שלב מסוים מיון של Spermatids העכבר על ידי cytometry הזרימה

Summary

We describe a sorting strategy for mouse spermatids using flow cytometry. Spermatids are sorted into four highly pure populations, including round (spermiogenesis steps 1-9), early elongating (spermiogenesis steps 10-12), late elongating (spermiogenesis steps 13-14) and elongated spermatids (spermiogenesis steps 15-16). DNA staining, size and granulosity are used as selection parameters.

Abstract

הבידול של spermatids העכבר הוא תהליך קריטי אחד לייצור תא מין זכרי פונקציונלי עם הגנום שלם כדי להיות מועבר לדור הבא. עד כה, מחקרים מולקולריים של מעבר מורפולוגיים זה כבר הקשו על ידי חוסר שיטה המאפשרת הפרדה נאותה של צעדים החשובים אלה של בידול spermatid לניתוחים שלאחר מכן. הניסיונות קודמים בgating התקין של תאים אלה באמצעות cytometry זרימה ייתכן שהיו קשים בגלל עלייה מוזרה בקרינת ה- DNA בspermatids עובר שיפוץ הכרומטין. המבוססים על התבוננות זו, אנו מספקים פרטים של זרימה פשוטה cytometry תכנית, המאפשרים טיהור שחזור של ארבע אוכלוסיות של spermatids עכבר קבוע עם אתנול, המייצג כל מדינה אחרת בתהליך שיפוץ הגרעיני. העשרת אוכלוסייה אישרה באמצעות סמני צעד ספציפי וקריטריונים מורפולוגיים. Spermatids המטוהר יכול לשמש להגנומי וproteomIC ניתוחים.

Introduction

Haploid round spermatids differentiate into spermatozoa by a process called spermiogenesis. This involves many different steps including the acquisition of a flagellum, chromatin and cytoskeleton remodeling, condensation of the nucleus as well as the loss of most of the cytoplasm. These unique cellular events must be finely regulated in order to produce a mature functional gamete with an intact genome suitable for fertilization. Spermiogenesis can hardly be studied in vitro since no reliable cell culture system has so far been able to support progression through the different steps of the process. Moreover, actual in vitro techniques lead to a poor yield^1,2. In vivo, proper transitions through the different steps of spermiogenesis are crucial for the natural functional integrity of the male gamete. Successful purification of spermatids according to their differentiation steps has never been accomplished with a level of enrichment sufficient to allow molecular characterization of spermiogenesis. For instance, purification of key steps of the spermatidal differentiation would be especially useful to study the developing acrosome, formation of the midpiece³, cell junction dynamics⁴, RNA dynamics⁵, chromatin remodeling process^6,7 or genomic stability⁸. Purification of spermatids has been hampered by their progressive morphological transformation, the lack of known stage-specific external biomarkers, and their peculiar shape and size.

Although most male germ cells display a direct relationship between DNA staining and ploidy (DNA content), we noticed that such positive correlation is no longer applicable to spermatids. This stems from our early observation that seminiferous tubule sections show variable intensity of DNA staining throughout the different spermiogenesis steps. Although DNA staining is consistent with their haploid set of chromosomes from spermiogenesis steps 1 to 7 (round spermatids), we observed a sharp increase in fluorescence intensity with DAPI or SYTO 16 around the onset of nuclear reorganization and chromatin remodeling (spermiogenesis step 8) reaching a peak at the onset of nuclear condensation (spermiogenesis steps 11-12). Following condensation of the nucleus, DNA staining intensity decreases until spermiation (spermiogenesis step 16). We surmised that this was likely associated with the formation of their peculiar chromatin structure transition where histones are replaced by protamines. We therefore developed a reliable flow cytometry method that allows the separation of spermatids using the variation of DNA intensity of spermatids as a main selection parameter.

A simple flow cytometry approach is described to separate mouse spermatids with high purity (95-100%) based on their apparent DNA content (SYTO16 staining), size and granulosity. Spermatids are separated into four populations; spermiogenesis steps 1-9, 10-12, 13-14 and 15-16. Purified spermatids are suitable for genetic/genomic analysis, as well as proteomic applications as described in a recent publication from our group⁹.

Protocol

טיפול בבעלי חיים היה בהתאם לועדת טיפול בבעלי החיים ושימוש Université de שרברוק.

1. Tube הכנה

1. היום לפני מיון תא, להוסיף 1-2 מיליליטר של סרום שור עוברי חום מומת (FBS) עד 5 צינורות עגולים תחתון מיליליטר פוליפרופילן, ועד 15 מיליליטר ו -50 מיליליטר צינורות חרוטי פוליפרופילן.
   צעד קריטי: ודא שכל צינור המשמש בפרוטוקול הוא מצופה.
   הערה: ציפוי FBS מונע בתאי נבט מלהידבק לקירות צינור.
2. לאט לאט לערבב O / N על ידי היפוך על 4 מעלות צלזיוס למעייל הצינורות אחידות באמצעות הכתף.
3. למחרת, להסיר FBS מצינורות מצופים באמצעות אחסון.
   1. * צעד קריטי: ודא שצינורות עגולים תחתון פוליפרופילן 5 מיליליטר ו -15 ו -50 מיליליטר הצינורות המשמשים להכנת תא (פרוטוקול הצעדים 2.1-2.11) הם רוקנו לחלוטין של FBS למנוע פנינג (כלומר, סטייה מדויקת של הזרמים בצד). להשתמש pipet P200 להסיר FBS.
      הערה: FBS שיורי בצינורות לפני המיון עלול להוביל לאובדן של תאים או זיהום של צינורות אחרים המשמשים במיון תא,
   2. השאר נפח שייר קטן של FBS (על 100-200 μl) בפוליפרופילן 5 מיליליטר עגול צינורות תחתון המשמשים לאיסוף תאים מטוהרים.

2. תא הכנה

1. להקריב עכבר אחד גברים בהרדמה באמצעות O ₂ / isoflurane (אינדוקציה 5% ולאחר מכן שמרו על 2%) ואחריו CO ₂ מחנק.
2. בלו וdecapsulate שני האשכים ובררו עם מספריים קטנים ב500 μl מיון חיץ לתוך צינור 1.5 מיליליטר.
3. תאי נבט סומק מtubules seminiferous ידי pipetting למעלה ולמטה העדין בצינור 1.5 מיליליטר, ראשון עם טיפ μl קטוע 100-1,000, ולאחר מכן עם קצה 100-1,000 μl שלם.
4. להסיר שאריות וגושים אחרים צעד סינון אחד באמצעות מסננת תא 40 מיקרומטר ולאסוף תסנין לתוך קודם צינור חרוטי 50 מיליליטרiously מצופה FBS בשלב 1.
5. שטוף את המסנן פעם אחת עם המיון עד נפח כולל של 3 מיליליטר ותסנין העברה לתוך צינור חרוטי 15 מיליליטר המצופה בעבר בשלב 1 חיץ.
6. להוסיף 16 μl של 50 מ"מ EDTA pH 8 למיליליטר של השעיה תא (48 μl ל3 מיליליטר) כדי להשיג ריכוז סופי של 0.8 מ"מ EDTA.
7. כדי לתקן תאי נבט, לאט להוסיף 3 כרכים של אתנול 100% קרים כקרח באמצעות pipet 10 מיליליטר עם תסיסה עדינה (מערבולת במהירות נמוכה), אשר יפיק השעיה חלבית.
   צעד קריטי: הוספת אתנול לאט לאט הוא חיוני וחשוב לשמירה על שלמות תא ההכנה. אנחנו ציינו כי בנוסף מהירים של אתנול גורם תמוגה תא וכתוצאה מכך לירידה גדולה של מיון יעילות. להשעית תא 3 מיליליטר, 9 מיליליטר של אתנול יש להוסיף בכ 1 דק '.
8. דגירה תאים על קרח למשך 15 דקות עם ערבוב מדי פעם על ידי היפוך.
9. ההשעיה צנטריפוגה התא ב 800 XG במשך 5 דקות ולהסיר ברורsupernatant.
10. בעדינות resuspend תאי נבט הקבוע ב 2 מיליליטר של חיץ מיון.
11. הוסף 4 μl של צבע SYTO16 DNA (פתרון 1 מ"מ בDMSO) ודגירה של לפחות 30 דקות (מוגנות מפני אור).
    הערה: תוצאות המיון הטובות ביותר מתקבלות באמצעות SYTO16 שכן הוא צבע DNA חדיר שמשולב בקלות לתוך הגרעינים דחוסים מאוד של spermatids.

סדרן 3. תא הגדרה

הערה: הנה, 4-לייזר (ננומטר 405 - סגולה, 488 ננומטר - הכחול, 561 ננומטר - ננומטר צהוב-ירוק, 633 - אדום) 20-פרמטר סדרן תא BDFACSAria III משמש. תוכנת BD FACSDiva 6.1.3 משמשת כדי לחזות ולנתח את הנתונים. ההגדרות עשויות להשתנות בהתאם לסוג של סדרן בשימוש.

1. לעקר את סדרן FACS ידי הפעלת 70% אתנול כנוזל נדן במהלך הליך כיבוי fluidics (תפריט "Cytometer" בתוכנה) לפני המיון. בחר "Cytometer" בסרגל הכלים של התוכנה ולבחור "sh fluidicutdown ". בצע את השלבים שהוזכרו על ידי התהליכים.
2. הכן ולסנן 1x PBS עם מסנן 0.22 מיקרומטר כדי לחסל את כל גבישים ומזהמים. מלא את מיכל הנדן לקו הריתוך העליון בצד הפנימי של הטנק.
3. הפעל את התוכנה ולהתחבר. התחל סדרן FACS להתחמם הלייזרים לפחות 30 דקות לפני המיון. להפעיל שני תהליכי הפעלת fluidic כדי לשטוף את אתנול מfluidics. בחר "Cytometer" בסרגל הכלים של התוכנה ובחר "הפעלת fluidic". בצע את השלבים שהוזכרו על ידי התהליכים.
   הערה: זו משחזרת fluidics עם נוזל נדן רגיל (1x PBS).
4. נקה את בלוק המיון וצלחות סטייה במים מזוקקים ומייבש אותם ביסודיות. Sonicate זרבובית 100 מיקרומטר להציב צינור של מים מזוקקים למשך 2 דקות באמבט sonication. נגב את הזרבובית ביסודיות.
5. הכנס את זרבובית 100 מיקרומטר לתוך תא הזרימה ולהפוך את כיוון השעון ידית נעילה-חרירים ל -12עמדת שעות. הגדר את לחץ הנדן עד 20 psi.
6. הפעל את הזרם ולהתאים את המשרעת להשיג ערכי יעד לתדר (כ -30), ירידה של 1 (כ -150) וגאפ (סביב 12) ולהקים דפוס breakoff אגל יציב (טיפות כמה לווין). כבה את הנחתה.
7. ודא שהזרם ישר ופוגע במרכז aspirator הפסולת על ידי שינוי הזווית של בלוק הסוג. הערה: זרבובית 130 מיקרומטר ב 10 psi גם נבדקה ולא נמצאים הבדל ברור נמצא.
8. עיכוב הגדר לייזר ל0 ל-77.39 הכחולים, לאדומים, 37.33 לסגולים ו-39.85 ללייזרים צהובים-ירוקים.
9. אזורי סט קנה מידה ל1.14 ל1.0 הכחול, לאדום, 0.75 לסגול ו0.96 ללייזרים צהובים-ירוקים.
10. באמצעות מיון מבחן (בחלון "צד הזרם" של התוכנה), לוודא שזרמי הצד אינם מלבים. בחלון "צד הזרם", להתאים את מחווני המתח של כל זרם בצד, כך שהם פגעו בmiddlדואר של צינור איסוף מבחן. אם זרם המרכז הוא לא חזק, להתאים את ^nd 2, 3 ^rd, ו -4 הגדרות ירידה ^ה כדי להגביל את הזרם המרכזי.
11. התחל התקנת Cytometer ויישום המעקב (CS & T) בתוכנה (תפריט "Cytometer").
12. השתמש בחרוזי ההתקנה ומעקב cytometer בירידה של 1 לμl 350 כדי להפוך את האפיון והמעקב של ביצועי cytometer באמצעות הוראות יצרן.
13. צא יישום CS & T. להחיל הגדרת CS & T, לוודא הפרמטרים הזרם עדיין לאפשר דפוס breakoff אגל יציב, ולהפעיל את כפתור ספוט המתוק כמתואר בהוראות יצרן (ב" חלון Breakoff ").
14. לייעל את הערך זרוק העיכוב באמצעות חרוזי ניאון (ראה טבלה של חומרים).
    1. התקן את צינורות האיסוף בבעל. פתח את הדלת לחסום סוג. בחלון "צד הזרם", להפעיל מתח ולאחר מכן בחר "סוג מבחן "ולחץ על לחצן aspirator המגירה כדי לפתוח את המגירה ויש להם גישה לצינורות האיסוף.
    2. לייעל את זרמי הצד ולכן הם הולכים למרכז של הצינור. התאם ערכים ומחוונים בהתאם לצורך.
    3. סגור את הדלת לחסום סוג ולוודא להתאים את חיוג מיקרומטר להשיג נקודת חרוז הבהירה במרכז. מגירה בטל פסולת, סוג מבחן ומתח. הסר את צינורות האוסף.
    4. לייעל את עיכוב הירידה בהתאם להוראות יצרנים.
       1. בקצרה, לנער בקבוקון חרוז במרץ ולדלל 1 טיפה של חרוזים ב 0.5 מיליליטר של PBS.
       2. שימוש בהוראות יצרנים, להגדיר את עיכוב הירידה באמצעות תבנית ניסוי טיפת העיכוב זמינה בתוכנה. לחלופין, השתמש בתכונת Auto גלילת העיכוב להגדיר את עיכוב הירידה.
       3. טען את השפופרת של חרוזי ניאון ולהתאים את קצב הזרימה עד שיעור הסף הוא ~ 3,000 ל- 4,000 אירועים / שני. הגדר את דיוק סוג ל" ראשוני "ואחרוןly ל" מנגינת פיין "בחלון" פריסת מיין ". בחר את המסנן האופטי ולמיין חרוזים. התאם את העיכוב בגלילה עד ~ 100% מסודרים משמאל.
          הערה: שלב זה הוא קריטי כדי לוודא שתאים מסוג הריבית לזרם צד. חרוזים והמסנן האופטי המשמשים להשגה קרובה לסטייה טיפת 100%.
15. הנח ND מסנן FSC 1.5 (צפיפות ניטראלית) בקצה השמאלי של בלוק גלאי FSC. הגדר את הארכת החלון עד 2.00 מייקרו-שני ואת קנה המידה פינת FSC ל1.00 (בכרטיסייה "הלייזר" בחלון "Cytometer").
16. לפני טעינת צינור מדגם, מקום בשורת מסנן מדגם של 50 מיקרומטר בסוף קו המדגם, כדי למנוע בצעדים כבדים. כדי לעשות זאת, בחר באפשרות "שנה סינון לדוגמא" בתפריט "Cytometer".
17. בדוק את הרכב נוזל המדגם כדי להשיג הפרדה טובה בלי ללבות בין זרם צד ולמנוע את התאים יידבקו לpolypropyleצינורות ne.
    1. טען את צינור המדגם, להדליק את צלחות הסטייה ובחר "סוג המבחן" עם המגירה סגורה. תראה זרמי צד אם הפרדה מתרחשת בלי יותר מדי פנינג.
       הערה: פנינג הוא כנראה עקב ריכוז גבוה של חלבון במאגר המדגם.
18. טען את צינור המדגם לתוך מכשיר FACS. בחר תסיסה מדגם של 300 סל"ד וטמפרטורת מדגם של 4 מעלות צלזיוס. בחר "רוכשת את הנתונים" ב" רכישת לוח המחוונים ".
19. במידת צורך, לדלל את המדגם כדי להשיג קצב אירוע מתאים למקסימום של 5,000 אירועים / שניות (בקצב זרימה מקסימאלי של 3.0). בהחלט מכבד את הגבולות האלה כדי לשמור על טוהר התאים הממוינים.
20. כדי לנתח ולמיין את התאים, לייעל את ערך סף FSC לחסל פסולת בלי להתערב עם האוכלוסייה של עניין. בסולם לוגריתמים, להתאים את המתח של גלאי צינור צילום מכפיל (PMT) עם מסנן 530/30 על מנת להפוך אתבטוח שאות הקרינה מכלל האוכלוסייה מתאימה בקנה המידה, ושער על האוכלוסייה החיובית (איור 1, שער 1).
21. לייצר קדימה פיזור-אזור / פיזור-שטח צד (FSC-) עלילה (SSC-) של האוכלוסייה החיובית SYTO16 ולהתאים את FSC-לכ 110 V בקנה המידה ליניארי, וSSC-לכ -150 V בקנה מידת לוגריתמים כדי להמחיש את כל האירועים תוך נטרול תאים מאוד גדולים ואגרגטים תא.
22. ב" מיין פריסה "החלון, להגדיר את" מיין Precision מצב "ל" טוהר 4-דרך" (מסכת תשואה: 0, מסכה טוהר: 32 מסכה שלב,: 0). בחר באפשרות "רציף" מתפריט "אירועי יעד" למיון רציף.
23. להוסיף אוכלוסיות למיין בתחום המתאים לצינורות (ב" מיין פריסה "החלון). אוכלוסיות מקום עם תדרים גבוהים יותר באמצע ואלה עם תדרים נמוכים בקצוות. הגדר את צלחות המתח עד 2500 V. במיון, לשמור t אוסף המדגםubes על קרח.

4. מיון תא

1. מייד לפני המיון, תאי סינון באמצעות מסנן 50 מיקרומטר פוליפרופילן 5 מיליליטר מצופה בעבר סיבוב צינור תחתון.
2. שטוף את המסנן בהרחבה עם 1-2 מיליליטר של חיץ מיון.
3. תאי נבט מיין קבועים באמצעות סדרן תא 488 ננומטר מצויד לייזר הבא תכנית gating המפורטת באיור 1. לאסוף את השברים מטוהרים בצינורות עגולים תחתון 5 מיליליטר פוליפרופילן המצופה בעבר בסעיף 1 על קרח.
   1. ודא ש100-200 μl של FBS נשמר בצינורות האיסוף, כדי למנוע הידבקות של התאים הממוינים לקיר הצינור.
   2. ודא כי ריכוז SYTO16 הוא להרוות כדי למנוע תנודות הקרינה במהלך תקופת המיון. SYTO16 הוא להרוות כאשר אין וריאציה נוספת של עוצמת מכתים תא ב488 פרמטר (מכתים DNA) אלקסה פלואוריד בגרפיקה המיון. במידת צורך, להוסיף 1 μl שלSYTO16 לצינור המיון להגיע לרוויה.
   3. הצג את האירועים הכולל על גרפי המציג את הפרמטרים הבאים: מספר האירועים לעומת אלקסה פלואוריד 488-A.
   4. בחר את תאי צביעת DNA החיוביים עם שער 1, כפי שמוצג באיור 1.
      1. תאי תצוגה מהשער 1 בגרפי באמצעות SSC-לעומת FSC-כפרמטרים
         1. בחר את התאים עם שער 2, כהראה באיור 1.
         2. תאי תצוגה משער 2 בגרפי באמצעות FSC-vs אלקסה פלואוריד 488-כפרמטרים.
         3. בחר תאים עם שער 5 ושער 6 בשער 2 גרפיים, כהראה באיור 1.
         4. להציג בנפרד שער 5 ושער 6 בגרפיקה באמצעות אלקסה פלואוריד 488-W לעומת אלקסה פלואוריד 488-כפרמטרים.
         5. spermiogenesis בחר צעדים 1-9 spermatids על גרפי שער 5 וspermiogenesis צעדים 10-12 spermatids על גרפיקת 6 השער, כפי שהראה באיור 1.
      2. לְהַצִיגתאים מהשער 1 בגרפי באמצעות FSC-vs אלקסה פלואוריד 488-כפרמטרים
         1. בחר תאים עם שער 3 ושער 4, כהראה באיור 1.
         2. להציג בנפרד שער 3 ושער 4 בגרפיקה באמצעות אלקסה פלואוריד 488-W לעומת אלקסה פלואוריד 488-כפרמטרים.
         3. spermiogenesis בחר צעדים 13-14 spermatids על גרפי שער 3 וspermiogenesis צעדים 15-16 spermatids על גרפי שער 4, כהראה באיור 1.

תוצאות

אסטרטגית gating שימוש עם cytometry הזרימה

איור 1 מייצג את אסטרטגית gating המשמשת בcytometry הזרימה למיין ארבע אוכלוסיות spermatid טהורות ביותר. בקצרה, תאים עם מכתים DNA חיובי (אלקסה פלואוריד 488-A) נבחר ראשון...

Discussion

תאי זרע ראשוניים תמיד היו מאתגרים ללמוד בהתחשב במורכבות של אפיתל seminiferous, כמו גם ההצלחה המוגבלת של תרבות במבחנה. במהלך השנים, גישות רבות כדי לטהר תאי נבט ממינים שונים פותחו. טכניקות שקיעה באמצעות טיהור הכבידה עם Percoll או הדרגתיים אלבומין בסרום שור בדרך כלל מספקות ת...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Isoflurane	ABBOT	05260-05	For mouse anesthesia before euthanasia
Fetal bovine serum	Wisent	90150	For tube coating
1x PBS
EDTA	BioShop	EDT	For sorting buffer preparation
HEPES	Sigma	H	For sorting buffer preparation
100% Ethanol	Les alcools de commerce	092-09-11N	For cell fixation
SYTO 16	Life Technologies	S7578	DNA staining
5 ml polypropylene round bottom tubes	BD Falcon	352063	Sorted cells collection
15 ml polypropylene conical bottom tubes	PROgene	1500
50 ml polypropylene conical bottom tubes	PROgene	5000
TEC4 anaesthetic vaporizer	Ohmeda	1160526	For mouse euthanasia
CO2 gas tank	Praxair	C799117902	For mouse euthanasia
O2 gas tank	Praxair	O254130501	For mouse euthanasia
Homemade mouse gas chamber			For mouse euthanasia
40 µm Falcon cell strainer	Corning Incorporated	352340
50 μm sample line filters	BD Biosciences	649049
Vortex mixer	Labnet international, inc.	S0200	For cell fixation
Dynac centrifuge	Clay Adams	101
Celltrics 50 µm filters	Partec	04-004-2327
488 nm laser-euipped cell sorter	BD Biosciences	FACSAria III
Accudop Fluorescent Beads	BD Biosciences	345249
Sorting Buffer: 1x PBS, 1 mM EDTA pH 8.0, 25 mM HEPES pH 7.0, 1% FBS			FBS is heat-inactivated. Make fresh solution, 0.22 μm filtered and keep at 4°C.