Schritt spezifische Sortierung der Maus Spermatiden durch Durchflusszytometrie

Zusammenfassung

We describe a sorting strategy for mouse spermatids using flow cytometry. Spermatids are sorted into four highly pure populations, including round (spermiogenesis steps 1-9), early elongating (spermiogenesis steps 10-12), late elongating (spermiogenesis steps 13-14) and elongated spermatids (spermiogenesis steps 15-16). DNA staining, size and granulosity are used as selection parameters.

Zusammenfassung

Die Differenzierung der Maus Spermatiden eines kritischen Verfahren zur Herstellung einer funktionellen männlichen Keimzellen mit intakter Genoms auf die nächste Generation übertragen werden. Bisher wurden molekulare Studien dieser morphologischen Übergang durch das Fehlen eines Verfahrens ermöglicht eine angemessene Trennung dieser wichtigen Schritte spermatid Differenzierung für nachfolgende Analysen behindert. Frühere Versuche zur richtigen Gating dieser Zellen mittels Durchflusszytometrie kann schwierig gewesen, weil der eine eigentümliche Steigerung der DNA-Fluoreszenz in Spermatiden unterziehen Chromatin-Remodeling. Basierend auf dieser Beobachtung, bieten wir die Details eines einfachen Durchflusszytometrie Schema, wodurch reproduzierbare Reinigung von vier Populationen mit Ethanol fixiert Maus Spermatiden, die jeweils einen anderen Zustand in der Kernumbauprozess. Bevölkerung Anreicherung mit Schritt-spezifische Marker und morphologischen Kriterien bestätigt. Die gereinigten Spermatiden für Genom- und Proteom verwendet werdenic-Analysen.

Einleitung

Haploid round spermatids differentiate into spermatozoa by a process called spermiogenesis. This involves many different steps including the acquisition of a flagellum, chromatin and cytoskeleton remodeling, condensation of the nucleus as well as the loss of most of the cytoplasm. These unique cellular events must be finely regulated in order to produce a mature functional gamete with an intact genome suitable for fertilization. Spermiogenesis can hardly be studied in vitro since no reliable cell culture system has so far been able to support progression through the different steps of the process. Moreover, actual in vitro techniques lead to a poor yield^1,2. In vivo, proper transitions through the different steps of spermiogenesis are crucial for the natural functional integrity of the male gamete. Successful purification of spermatids according to their differentiation steps has never been accomplished with a level of enrichment sufficient to allow molecular characterization of spermiogenesis. For instance, purification of key steps of the spermatidal differentiation would be especially useful to study the developing acrosome, formation of the midpiece³, cell junction dynamics⁴, RNA dynamics⁵, chromatin remodeling process^6,7 or genomic stability⁸. Purification of spermatids has been hampered by their progressive morphological transformation, the lack of known stage-specific external biomarkers, and their peculiar shape and size.

Although most male germ cells display a direct relationship between DNA staining and ploidy (DNA content), we noticed that such positive correlation is no longer applicable to spermatids. This stems from our early observation that seminiferous tubule sections show variable intensity of DNA staining throughout the different spermiogenesis steps. Although DNA staining is consistent with their haploid set of chromosomes from spermiogenesis steps 1 to 7 (round spermatids), we observed a sharp increase in fluorescence intensity with DAPI or SYTO 16 around the onset of nuclear reorganization and chromatin remodeling (spermiogenesis step 8) reaching a peak at the onset of nuclear condensation (spermiogenesis steps 11-12). Following condensation of the nucleus, DNA staining intensity decreases until spermiation (spermiogenesis step 16). We surmised that this was likely associated with the formation of their peculiar chromatin structure transition where histones are replaced by protamines. We therefore developed a reliable flow cytometry method that allows the separation of spermatids using the variation of DNA intensity of spermatids as a main selection parameter.

A simple flow cytometry approach is described to separate mouse spermatids with high purity (95-100%) based on their apparent DNA content (SYTO16 staining), size and granulosity. Spermatids are separated into four populations; spermiogenesis steps 1-9, 10-12, 13-14 and 15-16. Purified spermatids are suitable for genetic/genomic analysis, as well as proteomic applications as described in a recent publication from our group⁹.

Protokoll

Tierpflege war in Übereinstimmung mit der Université de Sherbrooke Animal Care und Verwenden Ausschuss.

1. Rohrvorbereitung

1. Am Tag vor der Zellsortierung, 1-2 ml hitzeinaktiviertem fötalem Rinderserum (FBS) zu 5 ml-Polypropylenröhrchen mit rundem Boden und auf 15 ml und 50 ml-Polypropylen-konischen Röhrchen.
   Critical Schritt: Stellen Sie sicher, dass jedes Rohr in der Protokoll ist beschichtet.
   Hinweis: FBS Beschichtung verhindert Keimzellen vom Kleben an Rohrwänden.
2. Langsam Einmischen O / N durch Inversion bei 4 ° C zur Beschichtung der Rohre gleichförmig unter Verwendung eines Rotators.
3. Am nächsten Tag, entfernen FBS aus beschichteten Röhrchen durch Dekantieren.
   1. * Critical Schritt: Stellen Sie sicher, dass die 5-ml-Polypropylenrundrohre und die 15 und 50-ml-Röhrchen für Zellzubereitung verwendet (Protokoll Schritte 2,1-2,11) vollständig von FBS zu entleeren, um Fanning (dh ungenaue Abweichung der Seitenströme) zu verhindern. Verwenden Sie ein P200-Pipette, um die FBS zu entfernen.
      Hinweis: Rest FBS in Rohren vor dem Sortieren kann zu einem Verlust von Zellen oder Kontamination anderer Rohre während der Zellsortierung verwendet werden, führen,
   2. Lassen Sie eine kleine Restvolumen von FBS (etwa 100-200 & mgr; l) in der 5 ml-Polypropylen-Rundbodenröhrchen zum Sammeln gereinigten Zellen verwendet.

2. Zellpräparation

1. Opfern eine männliche Maus unter Narkose mit _O 2 / Isofluran (Induktion bei 5% dann bei 2% gehalten), gefolgt von _CO 2 Ersticken.
2. Verbrauchsteuern und decapsulate beide Hoden und Hackfleisch mit einer kleinen Schere in 500 ul Sortierpuffer in ein 1,5-ml-Tube.
3. Flush Keimzellen aus Samenleiter durch leichtes nach oben und unten Pipettieren in der 1,5-ml-Röhrchen, zuerst mit einer abgeschnittenen 100-1000 ul Spitze, und dann mit einem intakten 100-1000 ul Spitze.
4. Entfernen Sie die Ablagerungen und Klumpen von einem Filtrationsschritt unter Verwendung eines 40 & mgr; m Zellsieb und sammeln Filtrat in das 50 ml konischen Röhrchen zurückiously mit FBS in Schritt 1 überzogen.
5. Das Filter einmal zu waschen mit Sortierpuffer bis zu einem Gesamtvolumen von 3 ml und Transfer Filtrat in 15 ml konischen Röhrchen zuvor in Schritt 1 beschichtet.
6. 16 ul 50 mM EDTA pH 8 pro ml Zellsuspension (48 & mgr; l für 3 ml), um eine Endkonzentration von 0,8 mM EDTA erhalten.
7. Um dies zu beheben Keimzellen, langsam 3 Volumina eiskaltem 100% Ethanol mit einem 10-ml-Pipette unter leichtem Schütteln (Vortex bei niedriger Geschwindigkeit), die eine milchige Suspension erzeugt.
   Kritischer Schritt: Langsame Zugabe Ethanol ist entscheidend und wichtig, um die Integrität der Zellpräparation zu erhalten. Wir haben festgestellt, dass eine schnelle Zugabe von Ethanol verursacht Zelllyse was zu einer großen Abnahme der Sortiereffizienz. Für einen 3 ml Zellsuspension sollte 9 ml Ethanol in ca. 1 min zugefügt werden.
8. Inkubieren Zellen auf Eis für 15 min unter gelegentlichem Mischen durch Umdrehen.
9. Centrifuge Zellsuspension bei 800 xg für 5 min und entfernen Sie die klareÜberstand.
10. Vorsichtig resuspendieren festen Keimzellen in 2 ml Sortierpuffer.
11. In 4 ul SYTO16 DNA-Farbstoff (1 mM Lösung in DMSO) und Inkubation für mindestens 30 min (lichtgeschützt).
    Hinweis: Die besten Ergebnisse werden mit Sortier SYTO16 da es eine durchlässige DNA-Farbstoff, der leicht in die stark verdichteten Kerne von Spermatiden eingebaut erhalten.

3. Cell Sorter einrichten

Hinweis: Hier ein 4-Laser (405 nm - violett, 488 nm - blau, 561 nm - gelb-grün, 633 nm - rot) 20-Parameter BDFACSAria III Zellsortierer verwendet. Der BD FACSDiva 6.1.3 Software dient zur Visualisierung und Analyse der Daten. Die Einstellungen können abhängig von der Art von Sortierer variieren.

1. Sterilisieren Sie die FACS-Sorter, indem Sie 70% Ethanol als Mantelflüssigkeit während der Fluidik Shutdown-Vorgang (Menü "Cytometer" in der Software) vor der Sortierung. Wählen Sie "Cytometer" in der Werkzeugleiste der Software und wählen Sie "Fluidic shutdown ". Folgen Sie den durch die Prozesse genannten Schritte.
2. Vorzubereiten und zu filtern 1x PBS mit einem 0,22 um-Filter, um jegliche Kristalle und Verunreinigungen zu beseitigen. Füllen der Hülle mit dem oberen Tank Schweißlinie auf der Innenseite des Tanks.
3. Starten Sie die Software und melden Sie sich an. Starten Sie den FACS-Sorter, um vor der Sortierung Aufwärmen der Laser für mindestens 30 min. Führen Sie zwei fluidische Startprozesse von den Fluidik spülen, die Ethanol. Wählen Sie "Cytometer" in der Werkzeugleiste der Software und wählen Sie "Fluidic startup". Befolgen Sie die von den Prozessen genannten Schritte.
   Hinweis: Diese stellt Fluidik mit normaler Hüllflüssigkeit (1x PBS).
4. Reinigen Sie die Sortierblock und die Ablenkplatten mit destilliertem Wasser und trocknen Sie sie gründlich. Beschallen eine 100 & mgr; m Düse in einem Rohr aus destilliertem Wasser für 2 Minuten in einem Ultraschallbad gestellt. Wischen Sie die Düse gründlich.
5. Legen Sie die 100 & mgr; m Düse in die Durchflusszelle und drehen Sie die Düse-Verriegelungshebel im Uhrzeigersinn, um die 12-hr Position. Stellen Sie den Mantel Druck auf 20 psi.
6. Schalten Sie den Strom und stellen Sie die Amplitude, um Zielwerte für Frequenz (rund 30) zu erhalten, Tropfen 1 (um 150) und Gap (rund 12) und um eine stabile Tröpfchenabbruchmuster (einige Satellitentropfen) zu etablieren. Schalten Sie Dämpfung.
7. Stellen Sie sicher, dass der Strom ist gerade und mittig auf dem Abfall Absauger durch Veränderung des Winkels der Art Block. Hinweis: Eine 130 & mgr; m Düse bei 10 psi wurde ebenfalls getestet und kein offensichtlicher Unterschied gefunden wurde.
8. Set Laserverzögerung auf 0 für den blauen, -77,39 für den roten, 37,33 für die violetten und -39,85 für die gelb-grünen Lasern.
9. Set Bereichen Skalierung auf 1,14 für die blaue, 1,0 für den roten, 0,75 für die violetten und 0,96 für die gelb-grünen Lasern.
10. Verwendung eines Test Sort (im Fenster "Nebenstrom" der Software), stellen Sie sicher, dass die Nebenströme nicht schüren. Im Fenster "Nebenstrom", passen Sie die Schieberegler, Spannungs jeder Nebenstrom, so dass sie die middl getroffene von Testsammelröhrchen. Wenn die Mitte-Stream ist nicht fest, passen Sie die ^2., 3., ^und 4. Tropfen-Einstellungen, um das Zentrum Strom zu begrenzen.
11. Starten Sie das Setup-Cytometer und Tracking (CS & T) Anwendung in der Software (Menü "Cytometer").
12. Verwenden Sie die Zytometer Einrichtung und Tracking-Kügelchen bei 1 Tropfen je 350 & mgr; l, um die Charakterisierung und Verfolgung der Zytometer Leistung durch Herstellerangaben zu automatisieren.
13. Beenden Sie das CS & T-Anwendung. Übernehmen CS & T-Einstellung sicher, dass die Stromparameter eine stabile Tröpfchenabbruchmuster immer noch erlauben, und schalten Sie den Sweet Spot-Taste nach Herstellerangaben (in der "Abbruchfenster").
14. Optimieren Sie die Tropfen-Verzögerungswert unter Verwendung von fluoreszierenden Kügelchen (siehe Tabelle der Materialien).
    1. Installieren Sie die Sammelröhrchen in den Halter. Öffnen Sie die Art Blocktür. Im Fenster "Nebenstrom", schalten Sie Spannung wählen Sie dann "Test-Art "und klicken Sie auf den Aspirator Drawer-Taste, um die Lade zu öffnen und Zugang zu den Sammelröhrchen.
    2. Optimieren Sie die Seitenströme, so dass sie in die Mitte des Rohres zu gehen. Einstellen von Werten und Schieberegler nach Bedarf.
    3. Schließen Sie die Art Blocktür und stellen Sie sicher, um die Messuhr anpassen, um die hellsten Perle Ort in der Mitte zu erhalten. Unselect Abfallschublade, Test Art und Spannung. Die Sammelröhrchen zu entfernen.
    4. Optimieren Sie das Drop-Verzögerung nach den Anweisungen des Herstellers.
       1. Kurz schütteln Wulst Fläschchen kräftig und verdünnter 1 Tropfen Perlen in 0,5 ml PBS.
       2. Verwenden von Anweisungen des Herstellers, setzen Sie das Drop-Verzögerung mit der Tröpfchenverzögerungs Experiment Vorlage in der Software verfügbar. Alternativ können Sie die Auto-Tropfen-Verzögerungsfunktion, um die Drop Verzögerung einstellen.
       3. Legen Sie das Rohr des fluoreszierenden Kügelchen und stellen Sie die Durchflussrate, bis die Schwellenwertrate ist ~ 3000 bis 4000 Ereignisse / Sekunde. Legen Sie die Sortiergenauigkeit zu "Initial" und letztely zur "Feinabstimmung" im Fenster "Layout Sortieren". Wählen Sie das optische Filter und Sortier Perlen. Stellen Sie die Drop-Verzögerung, bis ~ 100% werden nach links sortiert.
          Hinweis: Dieser Schritt ist wichtig, um sicherzustellen, dass Zellen von Interesse Art in einem Seitenstrom. Die Kügelchen und das optische Filter verwendet Nähe einer 100% Tröpfchenabweichung zu erzielen.
15. Legen Sie eine FSC 1.5 ND (Neutraldichte-Filter) am linken Ende des FSC Detektorblock. Stellen Sie das Fenster-Erweiterung bis 2,00 & mgr; s und der FSC Bereich Skalierung auf 1,00 (im Register "Laser" im Fenster "Cytometer").
16. Vor dem Laden Probenröhrchen, legen Sie eine Probe Filterlinie von 50 um am Ende der Probenleitung, um Klumpenbildung zu vermeiden. Um dies zu tun, wählen Sie "Ändern Probe Filter" im Menü "Cytometer".
17. Testen der Zusammensetzung der Probenflüssigkeit, um eine gute Trennung ohne Auffächern zwischen den Seitenstrom zu erreichen und um die Zellen ein Anhaften an die Polypropyle verhindernne Rohre.
    1. Laden Sie das Probenröhrchen, schalten Sie den Ablenkplatten und wählen Sie "Test Art" mit die Schublade geschlossen ist. Schauen Sie sich Seitenströme, wenn die Trennung erfolgt, ohne zu viel Fanning.
       Anmerkung: Fanning wahrscheinlich aufgrund einer hohen Proteinkonzentration in der Probenpuffer.
18. Laden Sie das Probenröhrchen in die FACS-Instrument. Wählen einer Probe Rühren mit 300 Umdrehungen pro Minute und einer Probentemperatur von 4ºC. Wählen Sie "Acquire Data" in der "Acquisition-Dashboard".
19. Wenn nötig, verdünnen die Probe, um einen geeigneten Ereignisrate auf maximal 5.000 Veranstaltungen / s (bei einer maximalen Durchflussrate von 3,0) zu erreichen. Streng an diese Grenzen, so daß die Reinheit der sortierten Zellen aufrechtzuerhalten.
20. Zu analysieren und zu sortieren, die Zellen, die Optimierung der FSC Schwellenwert, um Schmutz, ohne sich mit der Bevölkerung von Interesse zu beseitigen. Im logarithmischen Maßstab, damit Einstellung der Spannung der Photomultiplierröhre (PMT) Detektor mit dem 530/30 Filtersicher, dass das Fluoreszenzsignal der Gesamtbevölkerung passt innerhalb der Skala und Gate auf dem positiven Population (Abbildung 1, Gate 1).
21. Produzieren eine Forward Scatter-Bereich (FSC-A) / Side Scatter-Bereich (SSC-A) Plot des SYTO16 positive Bevölkerung und stellen Sie die FSC-A auf etwa 110 V im linearen Skala und die SSC-A auf etwa 150 V im logarithmischen Maßstab, um alle Ereignisse zu visualisieren, während ohne sehr große Zellen und Zellaggregate.
22. Im Fenster "Sortieren Layout", stellen Sie den "Sortieren Präzisionsmodus" auf "4-Wege-Reinheit" (Yield Maske: 0, Reinheit Maske: 32, Phasenmaske: 0). Wählen Sie aus dem Menü "Ziel-Events" für die kontinuierliche Sortierung "Continuous".
23. Hinzufügen Populationen auf dem Gebiet entsprechend den Rohren zu sortieren (im Fenster "Sort Layout"). Stelle Populationen mit höheren Frequenzen in der Mitte und die mit niedrigeren Frequenzen an den Enden. Stellen Sie die Spannungsplatten bis 2500 V. Bei Sortierung, halten Sie die Probensammlung tUBEs auf Eis.

4. Zellsortierung

1. Unmittelbar vor dem Sortieren, Filterzellen unter Verwendung eines Filters 50 & mgr; m in einem zuvor beschichteten 5 ml Polypropylen-Rundrohr.
2. Den Filter ausgiebig waschen mit 1-2 ml Sortierpuffer.
3. Sortieren festen Keimzellen unter Verwendung eines 488 nm-Laser ausgestattetes Zellsortierer nach dem Gating-Schema in Abbildung 1 beschrieben. Collect gereinigten Fraktionen in 5 ml Polypropylen-Rundbodenröhrchen zuvor in Abschnitt 1 auf Eis überzogen.
   1. Sicherstellen, dass 100-200 ul FBS in den Sammelröhrchen gehalten werden, um ein Verkleben der sortierten Zellen an der Rohrwand zu vermeiden.
   2. Stellen Sie sicher, dass die Konzentration von SYTO16 wird sättigen, um Fluoreszenzfluktuationen während des Sortierzeit zu vermeiden. SYTO16 wird sättigt, wenn es keine weitere Veränderung der Zellfärbung Intensität am Alexa Fluor 488-Parameter (DNA-Färbung) in den Sortier Grafik. Falls erforderlich, fügen 1 ulSYTO16 zur Sortierrohr, um eine Sättigung zu erreichen.
   3. Zeigen Sie die Gesamt Veranstaltungen auf einer grafischen Anzeige der folgenden Parameter: Anzahl der Ereignisse vs Alexa Fluor 488-A.
   4. Wählen Sie die positive DNA-Färbung Zellen mit Gate 1, wie in Abbildung 1 dargestellt.
      1. Anzeigezellen von Tor 1 auf einer Grafik mit SSC-A vs FSC-A als Parameter
         1. Markieren Sie die Zellen mit Gate 2, wie in Abbildung 1 gezeigt.
         2. Display-Zellen von Gate 2 auf einer Grafik mit FSC-A vs Alexa Fluor 488-A als Parameter.
         3. Wählen Sie Zellen mit Gate 5 und Gate 6 am Gate 2 grafik, wie in Abbildung 1 gezeigt.
         4. Separat Gate 5 und Gate 6 Anzeige auf Grafiken mit Alexa Fluor 488-W vs Alexa Fluor 488-A als Parameter.
         5. Wählen Spermiogenese Schritte 1-9 Spermatiden auf dem Gate 5 Grafik und Spermiogenese Schritte 10-12 Spermatiden auf dem Gate 6 Grafiken, wie in Abbildung 1 gezeigt.
      2. AnzeigenZellen von Tor 1 auf einer Grafik mit FSC-A vs Alexa Fluor 488-A als Parameter
         1. Wählen Sie Zellen mit Tor 3 und Tor 4, wie in Abbildung 1 gezeigt.
         2. Separat Tor 3 und Tor 4 Zeigen Sie auf Grafiken mit Alexa Fluor 488-W vs Alexa Fluor 488-A als Parameter.
         3. Wählen Spermiogenese Schritte 13-14 Spermatiden auf dem Gate 3 Grafik und Spermiogenese Schritte 15-16 Spermatiden auf dem Gate 4 grafik, wie in Abbildung 1 gezeigt.

Ergebnisse

Gating-Strategie mit der Durchflusszytometrie verwendet

Abbildung 1 stellt die Gating-Strategie in der Durchflusszytometrie verwendet werden, um vier hochreine spermatid Populationen zu sortieren. Kurz gesagt, Zellen mit positiven DNA-Färbung (Alexa Fluor 488-A) zunächst mit Tor 1. Spermatiden von Spermiogenese Schritte 1-12 ausgewählt sind (Tor 2) auf einer Punkt-Diagramm, das die granulosity (SSC-A) vs Gr...

Diskussion

Spermatogenen Zellen waren schon immer eine Herausforderung, angesichts der Komplexität der Keimepithel sowie den begrenzten Erfolg der In-vitro-Kultur zu studieren. Im Laufe der Jahre sind viele Ansätze zur Reinigung von Keimzellen aus verschiedenen Spezies entwickelt. Sedimentation Techniken unter Verwendung von Schwerkraftaufbereitung mit Percoll oder Rinderserumalbumin Gradienten bieten in der Regel eine gute Ausbeute an intakten Keimzellen, aber nicht über angemessene Definition zwischen einigen Zelltyp...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Isoflurane	ABBOT	05260-05	For mouse anesthesia before euthanasia
Fetal bovine serum	Wisent	90150	For tube coating
1x PBS
EDTA	BioShop	EDT	For sorting buffer preparation
HEPES	Sigma	H	For sorting buffer preparation
100% Ethanol	Les alcools de commerce	092-09-11N	For cell fixation
SYTO 16	Life Technologies	S7578	DNA staining
5 ml polypropylene round bottom tubes	BD Falcon	352063	Sorted cells collection
15 ml polypropylene conical bottom tubes	PROgene	1500
50 ml polypropylene conical bottom tubes	PROgene	5000
TEC4 anaesthetic vaporizer	Ohmeda	1160526	For mouse euthanasia
CO2 gas tank	Praxair	C799117902	For mouse euthanasia
O2 gas tank	Praxair	O254130501	For mouse euthanasia
Homemade mouse gas chamber			For mouse euthanasia
40 µm Falcon cell strainer	Corning Incorporated	352340
50 μm sample line filters	BD Biosciences	649049
Vortex mixer	Labnet international, inc.	S0200	For cell fixation
Dynac centrifuge	Clay Adams	101
Celltrics 50 µm filters	Partec	04-004-2327
488 nm laser-euipped cell sorter	BD Biosciences	FACSAria III
Accudop Fluorescent Beads	BD Biosciences	345249
Sorting Buffer: 1x PBS, 1 mM EDTA pH 8.0, 25 mM HEPES pH 7.0, 1% FBS			FBS is heat-inactivated. Make fresh solution, 0.22 μm filtered and keep at 4°C.