tubo de amostra, ative as placas de deflexão e selecione "Test tipo" com a gaveta fechada. Olhe para fluxos secundários se a separação ocorre sem muito Fanning.
       Nota: A ventilação é provavelmente devido a uma elevada concentração de proteínas no tampão de amostra.
18. Coloque o tubo de amostra no instrumento FACS. Seleccionar uma amostra de agitação de 300 rpm e uma temperatura de amostra de 4 ° C. Selecione "Obter dados" no "Aquisição Dashboard".
19. Se necessário, diluir a amostra para alcançar uma taxa de eventos apropriado para um máximo de 5000 eventos / s (a uma taxa de fluxo máxima de 3.0). Estritamente respeitar estes limites de modo a manter a pureza das células separadas.
20. Para analisar e classificar as células, otimizar o valor limite FSC para eliminar detritos, sem interferir com a população de interesse. Em escala logarítmica, ajustar a tensão do detector de tubo foto-multiplicador (PMT), com o filtro de 530/30, a fim de fazer-se que o sinal de fluorescência da população total se encaixa dentro da escala, e portão na população positiva (Figura 1, porta 1).
21. Produzir um Scatter-área Forward (FSC-A) área-Side Scatter / (SSC-A) parcela da população positiva SYTO16 e ajustar o FSC-A para cerca de 110 V na escala linear, eo SSC-A para cerca de 150 V em escala logarítmica para visualizar todos os eventos enquanto excluindo muito grandes células e agregados celulares.
22. Na janela "Ordenar Layout", defina o "Classificar Precision Mode" para "pureza 4-way" (máscara Rendimento: 0, Máscara Pureza: 32, máscara de fase: 0). Selecione "Continuous" no menu "alvo Eventos" para triagem contínua.
23. Adicionar populações para classificar no campo correspondente aos tubos (na janela "Ordenar Layout"). Populações lugar com freqüências mais elevadas no meio e aqueles com freqüências mais baixas nas extremidades. Defina as placas de tensão a 2.500 V. Durante a triagem, manter a coleta de amostra tUBEs no gelo.

4. celular Seleção

1. Imediatamente antes da classificação, as células de filtro usando um filtro de 50 mm em uma previamente revestida 5 ml de polipropileno rodada tubo inferior.
2. Lavar o filtro extensivamente com 1-2 ml de tampão de triagem.
3. Células germinativas Ordenar fixas usando um classificador de células 488 nm equipado com laser seguindo o esquema gating detalhado na Figura 1. Recolha frações purificadas em 5 ml de polipropileno tubos de fundo redondo previamente revestidas no ponto 1 no gelo.
   1. Certifique-se de que 100-200 uL de SBF é mantido no interior dos tubos de recolha, para evitar a aderência das células escolhidas para a parede do tubo.
   2. Certifique-se de que a concentração de saturação é SYTO16 para evitar flutuações de fluorescência durante o período de triagem. SYTO16 está saturando quando não há nenhuma outra variação de intensidade da coloração de células no Alexa Fluor 488 parâmetro (coloração de DNA) nos gráficos de triagem. Se necessário, adicione 1 ml deSYTO16 para o tubo de triagem para atingir a saturação.
   3. Mostrar o total de eventos em um gráfico mostrando os seguintes parâmetros: número de eventos vs Alexa Fluor 488-A.
   4. Seleccionar as células positivas de coloração de ADN com uma porta, como mostrado na Figura 1.
      1. Células Mostrar os porta 1 em um gráfico utilizando SSC-A vs FSC-A como parâmetros
         1. Selecione as células com Gate 2, como mostrado na Figura 1.
         2. Células Mostrar os Gate 2 em um gráfico usando FSC-A vs Alexa Fluor 488-A como parâmetros.
         3. Selecione as células com portão 5 e 6 no Portão Gate 2 gráfico, como mostrado na Figura 1.
         4. Exibir separadamente Portão 5 e 6 no Portão gráficos usando Alexa Fluor 488-W vs Alexa Fluor 488-A como parâmetros.
         5. Selecionar spermiogenesis passos 1-9 espermátides no Portão 5 gráfico e spermiogenesis passos 10-12 espermátides no portão 6 ilustrações, como mostrado na Figura 1.
      2. Displaycélulas do portão 1 em um gráfico usando FSC-A vs Alexa Fluor 488-A como parâmetros
         1. Selecione as células com Portão 3 e Gate 4, como mostrado na Figura 1.
         2. Exibir separadamente Portão 3 e Gate 4 de gráficos usando Alexa Fluor 488-W vs Alexa Fluor 488-A como parâmetros.
         3. Selecionar spermiogenesis passos 13-14 espermátides no gráfico Portão 3 e spermiogenesis passos 15-16 espermátides no gráfico Gate 4, como mostrado na Figura 1.

Resultados

Gating estratégia utilizada com citometria de fluxo

A Figura 1 representa a estratégia utilizada gating em citometria de fluxo para classificar quatro populações espermátide altamente puros. Resumidamente, as células com coloração positiva de ADN (Alexa Fluor 488-A) são primeiro seleccionadas com portão 1. Espermátides de spermiogenesis etapas 1-12 são seleccionado (porta 2) sobre um gráfico de po...

Discussão

Células espermatogênicas foram sempre um desafio para o estudo, dada a complexidade do epitélio seminífero, bem como o sucesso limitado de cultura in vitro. Ao longo dos anos, muitas abordagens para purificar as células germinais de diferentes espécies foram desenvolvidos. Técnicas de sedimentação utilizando purificação gravidade com Percoll ou gradientes de albumina do soro bovino geralmente oferecem um bom rendimento de células germinais intactas, mas falta definição adequada entre alguns tipos ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Isoflurane	ABBOT	05260-05	For mouse anesthesia before euthanasia
Fetal bovine serum	Wisent	90150	For tube coating
1x PBS
EDTA	BioShop	EDT	For sorting buffer preparation
HEPES	Sigma	H	For sorting buffer preparation
100% Ethanol	Les alcools de commerce	092-09-11N	For cell fixation
SYTO 16	Life Technologies	S7578	DNA staining
5 ml polypropylene round bottom tubes	BD Falcon	352063	Sorted cells collection
15 ml polypropylene conical bottom tubes	PROgene	1500
50 ml polypropylene conical bottom tubes	PROgene	5000
TEC4 anaesthetic vaporizer	Ohmeda	1160526	For mouse euthanasia
CO2 gas tank	Praxair	C799117902	For mouse euthanasia
O2 gas tank	Praxair	O254130501	For mouse euthanasia
Homemade mouse gas chamber			For mouse euthanasia
40 µm Falcon cell strainer	Corning Incorporated	352340
50 μm sample line filters	BD Biosciences	649049
Vortex mixer	Labnet international, inc.	S0200	For cell fixation
Dynac centrifuge	Clay Adams	101
Celltrics 50 µm filters	Partec	04-004-2327
488 nm laser-euipped cell sorter	BD Biosciences	FACSAria III
Accudop Fluorescent Beads	BD Biosciences	345249
Sorting Buffer: 1x PBS, 1 mM EDTA pH 8.0, 25 mM HEPES pH 7.0, 1% FBS			FBS is heat-inactivated. Make fresh solution, 0.22 μm filtered and keep at 4°C.