Шаг конкретных сортировка мыши сперматидах цитометрическим

Резюме

We describe a sorting strategy for mouse spermatids using flow cytometry. Spermatids are sorted into four highly pure populations, including round (spermiogenesis steps 1-9), early elongating (spermiogenesis steps 10-12), late elongating (spermiogenesis steps 13-14) and elongated spermatids (spermiogenesis steps 15-16). DNA staining, size and granulosity are used as selection parameters.

Аннотация

Дифференцировка сперматидах мыши один важный процесс для производства функциональной мужской гаметы с интактным геном в который должен быть передан следующему поколению. Пока, молекулярные исследования этого морфологического перехода были затруднены из-за отсутствия метод, позволяющий достаточное разделение этих важных шагов сперматид дифференциации для последующих анализов. Ранее попытки правильного стробирования этих клеток с использованием проточной цитометрии, возможно, было трудно из-за своеобразного увеличению флуоресценции ДНК в сперматидах проходящих ремоделирование хроматина. Основываясь на этом наблюдении, мы предоставляем подробную информацию о простой проточной цитометрии схеме, что позволяет воспроизводимое очищение четырех популяций мыши сперматидах фиксированных этанолом, каждый из которых представляет различные состояния в процессе ядерного ремоделирования. Обогащение населения подтверждается с помощью ступенчатых конкретных маркеров и морфологических критерии. Очищенные Сперматиды могут быть использованы для геномных и протеомныеIC анализов.

Введение

Haploid round spermatids differentiate into spermatozoa by a process called spermiogenesis. This involves many different steps including the acquisition of a flagellum, chromatin and cytoskeleton remodeling, condensation of the nucleus as well as the loss of most of the cytoplasm. These unique cellular events must be finely regulated in order to produce a mature functional gamete with an intact genome suitable for fertilization. Spermiogenesis can hardly be studied in vitro since no reliable cell culture system has so far been able to support progression through the different steps of the process. Moreover, actual in vitro techniques lead to a poor yield^1,2. In vivo, proper transitions through the different steps of spermiogenesis are crucial for the natural functional integrity of the male gamete. Successful purification of spermatids according to their differentiation steps has never been accomplished with a level of enrichment sufficient to allow molecular characterization of spermiogenesis. For instance, purification of key steps of the spermatidal differentiation would be especially useful to study the developing acrosome, formation of the midpiece³, cell junction dynamics⁴, RNA dynamics⁵, chromatin remodeling process^6,7 or genomic stability⁸. Purification of spermatids has been hampered by their progressive morphological transformation, the lack of known stage-specific external biomarkers, and their peculiar shape and size.

Although most male germ cells display a direct relationship between DNA staining and ploidy (DNA content), we noticed that such positive correlation is no longer applicable to spermatids. This stems from our early observation that seminiferous tubule sections show variable intensity of DNA staining throughout the different spermiogenesis steps. Although DNA staining is consistent with their haploid set of chromosomes from spermiogenesis steps 1 to 7 (round spermatids), we observed a sharp increase in fluorescence intensity with DAPI or SYTO 16 around the onset of nuclear reorganization and chromatin remodeling (spermiogenesis step 8) reaching a peak at the onset of nuclear condensation (spermiogenesis steps 11-12). Following condensation of the nucleus, DNA staining intensity decreases until spermiation (spermiogenesis step 16). We surmised that this was likely associated with the formation of their peculiar chromatin structure transition where histones are replaced by protamines. We therefore developed a reliable flow cytometry method that allows the separation of spermatids using the variation of DNA intensity of spermatids as a main selection parameter.

A simple flow cytometry approach is described to separate mouse spermatids with high purity (95-100%) based on their apparent DNA content (SYTO16 staining), size and granulosity. Spermatids are separated into four populations; spermiogenesis steps 1-9, 10-12, 13-14 and 15-16. Purified spermatids are suitable for genetic/genomic analysis, as well as proteomic applications as described in a recent publication from our group⁹.

протокол

Уход за животными было в соответствии с ухода за животными и использование комитета Шербрукский университет.

1. Подготовка трубки

1. За день до сортировки клеток, добавить 1-2 мл инактивированной нагреванием фетальной бычьей сыворотки (FBS) до 5 мл полипропиленовые с круглым дном труб и 15 мл и 50 мл конические пробирки из полипропилена.
   Критический шаг: Убедитесь, что каждый трубки используется в протоколе является покрытием.
   Примечание: ФБС покрытие предотвращает зародышевые клетки от прилипания к стенок трубки.
2. Медленно перемешать O / N инверсией при 4 ° С для покрытия трубки равномерно с помощью поворотного устройства.
3. На следующий день, удалить FBS из труб с покрытием путем декантации.
   1. * Критический шаг: Убедитесь, что в 5 мл полипропиленовые круглым дном трубы и трубки, используемые для клеточного препарата 15 и 50 мл (протокол шаги 2.1 до 2.11) полностью очищена от FBS, чтобы предотвратить раздувание (т.е. неточное отклонение боковых потоков). Используйте P200 пипетки, чтобы удалить FBS.
      Примечание: Остаточная ФБС в трубах до сортировки может привести к потере клеток или загрязнения других труб, используемых во время сортировки клеток,
   2. Оставьте небольшой остаточный объем FBS (100-200 мкл) в полипропилена 5 мл с круглым дном и труб, используемых для сбора очищенных клеток.

2. Подготовка сотового

1. Жертвоприношение один мужчина мышь под наркозом с помощью _O 2 / изофлуран (индукция в 5%, то поддерживается на уровне 2%), а затем _СО 2 удушья.
2. Акциз и decapsulate оба яички и пропустить через мясорубку с маленькими ножницами в 500 мкл буфера сортировки в 1,5 мл трубки.
3. Флеш зародышевые клетки семенных канальцев по нежным вверх и вниз пипеткой в ​​1,5 мл трубки, впервые с усеченной 100-1000 мкл кончика, а затем с неповрежденной наконечником 100-1000 мкл.
4. Удалите мусор и комья по шаге фильтрации с использованием фильтр 40 мкм клеток и собрать фильтрат в 50 мл конических труб предiously покрыты FBS в шаге 1.
5. Промойте фильтр один раз с сортировкой буфер до общего объема 3 мл и передачи фильтрата в 15 мл коническую трубку, ранее покрытой в шаге 1.
6. Добавить 16 мкл 50 мМ ЭДТА, рН 8 на миллилитр суспензии клеток (48 мкл в течение 3 мл), чтобы получить конечную концентрацию 0,8 мМ ЭДТА.
7. Чтобы исправить зародышевые клетки, постепенно добавить 3 объема ледяной 100% этанола с помощью 10 мл пипетки при осторожном перемешивании (вихревую при низкой скорости), который будет производить молочный подвески.
   Критический шаг: Медленно добавлением этанола важно и важно сохранить целостность клеточного препарата. Мы отметили, что быстрое добавление этанола вызывает лизис клеток в результате крупного снижения сортировки эффективности. Для 3 мл клеточной суспензии, должны быть добавлены 9 мл этанола примерно 1 мин.
8. Инкубируйте клетки на льду в течение 15 мин с периодическим перемешиванием инверсией.
9. Центрифуга клеточной суспензии при 800 мкг в течение 5 мин и снять ясносупернатант.
10. Аккуратно ресуспендирования фиксированные половых клеток в 2 мл буфера сортировки.
11. Добавьте 4 мкл красителя SYTO16 ДНК (1 мМ раствора в ДМСО) и инкубировать в течение не менее 30 мин (в защищенном от света).
    Примечание: Лучшие сортировки результаты получаются при использовании SYTO16, так как это проницаемой краситель ДНК, который легко включены в очень уплотненных ядер сперматидах.

3. Клеточный сортер Настройка

Примечание: Здесь, 4-Laser (405 нм - фиолетовый, 488 нм - синий, 561 нм - желто-зеленый, 633 нм - красный) 20-параметр BDFACSAria III клеток сортировщик используется. 6.1.3 Программное обеспечение BD FACSDiva используется для визуализации и анализа данных. Параметры могут различаться в зависимости от типа используемого сортировщика.

1. Стерилизовать сортировщик FACS, запустив 70% этанола в качестве оболочки жидкости во время процедуры струйная отключения (меню "Цитометр" в программном обеспечении) до сортировки. Выберите "цитометром" на панели инструментов программного обеспечения и выберите "жидкостный шutdown ". Следуйте инструкциям, упомянутые процессы.
2. Подготовка и фильтровать 1X PBS с 0,22 мкм фильтр таким образом, чтобы устранить любые кристаллы и примеси. Заполните оболочки бака к верхней линии шва на внутренней стороне резервуара.
3. Запустите программу и войти. Запустите сортировщик FACS, чтобы согреться лазеров, по крайней мере 30 мин до сортировки. Запустите два жидкостных процессов запуска, чтобы спугнуть этанола из струйной. Выберите "цитометром" на панели инструментов программного обеспечения и выберите "текучей" запуск. Следуйте инструкциям, упомянутые процессы.
   Примечание: Эта восстанавливает струйной оболочки с нормальной жидкости (1x PBS).
4. Очистите блок сортировки и отклоняющие пластины с дистиллированной водой и высушите их полностью. Разрушать ультразвуком сопло 100 мкм, помещенный в трубку дистиллированной воды в течение 2 мин в ультразвуковой в ванне. Протрите сопла тщательно.
5. Вставьте сопло 100 мкм в проточную кювету и повернуть насадку-фиксирующий рычаг по часовой стрелке в 12Положение ч. Установите давление оболочка 20 фунтов на квадратный дюйм в.
6. Включите потока и регулировки амплитуды, чтобы получить целевые значения для частоты (около 30), падение 1 (около 150) и Gap (около 12) и создать стабильную капель отрыва шаблон (несколько капель спутниковое). Выключите ослабление.
7. Убедитесь, что поток прямо и попадает в центр аспиратора отходов путем изменения угла сортировки блока. Примечание: Насадка 130 мкм в 10 фунтов на квадратный дюйм также была протестирована и не очевидная разница не было найдено.
8. Установите лазер задержка 0 для синего, -77.39 на красный, 37.33 для фиолетового и -39.85 для желто-зеленых лазеров.
9. Установить области масштабирования до 1,14 для синего, 1,0 для красного, 0,75 для фиолетовых и 0,96 для желто-зеленых лазеров.
10. Использование теста Сортировать (в окне "Сторона поток" программного обеспечения), чтобы убедиться, что боковые потоки не раздувая. В окне "Сторона поток", отрегулируйте ползунки напряжения каждого бокового потока, так что они попали в middlе сбора пробирку. Если центр поток не плотно, отрегулировать ^2-й, 3-й и ^4-й параметры, чтобы ограничить падение центральную поток.
11. Начните цитометра настройки и применения слежения (CS & T) в программном обеспечении (меню "Цитометр").
12. Используйте цитометра настройки и слежения бусы на 1 капле на 350 мкл для автоматизации характеристика и отслеживание цитометра производительности, используя инструкции производителя.
13. Выйти из программы CS & T. Применить настройки CS & T, убедитесь, что параметры потока по-прежнему позволяют стабильный паттерн капель отрыва, и включите кнопку Sweet Spot, как описано в инструкции производителя (в "окне" отрыва).
14. Оптимизация стоимости падение задержки, используя флуоресцентные шарики (см таблицу материалов).
    1. Установите трубки сбора в держателе. Откройте рода блок дверь. В окне "Сторона поток», включите напряжения, затем выберите "Тест рода "и нажмите кнопку Аспиратор ящика, чтобы открыть ящик и иметь доступ к трубам сбора.
    2. Оптимизация боковые потоки, чтобы они идут в центре трубки. Отрегулируйте значения ползунков и по мере необходимости.
    3. Закройте дверь блока сортировки и убедитесь, что для регулировки микрометра диск, чтобы получить яркий шарик место в центре. Очистить отходов ящик, тест вроде и напряжения. Удалить труб сбора.
    4. Оптимизация задержки падение в соответствии с инструкциями производителя.
       1. Вкратце, пожать шарик флакон энергично и развести 1 каплю бисера в 0,5 мл PBS.
       2. Использование инструкции производителей, установить задержку падение, используя шаблон эксперимента падения задержки, доступные в программе. В качестве альтернативы, используйте функцию автоматического задержки падения установить задержку падение.
       3. Загрузите трубку флуоресцентных бисером и регулировать расход до пороговой скорости не ~ 3000 до 4000 событий / сек. Установите точность сортировки "Первоначальный" и последнийLY, чтобы "Точная настройка" в окне "Сортировать макета". Выберите оптический фильтр и сортировать шарики. Отрегулируйте задержку падения до ~ 100% не сортируются влево.
          Примечание: Этот шаг является критическим, чтобы убедиться, что клетки процентной рода в виде бокового потока. Шарики и оптический фильтр используется для достижения близко к отклонению капель 100%.
15. Поставьте FSC 1.5 нейтрального (ND) фильтр в левой части детектора FSC блока. Установите расширение окна до 2,00 мкс и масштабирование FSC площадь в 1,00 (на вкладке "Лазер" в окне "цитометром").
16. Перед загрузкой пробирку, Поместите образец фильтра линию 50 мкм в конце линии пробы, чтобы избежать образования комков. Чтобы сделать это, выберите "Изменить Образец фильтр" в меню "цитометром".
17. Испытание состава пробы жидкости, чтобы достичь хорошего разделения, не раздувают между бокового потока и предотвратить клетки от прилипания к Полипропилепе трубы.
    1. Загрузите пробирку, включите отклоняющих пластин и выберите "Test-то" с выдвижной ящик закрыт. Посмотрите на боковых потоков, если разделение происходит не слишком много Фаннинг.
       Примечание: Раздувание вероятно из-за высокой концентрации белка в буфере выборок.
18. Загрузка пробирку в прибор FACS. Выберите образец перемешивание 300 об и температуре образца 4 ° С. Выберите "Получение данных" в "Приобретение панели".
19. При необходимости, разбавить образец, чтобы достичь соответствующей скорости событии, не более 5000 событий / сек (при максимальной скорости потока 3,0). Строго соблюдать эти пределы с тем, чтобы поддерживать чистоту отсортированных клеток.
20. Для анализа и сортировки клеток, оптимизировать пороговое значение FSC устранить мусор, не мешая населения интерес. В логарифмической шкале, отрегулируйте напряжение фото-мультипликатор (ФЭУ) детектор с фильтром 530/30 для того, чтобы сделатьУбедитесь, что сигнал флуоресценции от общей численности населения вписывается в масштабе, и ворота на положительной популяции (рис 1, ворота 1).
21. Произведите рассеяния вперед-зону (FSC-A) / бокового рассеяния-зоны (SSC-А) сюжет SYTO16 положительного населения и регулировать FSC-A около 110 В в линейном масштабе, а SSC-А около 150 V в логарифмической шкале, чтобы визуализировать все события, исключая очень крупные клетки и клеточных агрегатов.
22. В окне "Layout" Сортировать установите "режим сортировки Precision" на "4-полосная чистота" (Выход маска: 0, чистота Маска: 32 Фаза Маска: 0). Выберите "Непрерывный" в меню "События" Целевые непрерывного сортировки.
23. Добавить населения для сортировки в области, соответствующей труб (в окне "Layout" Сортировать). Место населения с более высокими частотами в середине и с более низкими частотами на концах. Установите пластины напряжения до 2500 В. При сортировке, держать сбора образец Тмассовые рассылки по льду.

4. Сотовый Сортировка

1. Непосредственно перед сортировка, клетки фильтр, использующий фильтр 50 мкм в ранее покрытой 5 мл полипропилен круглый нижний трубку.
2. Промойте фильтр широко 1-2 мл буфера сортировки.
3. Сортировать неподвижные половые клетки, используя 488 нм лазерный оборудованный сортировщик клеток следующую схему стробирования, изображенной на рисунке 1. Соберите очищенные фракции в 5 мл полипропиленовые пробирки с круглым дном, предварительно покрытые в разделе 1 на льду.
   1. Убедитесь, что 100-200 мкл FBS хранится в трубах, чтобы избежать сбора налипание отсортированных клеток в стенке трубы.
   2. Убедитесь, что концентрация SYTO16 насыщается, чтобы избежать колебания флуоресценции во время сортировки периода. SYTO16 насыщается, когда нет еще вариация интенсивности окрашивания клеток на 488 параметров (окрашивания ДНК) Alexa Fluor сортировочных графики. Если необходимо, добавьте 1 мклSYTO16 в сортировочный трубки для достижения насыщения.
   3. Отображает общее события на графическом отображаются следующие параметры: количество событий VS Alexa Fluor 488-A.
   4. Выберите положительное окрашивание ДНК клетки ворота 1, как показано на рисунке 1.
      1. Показать клетки ворот 1 на графике с использованием SSC-A против FSC-A в качестве параметров
         1. Выделите ячейки с Gate 2, как показано на рисунке 1.
         2. Показать клетки от ворот 2 на графике с использованием FSC-A против Alexa Fluor 488-А в качестве параметров.
         3. Выберите ячейки с воротами 5 и 6 на ворота Ворота 2 графика, как показано на рисунке 1.
         4. Дисплей отдельно ворота 5 и 6 на ворота графики с использованием Alexa Fluor 488-W против Alexa Fluor 488-А в качестве параметров.
         5. Выберите спермиогенез шаги 1-9 сперматид на графическом ворота 5 и спермиогенез шаги 10-12 сперматид на воротах 6 графики, как показано на рисунке 1.
      2. Дисплейклетки из ворот 1 на графике с использованием FSC-A против Alexa Fluor 488-А в качестве параметров
         1. Выберите ячейки с ворот 3 и 4 ворот, как показано на рисунке 1.
         2. Дисплей отдельно ворота 3 и 4 ворот на графики с использованием Alexa Fluor 488-W против Alexa Fluor 488-А в качестве параметров.
         3. Выберите спермиогенез шаги 13-14 сперматид на ворота 3 графических и спермиогенез шаги 15-16 сперматид на ворота 4 графика, как показано на рисунке 1.

Результаты

Стратегия Память используется с проточной цитометрии

Рисунок 1 представляет собой стратегию стробирования используется в проточной цитометрии для сортировки четыре высокой чистоты популяции сперматид. Вкратце, клетки с ок...

Обсуждение

Сперматогенного клетки всегда был сложным для изучения, учитывая сложность семенных эпителия, а также ограниченный успех культуры в пробирке. На протяжении многих лет, многие методы, чтобы очистить разработаны зародышевые клетки из различных видов. Методы очистки с использовани?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Isoflurane	ABBOT	05260-05	For mouse anesthesia before euthanasia
Fetal bovine serum	Wisent	90150	For tube coating
1x PBS
EDTA	BioShop	EDT	For sorting buffer preparation
HEPES	Sigma	H	For sorting buffer preparation
100% Ethanol	Les alcools de commerce	092-09-11N	For cell fixation
SYTO 16	Life Technologies	S7578	DNA staining
5 ml polypropylene round bottom tubes	BD Falcon	352063	Sorted cells collection
15 ml polypropylene conical bottom tubes	PROgene	1500
50 ml polypropylene conical bottom tubes	PROgene	5000
TEC4 anaesthetic vaporizer	Ohmeda	1160526	For mouse euthanasia
CO2 gas tank	Praxair	C799117902	For mouse euthanasia
O2 gas tank	Praxair	O254130501	For mouse euthanasia
Homemade mouse gas chamber			For mouse euthanasia
40 µm Falcon cell strainer	Corning Incorporated	352340
50 μm sample line filters	BD Biosciences	649049
Vortex mixer	Labnet international, inc.	S0200	For cell fixation
Dynac centrifuge	Clay Adams	101
Celltrics 50 µm filters	Partec	04-004-2327
488 nm laser-euipped cell sorter	BD Biosciences	FACSAria III
Accudop Fluorescent Beads	BD Biosciences	345249
Sorting Buffer: 1x PBS, 1 mM EDTA pH 8.0, 25 mM HEPES pH 7.0, 1% FBS			FBS is heat-inactivated. Make fresh solution, 0.22 μm filtered and keep at 4°C.