Fare Embriyonik From The Heart Epikardiyal Hücrelerinin Vitro Kültür

Özet

The epicardium is an essential source of multipotent cardiovascular progenitor cells and paracrine factors that are required for cardiovascular development and regeneration. We describe here a method to culture mouse embryonic epicardial cells.

Özet

During embryogenesis, the epicardial contribution to coronary vasculature development has been very well established. Cells derived from the epicardium differentiate into smooth muscle cells, fibroblasts and endothelial cells that contribute to the formation of coronary vessels. Here we have established an in vitro culture method for embryonic epicardial cells. Using genetic labelling, we have demonstrated that the majority of the migrating cells in our explant culture are of epicardial origin. Epicardial explant cells also retain the expression of epicardial markers (Wt1 and Tbx18). Furthermore, we provide evidence that epicardial explant cells undergo epithelial to mesenchymal transition (EMT), migrate and differentiate into smooth muscle cells after Transforming growth factor beta 1 (TGF-β1) treatment in a manner indistinguishable from that of epicardial cells in vivo. In conclusion, we provide a novel method for the culture of embryonic epicardial cells, which will help to explore the role of specific genes in epicardial cell biology.

Giriş

Deneysel verilerin bir servet epicardium kalp gelişiminde kritik adımlar etkilediğini gösterdik. Gelişimi sırasında, septum transversum proepicardium ^1-4 şekilde bilinmektedir mezotelyal hücrelerinin bir yığın yol açar. proepicardium gelen hücreler, göç ve endokard oluşturucu miyokard zarf. Bunu takiben, epikardiyal hücrelerinin bir alt, daha sonra miyokard işgal epikardiyum türetilmiş hücreler (EPDCs) içindeki bir göç popülasyonuna EMT veren yükselmesine uğrar. Deney izleme genetik olarak retroviral nesilli EPDCs düz kas hücreleri, fibroblastlar, endotel hücreleri ve kardiyomiyositlerde (eğer varsa) dahil olmak üzere çeşitli soy ayırt olduğunu göstermiştir. Bu nedenle EPDCs koroner damar sistemi ve miyokard mimarisinin ^1,2,4-9 gelişmesine önemli katkı sağlamaktadır. Ayrıca, epikardiyum ventriküler yoğun tabakaya ^10-12 gelişimi için gereklidir. example Gittenberger-de Groot ve ark., proepicardium aşırı büyümesini inhibe etmek, örneğin ince bir miyokard, kalp ve anormal septum oluşumu eksikliği döngü gibi bir sonucu olarak, embriyo ölümüne ¹³ gibi kusurları bir dizi yol açtığı gösterilmiştir. embriyonik epicardium salgılanan parakrin faktörler kardiyomiyosit çoğalmasını ve farklılaşmasını modüle. Buna uygun olarak, bu tür retinoik asit (RA), fibroblast büyüme faktörleri (FGFs) ve Wnt / β-katenin olarak sinyal yollarının epikardiyum özgü silinmesi bozuk miyokardiyal büyüme ve embriyonik öldürücülüğü ^14-16 sonuçlandı.

Epicardium yetişkin kalpte sessiz olduğuna inanılan olmasına rağmen, son yıllarda yapılan çalışmalarda gelişimsel bir program kardiyak hasar ^17,18 aşağıdaki epicardium olarak yeniden olduğunu göstermiştir. aktivasyonu üzerine, hücreler EPDC oluşumuna neden hızla çoğalması ve EMT geçer. Bu hücreler capacit sergileyenY, fibroblast ve düz kas hücrelerinin değil kardiyomiyositlerde ve endotel hücreleri ¹⁸ ayırt etmek. Buna ek olarak, EPDCs yaralı bölgenin damarlanma yardım ve böylece enfarktüs boyutunu azaltarak gelişmiş kardiyak fonksiyonu kolaylaştıran proanjiyogenik faktörler salgılar. Nedeniyle bu bulgulara, epicardium kardiyovasküler geliştirme, hastalık ve yenilenme çalışmasında ilgi kazanmıştır.

Transgenik teknoloji 21. yüzyılda tıbbi araştırma devrim yarattı. Transgenik teknolojilerin yardımıyla, metabolik ve patofizyolojik insan durumunu taklit eden hastalıklı fare modelleri başarıyla geliştirilmiştir. Ancak, bu mutantlar epikardiyal hücre davranışını okuyan erken embriyonik öldürücülüğü kaynaklanmaktadır bir meydan okuma olmuştur. Epicardium kalp gelişim ve yenilenme oynadığı önemli rol göz önüne alındığında, biz fare epicardia için bir in vitro kültür sistemi kurdukL hücreleri. Bu yöntem, epikardiyal hücrelerin uzun süreli kültür sağlar ve endokard iki önemli özelliklerinin detaylı bir çalışma kolaylaştırır: göç eder ve ayırt etme yeteneği. fare eksize ventriküller geçiş deneyleri yürütmek için kullanılabilir kollajen jel üzerinde kültürlenebilir olabilir. Daha subepikardiyal tabakanın kollajen zengin hücre dışı matrisi çoğaltır, in vivo hücre fizyolojisi tekrarlar 3B matris içinde kültüre edildikten. Alternatif olarak daha sonra aşağı doğru çeşitli uygulamalar için kullanılabilir epikardiyal tek tabaka oluşturmak amacıyla oda slaytlar üzerinde kültürlenebilir. Bu tek-katmanın taşıma için çok önemlidir EMT geçmesi epikardiyumun yeteneği hakkında bilgiler sağlayacaktır sıkı bağlantı proteinleri için leke kullanılabilir. Buna ek olarak, farklılaşma deneyler de bu hücrelerde gerçekleştirilebilir. Bundan başka, gen ekspresyon profili hücrelerinden RNA ekstrakte ile analiz edilebilir vekantitatif polimeraz zincir reaksiyonu (qPCR) gerçekleştirmek. Son olarak, tek tabakalar, aynı zamanda potansiyel terapötikler test etmek için bir moleküler analiz, ardından maddelerle tedavi edilebilir. Birlikte koymak, bu epikardiyal kültür sistemi görselleştirmek ve epikardiyal gelişimi hakkında anlayışımızı furthers moleküler veri toplamak için fırsat sağlıyor.

Bu yöntemin diğer bir istenen özelliği, basittir ve herhangi karmaşık ayar gerekli olmasıdır. Kısaca, embriyolar kalp eksize E11.5 veya E12.5 aşağıda hasat edilir. ventriküller sonra kollajen jel veya oda slaytlar ya üzerinde yetiştirilmiştir. Daha sonra, bu hücreler, aşağı doğru deneyler kullanılabilir.

Protokol

Tüm deneyler Duke-NUS Lisans Tıp Fakültesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından kabul edildi.

1. Embriyonik karıncıklar alınıyor

1. karbondioksit gaz temini veya başka bir onaylanmış ötenazi yöntemi ile bir ötenazi odasını kullanarak istenen embriyonik aşamada (E11.5 veya E12.5) bir zaman aşımına hamile fare Kurban.
2. diseksiyon masaya sırtında fare yerleştirin. % 70 etanol ile kadın karın dezenfekte edin. karın üzerindeki deriyi kaldırın ve bir bıçak ile küçük bir kesi (1-2 cm) yapmak, sonra iki elinizle cildinizi tutun ve karın duvarı açığa çıkarmak için uzağa çekin.
3. Şimdi uterin boynuz maruz karın duvarı kesti. uterin horn yukarı kaldırmak için steril forseps kullanın ve dikkatli uterin boynuz bağlı yağ doku ve kan damarları kesip. serviks kesilmiş uterusu almak için.
4. Steril soğuk 1x Fosfat Buff içeren bir petri uterin horn koyun Ered tuz (PBS) ve yavaşça çalkalayın. Buz üzerinde petri yerleştirin.
5. yumurta sarısının içinde hala ve plasenta yoluyla rahim duvarına bağlı embriyolar maruz (ters plasenta bulunduğu siteye) uterin horn orta hat boyunca kesmek için makas kullanın.
6. Steril forseps kullanarak, embriyo serbest embriyonik yolk sac açık kesti.
7. Steril soğuk 1x PBS içeren yeni bir petri embriyo yerleştirin. embriyo başını kesmek ve sırtında üzerine yerleştirin. kalp maruz göğüs duvarı açık kesti.
8. kalbi kaldırın ve göğüs duvarından kalbini kurtarmak için onun etrafında damarları kesip steril forseps kullanabilir. cerrahi aletler ile kalbin epikardiyumu zarar vermemek için özen gösterin.
9. çıkış yolunu hem atriyumları keserek. Soğuk 1x PBS ile başka bir çanak ventrikül aktarın. Buz üzerinde çanak yerleştirin.
10. Tekrarlayın tüm karıncık alınır kadar 1.6-1.9 adımları.

le "> 2. Epikardiyal Eksplantasyon Kültür

Not: Kültür cam haznesi slaytlar üzerinde ya da alt uygulamalar için kollajen jel üzerinde ya bu epikardiyal eksplantlar.

1. Cam Odası Slaytlar
   1. Kültür ortamı hazırlamak Dulbecco tadil edilmiş Eagle ortamı (DMEM)% 10 fetal sığır serumu (FBS),% 1 penisilin / streptomisin ve 2 ng / ml yeniden birleştirici fibroblast büyüme faktörü 2 (FGF2) ekleyin. laminer akış kaputu tüm adımları uygulayın.
   2. 8 oyuklu bölmenin her bir kuyu için 500 ul kültür ortamı eklenir.
   3. Bir kuyunun merkezinde her eksize ventrikül yerleştirin. iyi alt yüzeyinde aşağı disseke tarafı tutmak için ventrikül yönlendirmek.
   4. Yavaşça 37 ° C,% 5 _CO2, hücre kültürü inkübatöründe plaka koydu.
   5. eksplantlar uymak için izin minimum rahatsızlık kültürünü korumak. Epikardiyal tek tabaka oluşumu 48-72 saat sonra gözlenebilir.
   6. epicard ayrımındadüz kas hücreleri, kültür bir 6 gün farklılaşma medya epikardiyal tek tabakalı hücreler içine ial hücreleri. Farklılaşma ortam hazırlamak DMEM,% 10 FBS,% 1 penisilin / streptomisin ve 50 ng / ml yeniden birleştirici transforme edici büyüme faktörü beta 1 (TGF-β1) ekleyin.
   7. diğer günlerde kültür ortamı değiştirin.
2. kollajen jel
   1. imalatçının protokolüne göre, ticari bir 3 boyutlu Kollajen Kültür kiti kullanılarak bir 96-çukurlu plaka içinde kollajen jel hazırlayın.
   2. kollajen jel istenilen hacmi hazırlamak için, DMEM 5x ve pipet yukarı ve aşağı kollajen çözüm uygun miktarda karıştırın. Çözelti sarı dönmelidir.
   3. nötralizasyon solüsyonu gelen hacim ekleme ve yukarı ve aşağı pipetleme iyice hemen karıştırın. Çözelti pembe dönecek.
   4. Pipet, 96 oyuklu plakanın her bir oyuğuna, bu karışımın 100 ul. Al, 30-60 dakika boyunca 37 ° C,% 5 _CO2 inkübatörü içinde plakasınıdüşük jel polimerize etmek.
   5. Her bir oyuğa, yukarıda tarif edilen kültür ortamı 200 ul ekle.
   6. Bir kuyunun merkezinde her eksize ventrikül yerleştirin. Orient ventrikül (deneyci bakmalıdır ventrikül apeks) kollajen jel üzerinde disseke tarafı tutmak için. Yavaşça geri hücre kültürü inkübatör plaka koymak.
   7. 3 gün sonra, ventriküllere kaldırın. başka bir 2 gün hücre kültürü kuvöz içine geri plaka koyun.
   8. diğer günlerde kültür ortamı değiştirin.

3. Fiksasyon ve Görselleştirme

Not: Epikardiyal hücreler cam haznesi slaytlar veya kollajen jel ya da üzerinde görülebilir.

1. kültür ortamı üzerinden aspire ve hücreleri yıkamak için steril 1x PBS eşit hacimde ekleyin.
2. hücreleri kaplamak için yeterli miktarda% 4 paraformaldehit (PFA) ekleyin. 4 ° C'de 10 dakika boyunca hücreler sabitleyin.
3. PFA çıkarın ve 1x PBST (1x PBS ile eksplantlar yıkayın% 0.1 Triton X-100) hücreleri geçirgenliği.
4. İstenen antikor (örneğin, Alexa Fluor 488-falloidin, ZO-1, α-tubulin α-düz kas aktini) ile immunostain ^7.

Sonuçlar

Bu kültürün protokolü kullanılarak, primer epikardiyal hücreleri alt uygulamalar için yüksek saflıkta izole edilebilir. Kültürlü hücreler, EMT tabi göç ve epikardiyal hücreleri in vivo olduğu gibi ayırt edebiliyoruz.

Birincil epikardiyal hücre kültürünün saflığını belirlemek için, Sema3d ^{GFPCre / +} elde epikardiyal eksplantlar analiz R26 ^{Tom / ...}

Tartışmalar

Kalp gelişme ve rejenerasyon epikarda artan önemi hitap epikardiyumun çalışma kolaylaştıran teknikleri geliştirmek için kilit önem taşımaktadır. epikardiyal kültür sistemi epikardiyal araştırma için önemli avantajlar getirmektedir.

Epikardiyal hücreleri izole etmek için alternatif bir yol floresans ile aktive edilen hücre tasnif (FACS) kullanmaktır. Bu yöntem, diğer soylarından epikardiyal hücreleri ayırmak için epikardiyal belirteçleri (veya floresan protein ep...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM)	Life tech invitrogen	11995065
Penicillin/streptomycin solution	Life tech invitrogen	15140122
Fetal bovine serum (FBS)	Life tech invitrogen	10500064
Paraformaldehyde	Sigma	P6148-5KG
Recombinant fibroblast growth factor 2 (FGF2)	PeproTech	450-33
Recombinant transforming growth factor beta 1 (TGF-β1)	PeproTech	100-21
ZO-1 antibody	Life tech invitrogen	40-2200
α-Tubulin antibody	Sigma	T 6074
α-smooth muscle actin (SMA) antibody	Sigma	A 2547
Phalloidin antibody	Life tech invitrogen	A12379
3D Collagen Culture kit	Millipore	ECM 675
8-well chamber slide	Fisher Scientific	NNU 154534-PK
Trizol reagent	Life Technologies	15596-018
ViiA 7 Real-Time PCR System	Life Technologies	4453536
Superscript First Strand Synthesis kit	Life Technologies	11904-018