-Étape spécifique de tri Spermatides souris par cytométrie en flux

Résumé

We describe a sorting strategy for mouse spermatids using flow cytometry. Spermatids are sorted into four highly pure populations, including round (spermiogenesis steps 1-9), early elongating (spermiogenesis steps 10-12), late elongating (spermiogenesis steps 13-14) and elongated spermatids (spermiogenesis steps 15-16). DNA staining, size and granulosity are used as selection parameters.

Résumé

La différenciation des spermatides de souris est un processus critique pour la production d'un gamète mâle fonctionnel avec un génome intact à être transmis à la génération suivante. Jusqu'à présent, les études moléculaires de cette transition morphologique ont été entravés par l'absence d'une méthode permettant une séparation adéquate de ces étapes importantes de la différenciation des spermatides pour des analyses ultérieures. Les tentatives précédentes pour bon déclenchement de ces cellules en utilisant la cytométrie de flux ont peut-être été difficile en raison d'une augmentation particulière de la fluorescence de l'ADN dans les spermatides subissant remodelage de la chromatine. Partant de ce constat, nous fournissons des détails d'un simple, cytométrie de flux système, permettant la purification reproductible de quatre populations de spermatides de souris fixes avec de l'éthanol, représentant chacun un état différent dans le processus de remodelage nucléaire. L'enrichissement de la population est confirmée en utilisant des marqueurs spécifiques étapes et critères morphologiques. Les spermatides purifiés peuvent être utilisés pour la génomique et de protéomiqueic analyse.

Introduction

Haploid round spermatids differentiate into spermatozoa by a process called spermiogenesis. This involves many different steps including the acquisition of a flagellum, chromatin and cytoskeleton remodeling, condensation of the nucleus as well as the loss of most of the cytoplasm. These unique cellular events must be finely regulated in order to produce a mature functional gamete with an intact genome suitable for fertilization. Spermiogenesis can hardly be studied in vitro since no reliable cell culture system has so far been able to support progression through the different steps of the process. Moreover, actual in vitro techniques lead to a poor yield^1,2. In vivo, proper transitions through the different steps of spermiogenesis are crucial for the natural functional integrity of the male gamete. Successful purification of spermatids according to their differentiation steps has never been accomplished with a level of enrichment sufficient to allow molecular characterization of spermiogenesis. For instance, purification of key steps of the spermatidal differentiation would be especially useful to study the developing acrosome, formation of the midpiece³, cell junction dynamics⁴, RNA dynamics⁵, chromatin remodeling process^6,7 or genomic stability⁸. Purification of spermatids has been hampered by their progressive morphological transformation, the lack of known stage-specific external biomarkers, and their peculiar shape and size.

Although most male germ cells display a direct relationship between DNA staining and ploidy (DNA content), we noticed that such positive correlation is no longer applicable to spermatids. This stems from our early observation that seminiferous tubule sections show variable intensity of DNA staining throughout the different spermiogenesis steps. Although DNA staining is consistent with their haploid set of chromosomes from spermiogenesis steps 1 to 7 (round spermatids), we observed a sharp increase in fluorescence intensity with DAPI or SYTO 16 around the onset of nuclear reorganization and chromatin remodeling (spermiogenesis step 8) reaching a peak at the onset of nuclear condensation (spermiogenesis steps 11-12). Following condensation of the nucleus, DNA staining intensity decreases until spermiation (spermiogenesis step 16). We surmised that this was likely associated with the formation of their peculiar chromatin structure transition where histones are replaced by protamines. We therefore developed a reliable flow cytometry method that allows the separation of spermatids using the variation of DNA intensity of spermatids as a main selection parameter.

A simple flow cytometry approach is described to separate mouse spermatids with high purity (95-100%) based on their apparent DNA content (SYTO16 staining), size and granulosity. Spermatids are separated into four populations; spermiogenesis steps 1-9, 10-12, 13-14 and 15-16. Purified spermatids are suitable for genetic/genomic analysis, as well as proteomic applications as described in a recent publication from our group⁹.

Protocole

Les soins des animaux était en conformité avec la protection des animaux et l'utilisation comité Université de Sherbrooke.

1. Préparation du tube

1. Le jour avant le tri de cellules, ajouter 2.1 ml de sérum bovin foetal inactivé par la chaleur (FBS) à 5 ml polypropylene tubes à fond rond et à 15 ml et 50 ml polypropylene tubes coniques.
   Étape critique: Veiller à ce que chaque tube utilisé dans le protocole est revêtu.
   Remarque: Un revêtement FBS empêche les cellules germinales de coller aux parois du tube.
2. Mélangez lentement O / N par inversion à 4 ° C pour enduire en utilisant les tubes uniformément un rotateur.
3. Le lendemain, retirez FBS de tubes revêtus par décantation.
   1. * Étape critique: Veiller à ce que les 5 ml polypropylène tubes à fond rond et les 15 et 50 ml tubes utilisés pour la préparation cellulaire (protocole étapes 02.01 à 02.11) sont complètement vidés de FBS pour empêcher Fanning (ie, la déviation imprécise des courants latéraux). Utilisez une pipette P200 pour enlever les FBS.
      Remarque: Des résidus de FBS dans des tubes avant de tri peut conduire à une perte de cellules ou de contamination d'autres tubes utilisés pendant le tri de cellules,
   2. Laisser un petit volume résiduel de FBS (environ 100-200 pi) dans la 5 ml polypropylène ronde des tubes inférieurs utilisés pour collecter les cellules purifiées.

2. Préparation des cellules

1. Sacrifier souris mâle sous anesthésie utilisant O ₂ / isoflurane (induction à 5% puis maintenu à 2%), suivie par _asphyxie au CO2.
2. Accise et décapsulent deux testicules et émincer avec de petits ciseaux dans 500 pi de tampon de tri dans un tube de 1,5 ml.
3. Rincer les cellules germinales à partir de tubes séminifères par douce pipetage de haut en bas dans le tube de 1,5 ml, d'abord avec une pointe de 100-1.000 pi tronquée, puis, avec une pointe 100-1000 ul intacte.
4. Enlever les débris et bouquets par la première étape de filtration utilisant un tamis cellulaire de 40 um et de recueillir filtrat dans les 50 ml coniques prev tubeiously enduit avec du FBS à l'étape 1.
5. Laver le filtre une fois avec le tri tampon jusqu'à un volume total de 3 ml et le transfert filtrat dans le tube de 15 ml conique préalablement revêtu à l'étape 1.
6. Ajouter 16 ul d'EDTA 50 mM pH 8 par millilitre de suspension cellulaire (48 pi pour 3 ml) de façon à obtenir une concentration finale de 0,8 mM d'EDTA.
7. Pour fixer les cellules germinales, ajouter lentement 3 volumes de glace-froid 100% d'éthanol en utilisant une pipette de 10 ml avec une légère agitation (vortex à basse vitesse), qui va produire une suspension laiteuse.
   Étape cruciale: en ajoutant lentement de l'éthanol est crucial et important de préserver l'intégrité de la préparation cellulaire. Nous avons constaté que l'addition rapide de l'éthanol provoque la lyse des cellules a entraîné une diminution importante de l'efficacité du tri. Pour une suspension de cellules 3 ml, 9 ml d'éthanol, il convient d'ajouter à environ 1 min.
8. Incuber les cellules sur de la glace pendant 15 minutes avec mélange occasionnel par inversion.
9. Centrifugeuse suspension de cellules à 800 g pendant 5 min et retirez le clairsurnageant.
10. Resuspendre doucement les cellules germinales fixes dans 2 ml de tampon de tri.
11. Ajouter 4 pi de l'ADN SYTO16 colorant (solution à 1 mM dans le DMSO) et incuber pendant au moins 30 min (abri de la lumière).
    Remarque: Les meilleurs résultats sont obtenus en utilisant de tri SYTO16 car il est un colorant d'ADN perméable qui peut être facilement incorporée dans les noyaux fortement compactées de spermatides.

3. trieur de cellules Set Up

Remarque: Ici, un 4-laser (405 nm - violet, 488 nm - bleu, 561 nm - jaune-vert, 633 nm - rouge) 20-paramètre BDFACSAria III trieur de cellules est utilisée. Le logiciel BD FACSDiva 6.1.3 est utilisé pour visualiser et analyser les données. Les paramètres peuvent varier en fonction du type de trieur utilisé.

1. Stériliser le trieur FACS en exécutant 70% d'éthanol comme fluide de gaine pendant la procédure fluidique d'arrêt (menu "cytomètre" dans le logiciel) avant le tri. Sélectionnez «cytomètre" dans la barre d'outils du logiciel et choisissez "sh fluidiqueutdown ". Suivez les étapes mentionnées par les processus.
2. Préparer et un filtrage 1x PBS avec un filtre de 0,22 um afin d'éliminer tous les cristaux et les contaminants. Remplir le réservoir de la gaine à la ligne de soudure supérieure à l'intérieur de la cuve.
3. Lancez le logiciel et connectez-vous. Commencez le trieur FACS pour réchauffer les lasers pendant au moins 30 min avant le tri. Exécutez deux processus de démarrage fluidiques pour débusquer l'éthanol à partir de la fluidique. Sélectionnez «cytomètre" dans la barre d'outils du logiciel et choisissez "démarrage fluidique». Suivez les étapes mentionnées par les processus.
   Note: Ceci restaure fluidique avec le fluide de gaine normale (1x PBS).
4. Nettoyez le bloc de tri et les plaques de déviation avec de l'eau distillée et séchez-les soigneusement. Soniquer une buse de 100 pm placée dans un tube de l'eau distillée pendant 2 min dans un bain de sonication. Essuyez soigneusement la buse.
5. Insérez la buse de 100 um dans la cellule d'écoulement et tournez le levier de verrouillage dans le sens horaire buse à la 12position h. Régler la pression de la gaine à 20 psi.
6. Tournez sur le flux et ajuster l'amplitude d'obtenir des valeurs cibles pour la fréquence (environ 30), baisse de 1 (environ 150) et Gap (environ 12) et d'établir un modèle de gouttelette breakoff stable (quelques gouttes satellites). Éteignez atténuation.
7. Assurez-vous que le flux est droite et frappe le centre de l'aspirateur de déchets en changeant l'angle du bloc de tri. Remarque: Une buse de 130 um à 10 psi a également été testé et aucune différence évidente n'a été trouvée.
8. Définit le délai laser à 0 pour la -77,39 bleu, pour le rouge, 37.33 pour la violette et -39,85 pour les lasers jaune-vert.
9. Définir les zones d'échelle à 1,14 pour le 1.0 bleu, pour le rouge, de 0,75 pour la violette et de 0,96 pour les lasers jaune-vert.
10. Utilisation d'un Tri de test (dans la fenêtre "Side Stream" du logiciel), assurez-vous que les flux secondaires ne sont pas Fanning. Dans la fenêtre "Side Stream", régler les curseurs de tension de chaque courant latéral de façon à frapper le middle de tube de collecte de test. Si le flux de centre est pas étanche, ajuster la 2 ^{ème, 3 ème} et 4 ^ème paramètres de chute pour limiter le flux de centre.
11. Démarrez le Setup cytomètre et le suivi (CS & T) application dans le logiciel (menu "cytomètre").
12. Utilisez la configuration et le suivi des perles cytomètre à 1 goutte par 350 pi d'automatiser la caractérisation et le suivi de la performance cytomètre en utilisant les instructions du fabricant.
13. Quittez l'application CS & T. Appliquer paramètre CS & T, assurez-vous que les paramètres de flux permettent encore un motif de gouttelettes breakoff stable, et tourner sur le bouton Sweet Spot comme décrit dans les instructions du fabricant (dans la fenêtre "sécable").
14. Optimiser la valeur de retard Goutte utilisant des billes fluorescentes (voir le tableau des matériaux).
    1. Installez les tubes de prélèvement dans le support. Ouvrez la porte du bloc sort. Dans la fenêtre "Side Stream", allumer la tension puis sélectionnez "Sorte de test "et cliquez sur le bouton Aspirateur tiroir pour ouvrir le tiroir et avoir accès à des tubes de prélèvement.
    2. Optimiser les flux secondaires alors ils vont dans le centre du tube. Réglez les valeurs et les curseurs au besoin.
    3. Fermez la porte du bloc de tri et assurez-vous de régler la molette de micromètre pour obtenir le point le plus lumineux de perles au centre. Tiroir à déchets Désélectionner, trier et la tension test. Retirer les tubes de prélèvement.
    4. Optimiser le retard de chute selon les instructions du fabricant.
       1. En bref, secouer vigoureusement cordon flacon et diluer 1 goutte de perles dans 0,5 ml de PBS.
       2. En utilisant les instructions du fabricant, définir le délai de dépôt en utilisant le modèle de l'expérience Retard baisse disponible dans le logiciel. Vous pouvez également utiliser la fonction Auto Delay déplacer pour définir le délai de baisse.
       3. Chargez le tube de perles fluorescentes et ajuster le débit jusqu'à ce que le taux de seuil est ~ 3.000 à 4.000 événements / seconde. Réglez la précision de sorte à "initiale" et finaleLy à «peaufiner» dans la fenêtre «Trier de mise en page". Sélectionnez le filtre optique et de tri des perles. Régler le retard Dérouler jusqu'à ~ 100% sont classifiées vers la gauche.
          Remarque: Cette étape est essentielle pour faire en sorte que les cellules d'intérêt sorte dans un courant latéral. Les billes et le filtre optique sont utilisés pour obtenir un écart proche de gouttelette de 100%.
15. Placez un ND (densité neutre) filtre FSC 1.5 à l'extrémité gauche du bloc de détecteur de FSC. Réglez l'extension de la fenêtre à 2.00 ms et la mise à l'échelle FSC Zone à 1,00 (dans l'onglet "laser" dans la fenêtre "cytomètre").
16. Avant de charger le tube de l'échantillon, placer une ligne de filtration de l'échantillon de 50 um à la fin de la ligne de prélèvement pour éviter l'agglutination. Pour ce faire, sélectionnez "Changer le filtre échantillon» dans le menu «cytomètre".
17. Testez la composition de l'échantillon de fluide pour obtenir une bonne séparation sans attiser entre les flux de côté et d'empêcher les cellules de coller à la polypropètubes NE.
    1. Chargez le tube d'échantillon, tourner sur les plaques de déviation et sélectionnez "sorte de test" à tiroir fermé. Regardez les flux secondaires si la séparation se produit sans trop de Fanning.
       Remarque: Fanning est probablement due à une concentration élevée de protéine dans le tampon d'échantillon.
18. Chargez le tube d'échantillon dans l'instrument FACS. Sélectionner un échantillon agitation de 300 tours par minute et à une température de 4 ° C de l'échantillon. Sélectionnez "Acquérir les données" dans le "Tableau de bord de l'acquisition».
19. Si nécessaire, diluer l'échantillon d'atteindre un taux d'événement approprié pour un maximum de 5000 événements / sec (à un débit maximal de 3,0). Respecter strictement ces limites de façon à maintenir la pureté des cellules triées.
20. Pour analyser et trier les cellules, d'optimiser la valeur de seuil de FSC pour éliminer les débris sans interférer avec la population d'intérêt. Dans échelle logarithmique, ajuster la tension du détecteur tubes photo-multiplicateurs (PMT) avec le filtre de 530/30 afin de faireen sorte que le signal de fluorescence de la population totale à l'intérieur de l'échelle correspond, et porte sur la population positive (Figure 1, la porte 1).
21. Produire un Forward Scatter-zone (FSC-A) / Side Scatter-zone (SSC-A) parcelle de la population positive SYTO16 et ajuster la FSC-A à environ 110 V sur une échelle linéaire, et le SSC-A à environ 150 V en échelle logarithmique de visualiser tous les événements tout en excluant de très grandes cellules et les agrégats cellulaires.
22. Dans la fenêtre «Trier Layout", réglez le "Mode Tri précision" à "la pureté 4-way" (masque de Rendement: 0, Pureté Masque: 32, Phase Mask: 0). Sélectionnez «Continu» dans le menu «Événements cibles" pour le tri continue.
23. Ajouter populations à trier dans le domaine correspondant aux tubes (dans la fenêtre "Trier Layout"). La place populations avec des fréquences plus élevées dans le milieu et ceux avec des fréquences inférieures aux extrémités. Réglez les plaques de tension à 2.500 V. Pendant le tri, garder le prélèvement de l'échantillon tUBE sur la glace.

4. Tri cellulaire

1. Immédiatement avant le tri, les cellules de filtrage utilisant un filtre de 50 um dans un 5 ml précédemment enduite polypropylène tube rond en bas.
2. Laver le filtre abondamment avec 1-2 ml de tampon de tri.
3. Cellules germinales Trier fixe utilisant un trieur de cellules laser équipé 488 nm suivant le schéma de déclenchement détaillé dans la figure 1. Recueillir des fractions purifiées dans 5 ml tubes en polypropylène à fond rond préalablement enduits à l'article 1 sur la glace.
   1. Assurez-vous que 100-200 pi de FBS est maintenue dans les tubes de prélèvement pour éviter le collage des cellules triées à la paroi du tube.
   2. Assurez-vous que la concentration de SYTO16 sature pour éviter les fluctuations de fluorescence au cours de la période de tri. SYTO16 sature lorsqu'il n'y a pas de variation en outre intensité de coloration des cellules à l'Alexa Fluor 488 paramètre (coloration de l'ADN) dans les graphiques de tri. Si nécessaire, ajouter 1 pl deSYTO16 au tube de tri pour atteindre la saturation.
   3. Afficher les événements au total sur un graphique affichant les paramètres suivants: nombre d'événements vs Alexa Fluor 488-A.
   4. Sélectionner les cellules à coloration positive de l'ADN avec une porte, comme représenté sur la figure 1.
      1. Afficher les cellules de la porte du 1 sur un graphique en utilisant SSC-A vs FSC-A en tant que paramètres
         1. Sélectionnez les cellules avec Gate 2, comme le montre la figure 1.
         2. Afficher les cellules de Gate 2 sur un graphique en utilisant FSC-A vs Alexa Fluor 488-A en tant que paramètres.
         3. Sélectionnez les cellules avec Porte 5 et 6 porte sur Gate 2 graphique, comme le montre la figure 1.
         4. Afficher séparément Porte 5 et 6 porte sur des graphiques en utilisant Alexa Fluor 488-W vs Alexa Fluor 488-A en tant que paramètres.
         5. Sélectionnez spermiogenèse étapes 1-9 spermatides sur le graphique Porte 5 et spermiogenèse étapes 10-12 spermatides sur la grille 6 graphiques, comme le montre la figure 1.
      2. Affichageles cellules de la porte du 1 sur un graphique en utilisant FSC-A vs Alexa Fluor 488-A en tant que paramètres
         1. Sélectionnez les cellules avec les entrées 3 et 4, comme le montre la figure 1.
         2. Afficher séparément Porte 3 et la porte 4 graphiques utilisant Alexa Fluor 488-W vs Alexa Fluor 488-A en tant que paramètres.
         3. Sélectionnez spermiogenèse étapes 13-14 spermatides sur le graphique Porte 3 et spermiogenèse étapes 15-16 spermatides sur le graphique porte 4, comme le montre la figure 1.

Résultats

Stratégie d'entrée sont utilisés avec la cytométrie en flux

Figure 1 représente la stratégie de déclenchement utilisé dans la cytométrie en flux pour trier quatre populations de spermatides très pures. Brièvement, les cellules dont la coloration de l'ADN positif (Alexa Fluor 488-A) sont d'abord sélectionné avec la Porte 1. Spermatides de spermiogenèse steps 1-12 sont sélectionnés (G...

Discussion

Les cellules de la spermatogenèse ont toujours été difficiles à étudier étant donné la complexité de l'épithélium séminifère, ainsi que le succès limité de la culture in vitro. Au fil des ans, de nombreuses approches pour purifier les cellules germinales à partir de diverses espèces ont été développés. En utilisant des techniques de purification sédimentation par gravité avec des gradients de Percoll ou d'albumine bovine de sérum fournissent un bon rendement des cellules germinale...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Isoflurane	ABBOT	05260-05	For mouse anesthesia before euthanasia
Fetal bovine serum	Wisent	90150	For tube coating
1x PBS
EDTA	BioShop	EDT	For sorting buffer preparation
HEPES	Sigma	H	For sorting buffer preparation
100% Ethanol	Les alcools de commerce	092-09-11N	For cell fixation
SYTO 16	Life Technologies	S7578	DNA staining
5 ml polypropylene round bottom tubes	BD Falcon	352063	Sorted cells collection
15 ml polypropylene conical bottom tubes	PROgene	1500
50 ml polypropylene conical bottom tubes	PROgene	5000
TEC4 anaesthetic vaporizer	Ohmeda	1160526	For mouse euthanasia
CO2 gas tank	Praxair	C799117902	For mouse euthanasia
O2 gas tank	Praxair	O254130501	For mouse euthanasia
Homemade mouse gas chamber			For mouse euthanasia
40 µm Falcon cell strainer	Corning Incorporated	352340
50 μm sample line filters	BD Biosciences	649049
Vortex mixer	Labnet international, inc.	S0200	For cell fixation
Dynac centrifuge	Clay Adams	101
Celltrics 50 µm filters	Partec	04-004-2327
488 nm laser-euipped cell sorter	BD Biosciences	FACSAria III
Accudop Fluorescent Beads	BD Biosciences	345249
Sorting Buffer: 1x PBS, 1 mM EDTA pH 8.0, 25 mM HEPES pH 7.0, 1% FBS			FBS is heat-inactivated. Make fresh solution, 0.22 μm filtered and keep at 4°C.