Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

The epicardium is an essential source of multipotent cardiovascular progenitor cells and paracrine factors that are required for cardiovascular development and regeneration. We describe here a method to culture mouse embryonic epicardial cells.

Abstract

During embryogenesis, the epicardial contribution to coronary vasculature development has been very well established. Cells derived from the epicardium differentiate into smooth muscle cells, fibroblasts and endothelial cells that contribute to the formation of coronary vessels. Here we have established an in vitro culture method for embryonic epicardial cells. Using genetic labelling, we have demonstrated that the majority of the migrating cells in our explant culture are of epicardial origin. Epicardial explant cells also retain the expression of epicardial markers (Wt1 and Tbx18). Furthermore, we provide evidence that epicardial explant cells undergo epithelial to mesenchymal transition (EMT), migrate and differentiate into smooth muscle cells after Transforming growth factor beta 1 (TGF-β1) treatment in a manner indistinguishable from that of epicardial cells in vivo. In conclusion, we provide a novel method for the culture of embryonic epicardial cells, which will help to explore the role of specific genes in epicardial cell biology.

Introduction

وقد أوضح ثروة من البيانات التجريبية أن النخاب يؤثر خطوات حاسمة في تطوير القلب. خلال التنمية، والمستعرض الحاجز يؤدي إلى كتلة من الخلايا الظهارية المعروفة باسم proepicardium 1-4. خلايا من proepicardium ثم تهاجر ومغلف عضلة القلب تشكيل النخاب. وفي أعقاب ذلك، مجموعة فرعية من الخلايا النخابية الخضوع EMT مما أدى إلى هجرة السكان من الخلايا المشتقة النخاب (EPDCs) التي تغزو في وقت لاحق عضلة القلب. وقد أظهرت النسب الوراثي وكذلك فيروسات تتبع التجارب التي EPDCs تفرق في مختلف الأنساب بما في ذلك خلايا العضلات الملساء، الخلايا الليفية، الخلايا البطانية والعضلية (إن وجدت). لذلك EPDCs تساهم بشكل كبير في تطوير الأوعية الدموية التاجية والهندسة المعمارية عضلة القلب 1،2،4-9. وعلاوة على ذلك، فإن النخاب أمر ضروري لتطوير طبقة المدمجة البطين 10-12. لهأظهرت xample Gittenberger دي غروت آخرون أن تثبيط آل إليه proepicardium يؤدي إلى مجموعة من العيوب مثل عضلة القلب رقيقة، حلقات ناقصة من القلب وغير طبيعي تشكيل حاجز بين البطينين، ونتيجة لذلك، الفتك الجنينية 13. عوامل نظير الصماوي يفرز من النخاب الجنينية تعدل انتشار cardiomyocyte والتمايز. واتساقا مع ذلك، أدى الحذف النخاب معين من مسارات الإشارات مثل حمض الريتينويك (RA)، وعوامل نمو الخلايا الليفية (عوامل النمو FGFs) وWNT / β-كاتينين في نمو عضلة القلب المعيبة والفتك الجنينية 14-16.

على الرغم من أنه يعتقد بأن النخاب أن تكون هادئة في قلوب الكبار، وقد أظهرت الدراسات الحديثة أن يتم إعادة تنشيط البرنامج التنموي في النخاب التالية إصابة القلب 17،18. عند التنشيط، والخلايا تخضع انتشار السريع وEMT التي تؤدي إلى تشكيل EPDC. هذه الخلايا تحدث نفس capacitذ أن تفرق في الخلايا الليفية وخلايا العضلات الملساء ولكن ليس العضلية أو الخلايا البطانية 18. بالإضافة إلى ذلك، EPDCs تفرز عوامل proangiogenic التي تساعد في الأوعية الدموية في المنطقة المصابة، وبالتالي تسهل تحسين وظيفة القلب عن طريق تقليل حجم احتشاء. ونظرا لهذه النتائج، اكتسبت النخاب الفائدة في دراسة التطور القلب والأوعية الدموية والأمراض والتجدد.

التكنولوجيا المعدلة وراثيا قد أحدثت ثورة الأبحاث الطبية في القرن ال21. مع المعونة من التكنولوجيا المعدلة وراثيا، ونماذج الماوس المريضة محاكاة حالة الإنسان عملية الأيض وpathophysiologically وقد وضعت بنجاح. ومع ذلك، فقد تم دراسة سلوك الخلية النخابية في هذه المسوخ تحديا ويرجع ذلك أساسا إلى الفتك الجنينية المبكرة. وبالنظر إلى الدور الهام الذي النخاب يلعب في التنمية القلب والتجديد، وأنشأنا نظام الثقافة في المختبر لعلاية الفؤاد الماوسخلايا لتر. وتسمح هذه الطريقة للثقافة على المدى الطويل من الخلايا النخابية ويسهل دراسة مفصلة لاثنين من الخصائص الهامة للالنخاب: قدرته على الهجرة والتمييز. يمكن زرع البطينين المستأصل من الماوس على المواد الهلامية الكولاجين والتي يمكن استخدامها لإجراء فحوصات الهجرة. يتم تربيتها في مصفوفة 3D أن يعيد مصفوفة الكولاجين الغنية خارج الخلية في الطبقة تحت التأمور يلخص في الجسم الحي خلية علم وظائف الأعضاء بشكل أفضل. وبدلا من ذلك يمكن تربيتها على الشرائح غرفة من أجل إنشاء أحادي الطبقة النخابية التي يمكن استخدامها لمجموعة متنوعة من التطبيقات المصب. هذا أحادي الطبقة يمكن أن تستخدم لصبغ للبروتينات تقاطع الضيقة التي ستوفر رؤى حول قدرة النخاب الخضوع EMT وهو أمر حاسم للهجرة. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن أيضا أن يتم التجارب التمايز الخروج على هذه الخلايا. وعلاوة على ذلك، يمكن تحليل الجينات الشخصية التعبير عن طريق استخراج الحمض النووي الريبي من الخلايا وأداء الكمي تفاعل البلمرة المتسلسل (QPCR). وأخيرا، يمكن أيضا التعامل مع الطبقات الوحيدة مع وكلاء تليها التحليل الجزيئي لاختبار العلاجات المحتملة. وضعت معا، وهذا النظام الثقافة النخابية يوفر لنا الفرصة لتصور وجمع البيانات الجزيئية التي تعزز فهمنا حول تطوير النخابية.

ميزة أخرى مرغوبة من هذا الأسلوب هو أنه واضح وصريح وليس هناك حاجة الإعداد مزيدا من التفاصيل. باختصار، يتم حصاد الأجنة في E11.5 أو E12.5 يلي الذي رفعه القلب. البطينين ثم يتم تربيتها على أي هلام الكولاجين أو الشرائح غرفة. وفي وقت لاحق، وهذه الخلايا يمكن استخدامها لإجراء التجارب المصب.

Protocol

تمت الموافقة على جميع التجارب من قبل لجنة رعاية الحيوان المؤسسية واستخدام ديوك-جامعة سنغافورة الوطنية كلية الدراسات العليا الطبية.

1. استرداد الجنينية البطينات

  1. تضحية الماوس حاملا توقيت في المرحلة الجنينية المطلوب (E11.5 أو E12.5) باستخدام غرفة القتل الرحيم مع امدادات الغاز ثاني أكسيد الكربون أو أسلوب آخر القتل الرحيم المعتمدة.
  2. ضع الماوس على ظهرها على طاولة تشريح. تطهير البطن من الأنثى مع الايثانول 70٪. رفع الجلد فوق البطن وإجراء شق صغير (1-2 سم) مع شفرة، ثم اضغط على الجلد بكلتا يديه وسحب بعيدا لفضح جدار البطن.
  3. الآن قطع جدار البطن لفضح قرن الرحم. استخدام ملقط معقم لرفع قرن الرحم وقطع بعناية بعيدا أنسجة الدهون والأوعية الدموية التي تعلق على قرن الرحم. قطع في عنق الرحم لاسترداد الرحم.
  4. ضع قرن الرحم في طبق بتري تحتوي على العقيمة الباردة 1X الفوسفات بوف الدو المالحة (PBS) وشطف بلطف. وضع طبق بتري على الجليد.
  5. استخدام المقص لقطع طريق خط الوسط من قرن الرحم (مقابل إلى الموقع حيث يقع المشيمة) لفضح الأجنة التي لا تزال داخل الكيس المحي وتعلق على جدار الرحم عن طريق المشيمة.
  6. باستخدام ملقط معقم، وقطع فتح الكيس المحي الجنينية لتحرير الجنين.
  7. وضع الجنين في طبق بتري جديدة تحتوي على العقيمة الباردة برنامج تلفزيوني 1X. قطع رأس الجنين ووضعه على ظهرها. قطع مفتوحة في جدار الصدر للكشف عن القلب.
  8. استخدام ملقط معقم لرفع القلب وقطع الأوعية حوله لتحرير القلب من جدار الصدر. إيلاء اهتمام خاص على عدم الإضرار النخاب من القلب مع الأدوات الجراحية.
  9. تقليم قبالة المسالك تدفق وكل من الأذينين. نقل البطين إلى طبق آخر مع 1X PBS الباردة. وضع الطبق على الجليد.
  10. كرر الخطوات من 1،6-1،9 حتى يتم استرداد جميع البطينين.
لو "> 2. النخابية يزدرع الثقافة

ملاحظة: ثقافة هذه إإكسبلنتس النخابية إما على الشرائح غرفة زجاجية أو في جل الكولاجين لتطبيقات المصب.

  1. زجاج غرفة الشرائح
    1. لإعداد وسائل الإعلام والثقافة، وإضافة 10٪ مصل بقري جنيني (FBS)، 1٪ البنسلين / الستربتومايسين و2 نانوغرام / مل عامل نمو الخلايا الليفية المؤتلف 2 (FGF2) إلى متوسطة تعديل النسر Dulbecco وفي (DMEM). تنفيذ كافة الخطوات في غطاء تدفق الصفحي.
    2. إضافة وسائط الثقافة 500 ميكرولتر إلى كل بئر من غرفة 8-جيدا.
    3. وضع كل البطين رفعه في وسط البئر. توجيه البطين للحفاظ على الجانب تشريح أسفل على السطح السفلي من البئر.
    4. وضع بلطف لوحة في 37 درجة مئوية، و 5٪ CO 2 ثقافة الخلية الحاضنة.
    5. الحفاظ على الثقافة مع الحد الأدنى من اضطراب للسماح للإإكسبلنتس على الانضمام. تشكيل أحادي الطبقة النخابية يمكن ملاحظتها بعد 48-72 ساعة.
    6. لتمايز epicardخلايا الاتحاد العالمي للتعليم في خلايا العضلات الملساء والثقافة الخلايا أحادي الطبقة النخابية في وسائل الإعلام التمايز لمدة 6 أيام أخرى. لإعداد وسائل الإعلام التمايز، وإضافة 10٪ FBS، 1٪ البنسلين / الستربتومايسين و 50 نانوغرام / مل المؤتلف عامل النمو التحويلي بيتا 1 (TGF-β1) لDMEM.
    7. تغيير ثقافة وسائل الإعلام يوما بعد يوم.
  2. الكولاجين جل
    1. تحضير هلام الكولاجين في لوحة 96-جيدا باستخدام مجموعة 3D الكولاجين الثقافة التجارية وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
    2. لإعداد حجم المطلوب من هلام الكولاجين، وخلط كمية مناسبة من محلول الكولاجين مع 5X من DMEM وماصة صعودا وهبوطا. الحل يجب أن تتحول الصفراء.
    3. إضافة حجم المقابلة من حل المعادلة وتخلط جيدا فورا من قبل pipetting صعودا وهبوطا. فإن الحل بدوره الوردي.
    4. ماصة 100 ميكرولتر من هذا الخليط في كل بئر من لوحة 96-جيدا. وضع لوحة في 37 درجة مئوية، و 5٪ CO 2 الحاضنة لمدة 30-60 دقيقة إلى alانخفاض هلام لتتبلمر.
    5. إضافة 200 ميكرولتر من وسائل الإعلام ثقافة المذكورة أعلاه إلى كل بئر.
    6. وضع كل البطين رفعه في وسط البئر. الشرق البطين للحفاظ على الجانب تشريح أسفل على جل الكولاجين (قمة البطين يجب مواجهة مجرب). وضع بلطف لوحة مرة أخرى في حاضنة الثقافة الخلية.
    7. بعد 3 أيام، وإزالة البطينين. وضع لوحة العودة إلى الحاضنة زراعة الخلايا لمدة 2 ايام اخرى.
    8. تغيير ثقافة وسائل الإعلام يوما بعد يوم.

3. التثبيت والتخيل

ملاحظة: يمكن تصور خلايا النخابية على أي من الشرائح الزجاجية غرفة أو هلام الكولاجين.

  1. نضح من وسائل الإعلام والثقافة، وإضافة حجم مساو من العقيمة برنامج تلفزيوني 1X لغسل الخلايا.
  2. إضافة ما يكفي 4٪ بارافورمالدهيد (PFA) لتغطية الخلايا. إصلاح الخلايا لمدة 10 دقيقة على 4 درجات مئوية.
  3. إزالة PFA وتغسل إإكسبلنتس مع 1X PBST (برنامج تلفزيوني 1X مع0.1٪ X-100 تريتون) لpermeabilize الخلايا.
  4. Immunostain مع الأجسام المضادة المطلوبة (مثل اليكسا فلور 488 phalloidin، ZO-1، α-تويولين وα السلس الأكتين العضلات) 7.

النتائج

باستخدام هذا البروتوكول الثقافة، والخلايا النخابية الأولية يمكن أن تكون معزولة مع نقاء عالية للتطبيقات المصب. الخلايا المستنبتة هي قادرة على الخضوع EMT، الهجرة وتفرق تماما كما تفعل الخلايا النخابية في الجسم الحي.

Discussion

ومن محوريا لتطوير التقنيات التي تسهل دراسة النخاب لتلبية الأهمية المتزايدة للالنخاب في التنمية القلب والتجدد. نظام الثقافة النخابية يطرح مزايا هامة للبحث النخابية.

وسيلة بديلة لعزل الخلايا النخابية هو استخدام مضان تنشيط الفرز ...

Disclosures

The authors declare that they have no competing financial interests.

Acknowledgements

وأيد هذا العمل من جانب صناديق من دوق-جامعة سنغافورة الوطنية العليا الطبي مدرسة سنغافورة، ومؤسسة جوه وسنغافورة جبهة الخلاص الوطني الزمالة (جبهة الخلاص الوطني، NRFF2016-01) إلى Manvendra ك سينغ.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM)Life tech invitrogen 11995065
Penicillin/streptomycin solutionLife tech invitrogen 15140122
Fetal bovine serum (FBS) Life tech invitrogen 10500064
ParaformaldehydeSigmaP6148-5KG
Recombinant fibroblast growth factor 2 (FGF2)PeproTech450-33
Recombinant transforming growth factor beta 1 (TGF-β1)PeproTech100-21
ZO-1 antibodyLife tech invitrogen 40-2200
α-Tubulin antibodySigmaT 6074
α-smooth muscle actin (SMA) antibodySigmaA 2547
Phalloidin antibodyLife tech invitrogen A12379
3D Collagen Culture kit Millipore ECM 675
8-well chamber slideFisher ScientificNNU 154534-PK
Trizol reagentLife Technologies15596-018
ViiA 7 Real-Time PCR SystemLife Technologies4453536
Superscript First Strand Synthesis kitLife Technologies11904-018

References

  1. Mikawa, T., Fischman, D. A. Retroviral analysis of cardiac morphogenesis: discontinuous formation of coronary vessels. Proc Natl Acad Sci U S A. 89, 9504-9508 (1992).
  2. Mikawa, T., Gourdie, R. G. Pericardial mesoderm generates a population of coronary smooth muscle cells migrating into the heart along with ingrowth of the epicardial organ. Dev Biol. 174, 221-232 (1996).
  3. Manner, J., Perez-Pomares, J. M., Macias, D., Munoz-Chapuli, R. The origin, formation and developmental significance of the epicardium: a review. Cells Tissues Organs. 169, 89-103 (2001).
  4. Gittenberger-de Groot, A. C., Vrancken Peeters, M. P., Mentink, M. M., Gourdie, R. G., Poelmann, R. E. Epicardium-derived cells contribute a novel population to the myocardial wall and the atrioventricular cushions. Circ Res. 82, 1043-1052 (1998).
  5. von Gise, A., Pu, W. T. Endocardial and epicardial epithelial to mesenchymal transitions in heart development and disease. Circ Res. 110, 1628-1645 (2012).
  6. Katz, T. C., et al. Distinct compartments of the proepicardial organ give rise to coronary vascular endothelial cells. Dev Cell. 22, 639-650 (2012).
  7. Singh, M. K., Lu, M. M., Massera, D., Epstein, J. A. MicroRNA-processing enzyme Dicer is required in epicardium for coronary vasculature development. J Biol Chem. 286, 41036-41045 (2011).
  8. Degenhardt, K., Singh, M. K., Epstein, J. A. New approaches under development: cardiovascular embryology applied to heart disease. J Clin Invest. 123, 71-74 (2013).
  9. Singh, M. K., Epstein, J. A. Epicardium-derived cardiac mesenchymal stem cells: expanding the outer limit of heart repair. Circ Res. 110, 904-906 (2012).
  10. Manner, J. Experimental study on the formation of the epicardium in chick embryos. Anat Embryol (Berl). 187, 281-289 (1993).
  11. Manner, J., Schlueter, J., Brand, T. Experimental analyses of the function of the proepicardium using a new microsurgical procedure to induce loss-of-proepicardial-function in chick embryos. Dev Dyn. 233, 1454-1463 (2005).
  12. Pennisi, D. J., Ballard, V. L., Mikawa, T. Epicardium is required for the full rate of myocyte proliferation and levels of expression of myocyte mitogenic factors FGF2 and its receptor, FGFR-1, but not for transmural myocardial patterning in the embryonic chick heart. Dev Dyn. 228, 161-172 (2003).
  13. Gittenberger-de Groot, A. C., Vrancken Peeters, M. P., Bergwerff, M., Mentink, M. M., Poelmann, R. E. Epicardial outgrowth inhibition leads to compensatory mesothelial outflow tract collar and abnormal cardiac septation and coronary formation. Circ Res. 87, 969-971 (2000).
  14. Lavine, K. J., et al. Endocardial and epicardial derived FGF signals regulate myocardial proliferation and differentiation in vivo. Dev Cell. 8, 85-95 (2005).
  15. Merki, E., et al. Epicardial retinoid X receptor alpha is required for myocardial growth and coronary artery formation. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 18455-18460 (2005).
  16. Stuckmann, I., Evans, S., Lassar, A. B. Erythropoietin and retinoic acid, secreted from the epicardium, are required for cardiac myocyte proliferation. Dev Biol. 255, 334-349 (2003).
  17. Huang, G. N., et al. C/EBP transcription factors mediate epicardial activation during heart development and injury. Science. 338, 1599-1603 (2012).
  18. Zhou, B., et al. Adult mouse epicardium modulates myocardial injury by secreting paracrine factors. J Clin Invest. 121, 1894-1904 (2011).
  19. Christoffels, V. M., et al. Tbx18 and the fate of epicardial progenitors. Nature. 458, 8-9 (2009).
  20. Rudat, C., Kispert, A. Wt1 and epicardial fate mapping. Circ Res. 111, 165-169 (2012).
  21. Duim, S. N., Kurakula, K., Goumans, M. J., Kruithof, B. P. Cardiac endothelial cells express Wilms' tumor-1: Wt1 expression in the developing, adult and infarcted heart. J Mol Cell Cardiol. 81, 127-135 (2015).
  22. Iyer, D., et al. Robust derivation of epicardium and its differentiated smooth muscle cell progeny from human pluripotent stem cells. Development. 142, 1528-1541 (2015).
  23. Witty, A. D., et al. Generation of the epicardial lineage from human pluripotent stem cells. Nat Biotechnol. 32, 1026-1035 (2014).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

110 Proepicardium EMT

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved