Coltura in vitro di cellule provenienti da epicardici Cuore embrionali di topo

Riepilogo

The epicardium is an essential source of multipotent cardiovascular progenitor cells and paracrine factors that are required for cardiovascular development and regeneration. We describe here a method to culture mouse embryonic epicardial cells.

Abstract

During embryogenesis, the epicardial contribution to coronary vasculature development has been very well established. Cells derived from the epicardium differentiate into smooth muscle cells, fibroblasts and endothelial cells that contribute to the formation of coronary vessels. Here we have established an in vitro culture method for embryonic epicardial cells. Using genetic labelling, we have demonstrated that the majority of the migrating cells in our explant culture are of epicardial origin. Epicardial explant cells also retain the expression of epicardial markers (Wt1 and Tbx18). Furthermore, we provide evidence that epicardial explant cells undergo epithelial to mesenchymal transition (EMT), migrate and differentiate into smooth muscle cells after Transforming growth factor beta 1 (TGF-β1) treatment in a manner indistinguishable from that of epicardial cells in vivo. In conclusion, we provide a novel method for the culture of embryonic epicardial cells, which will help to explore the role of specific genes in epicardial cell biology.

Introduzione

Un patrimonio di dati sperimentali hanno mostrato che l'epicardio influenza passaggi critici nello sviluppo cardiaco. Durante lo sviluppo, la transversum setto dà luogo ad un gruppo di cellule mesoteliali noto come proepicardium ^1-4. Le cellule del proepicardium poi migrano e la busta miocardio formare il epicardio. In seguito, un sottogruppo di cellule epicardici subiscono EMT dando luogo ad una popolazione di cellule migratoria epicardio-derivato (EPDCs) che poi invadono il miocardio. Genetica così come retrovirale lignaggio tracciando esperimenti hanno dimostrato che EPDCs differenziarsi in vari lignaggi comprese le cellule muscolari lisce, i fibroblasti, cellule endoteliali e cardiomiociti (se presenti). Pertanto EPDCs contribuiscono significativamente allo sviluppo del sistema vascolare coronarico e architettura miocardica ^1,2,4-9. Inoltre, l'epicardio è essenziale per lo sviluppo dello strato compatto ventricolare ^10-12. per postaxample Gittenberger-de Groot et al. hanno dimostrato che inibendo la conseguenza del proepicardium porta ad una serie di difetti come un miocardio sottile, loop carente del cuore e anormale formazione setto interventricolare e, di conseguenza, embrionali letalità ^13. fattori paracrini secreti dal dell'epicardio embrionale modulano la proliferazione dei cardiomiociti e differenziazione. Coerentemente con questo, specifici per epicardium cancellazione dei percorsi di segnalazione come l'acido retinoico (RA), i fattori di crescita dei fibroblasti (FGF) e Wnt / β-catenina ha provocato la crescita del miocardio difettoso e letalità embrionale ^14-16.

Anche se il epicardio è stato creduto di essere quiescente nei cuori adulti, recenti studi hanno dimostrato che il programma di sviluppo si riattiva nel epicardio seguente lesione cardiaca ^17,18. Dopo l'attivazione, le cellule subiscono una rapida proliferazione e EMT che si traducono in formazione EPDC. Queste cellule presentano la capacity di differenziarsi in fibroblasti e cellule muscolari lisce, ma non cardiomiociti e cellule endoteliali ^18. Inoltre, i EPDCs secernono fattori pro-angiogenici che gli aiuti nella vascolarizzazione della zona danneggiata e quindi facilitare il miglioramento della funzione cardiaca, riducendo la dimensione dell'infarto. A causa di questi risultati, l'epicardio ha guadagnato interesse per lo studio dello sviluppo cardiovascolari, malattie e rigenerazione.

tecnologia transgenica ha rivoluzionato la ricerca medica nel 21 ° secolo. Con l'aiuto di tecnologie transgeniche, modelli di malati di topo che mimano la condizione umana metabolicamente e fisiopatologico sono stati sviluppati con successo. Tuttavia, lo studio del comportamento delle cellule epicardico in questi mutanti è stata una sfida dovuta principalmente ai primi di letalità embrionale. Considerando il ruolo significativo che la epicardio gioca nello sviluppo cardiaco e la rigenerazione, abbiamo istituito un sistema di coltura in vitro per epicardia del mouseL cellule. Questo metodo permette la coltura a lungo termine delle cellule epicardici e facilita lo studio dettagliato delle due proprietà importanti dell'epicardio: la sua capacità di migrare e differenziarsi. I ventricoli escisse dal mouse potrebbero essere coltivati ​​in gel di collagene che possono essere utilizzati per condurre saggi di migrazione. Essendo coltivate in una matrice 3D che replica la matrice extracellulare ricca di collagene dello strato subepicardico meglio riassume il vivo fisiologia cellulare in. In alternativa possono essere coltivate su vetrini da camera per stabilire un monostrato epicardico che può quindi essere utilizzato per una varietà di applicazioni a valle. Questo monostrato può essere utilizzato per colorare per proteine ​​di giunzione stretti che forniranno approfondimenti sulla capacità del epicardio sottoporsi EMT che è cruciale per la migrazione. Inoltre, esperimenti differenziazione possono essere effettuati anche su queste cellule. Inoltre, profilo di espressione genica può essere analizzata per estrarre l'RNA dalle cellule el'esecuzione di reazione a catena della polimerasi quantitativa (qPCR). Infine, i monostrati potrebbero anche essere trattati con agenti seguita da un'analisi molecolare per verificare le potenziali terapie. Mettere insieme, questo sistema di coltura epicardico ci offre la possibilità di visualizzare e raccogliere dati molecolare che favorisce la nostra comprensione dello sviluppo epicardico.

Un'altra caratteristica desiderabile di questo metodo è che è semplice e non richiede alcuna configurazione elaborata. In breve, gli embrioni vengono raccolte al E11.5 E12.5 o in seguito alla quale il cuore è asportato. I ventricoli sono poi coltivate su entrambi i gel di collagene o diapositive da camera. Successivamente, queste cellule possono essere usate per condurre esperimenti a valle.

Protocollo

Tutti gli esperimenti sono stati approvati dal Comitato Istituzionale cura degli animali e Usa Duke-NUS Graduate Medical School.

1. Recupero embrionale Ventricoli

1. Sacrifica un topo in stato di gravidanza a tempo allo stadio embrionale desiderato (E11.5 o E12.5) utilizzando una camera di eutanasia alla fornitura del gas di biossido di carbonio o un altro metodo di eutanasia approvato.
2. Posizionare il mouse sul dorso su un tavolo anatomico. Disinfettare l'addome della femmina con il 70% di etanolo. Sollevare la pelle sopra la pancia e fare una piccola incisione (1-2 cm) con una lama, quindi tenere la pelle con entrambe le mani e tirare via per esporre la parete addominale.
3. Ora tagliare la parete addominale per esporre il corno uterino. Utilizzare pinza sterile per sollevare il corno uterino e con attenzione tagliare i tessuti grassi e dei vasi sanguigni collegati al corno uterino. Tagliare al collo dell'utero per recuperare l'utero.
4. Posizionare il corno uterino in una capsula di Petri contenente sterile freddo 1x fosfato Buff ered Saline (PBS) e risciacquare delicatamente. Porre la capsula di Petri sul ghiaccio.
5. Usare le forbici per tagliare la linea mediana del corno uterino (di fronte al luogo in cui si trova la placenta) per esporre gli embrioni che sono ancora dentro il sacco vitellino e attaccati alla parete uterina attraverso la placenta.
6. Utilizzando pinze sterili, tagliare aperto il sacco vitellino embrionali per liberare l'embrione.
7. Posizionare l'embrione in un nuovo piatto di Petri contenente sterile freddo 1x PBS. Decapitare l'embrione e posizionarlo sul dorso. Tagliare aperto la parete toracica per esporre il cuore.
8. Utilizzare pinze sterili per sollevare il cuore e tagliare via i vasi intorno ad esso per liberare il cuore dalla parete toracica. Prestare particolare attenzione a non danneggiare l'epicardio del cuore con gli strumenti chirurgici.
9. Tagliare il tratto di efflusso ed entrambi atri. Trasferire il ventricolo di un altro piatto con 1x PBS freddo. Porre la capsula sul ghiaccio.
10. Ripetere i passaggi 1,6-1,9 fino a che tutti i ventricoli vengono recuperati.

Le "> 2. epicardico espianto

Nota: Culture questi espianti epicardici sia su vetrini da camera di vetro o su gel di collagene per applicazioni a valle.

1. Vetro Camera Slides
   1. Per preparare il terreno di coltura, aggiungere il 10% di siero fetale bovino (FBS), 1% di penicillina / streptomicina e 2 ng / ml il fattore di crescita dei fibroblasti ricombinante 2 (FGF2) per mezzo di Dulbecco modificato Eagle (DMEM). Eseguire tutti i passaggi della cappa a flusso laminare.
   2. Aggiungere 500 microlitri terreni di coltura a ciascun pozzetto di una camera 8 pozzetti.
   3. Mettete ogni ventricolo asportato al centro di un pozzo. Orientare il ventricolo per mantenere il lato sezionato sulla superficie inferiore del pozzetto.
   4. Delicatamente la piastra a 37 ° C, 5% CO ₂ incubatore di coltura cellulare.
   5. Mantenere la cultura con il minimo disturbo per permettere gli espianti di aderire. La formazione del monostrato epicardico può essere osservata dopo 48-72 ore.
   6. Per la differenziazione di epicardcellule IAL in cellule muscolari lisce, la cultura le cellule monostrato epicardici in mezzi di differenziazione per altri 6 giorni. Per preparare i mezzi di differenziazione, aggiungere il 10% FBS, 1% di penicillina / streptomicina e 50 ng / ml ricombinante fattore di crescita trasformante beta 1 (TGF-β1) per DMEM.
   7. Cambiare il terreno di coltura a giorni alterni.
2. gel di collagene
   1. Preparare il gel di collagene in una piastra a 96 pozzetti utilizzando un kit commerciale 3D collagene cultura secondo il protocollo del produttore.
   2. Per preparare il volume desiderato di gel di collagene, mescolare la quantità appropriata di soluzione di collagene con 5x di DMEM e pipetta su e giù. La soluzione dovrebbe diventare giallo.
   3. Aggiungere un corrispondente volume di soluzione di neutralizzazione e miscelare bene immediatamente pipettando su e giù. La soluzione diventerà rosa.
   4. Pipettare 100 ml di questa miscela in ciascun pozzetto di una piastra a 96 pozzetti. Posizionare la piastra a 37 ° C, 5% CO ₂ incubatore per 30-60 min ad albasso il gel di polimerizzare.
   5. Aggiungere 200 ml di terreni di coltura descritti sopra per ciascun pozzetto.
   6. Mettete ogni ventricolo asportato al centro di un pozzo. Orient ventricolo per mantenere il lato sezionato giù sul gel di collagene (apice del ventricolo deve affrontare sperimentatore). Delicatamente la piastra posteriore in incubatrice coltura cellulare.
   7. Dopo 3 giorni, rimuovere i ventricoli. Mettere la piastra posteriore nell'incubatore coltura cellulare per altri 2 giorni.
   8. Cambiare il terreno di coltura a giorni alterni.

3. Fissazione e Visualizzazione

Nota: le cellule epicardici possono essere visualizzati sia su vetrini da camera di vetro o gel di collagene.

1. Aspirare i terreni di coltura e aggiungere un uguale volume di sterili 1x PBS per lavare le cellule.
2. Aggiungere appena sufficiente 4% paraformaldeide (PFA) per coprire le cellule. Fissare le cellule per 10 minuti a 4 ° C.
3. Rimuovere PFA e lavare espianti con 1x PBST (PBS 1x con0,1% triton X-100) per permeabilize cellule.
4. Immunostain con l'anticorpo desiderato (ad esempio Alexa Fluor 488-falloidina; ZO-1, α-tubulina e α-actina del muscolo liscio) ^7.

Risultati

Usando questo protocollo la cultura, le cellule epicardial primarie possono essere isolate con elevata purezza per le applicazioni a valle. Le cellule coltivate sono in grado di subire EMT, migrare e differenziarsi come cellule epicardial fare in vivo.

Per determinare la purezza della nostra cultura di cellule epicardico primarie, abbiamo analizzato gli espianti epicardici generati da Sema3d ^{GFPCre /...}

Discussione

È fondamentale per sviluppare tecniche che facilitano lo studio della epicardio per soddisfare la crescente importanza della epicardio in sviluppo cardiaco e rigenerazione. Il sistema di coltura epicardico pone notevoli vantaggi per la ricerca epicardico.

Un modo alternativo per isolare le cellule epicardial è usare fluorescenza attivato cell sorting (FACS). Questo metodo si basa sull'utilizzo di marcatori epicardici (o-specifica epicardio cellule transgenici espressione di una protein...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM)	Life tech invitrogen	11995065
Penicillin/streptomycin solution	Life tech invitrogen	15140122
Fetal bovine serum (FBS)	Life tech invitrogen	10500064
Paraformaldehyde	Sigma	P6148-5KG
Recombinant fibroblast growth factor 2 (FGF2)	PeproTech	450-33
Recombinant transforming growth factor beta 1 (TGF-β1)	PeproTech	100-21
ZO-1 antibody	Life tech invitrogen	40-2200
α-Tubulin antibody	Sigma	T 6074
α-smooth muscle actin (SMA) antibody	Sigma	A 2547
Phalloidin antibody	Life tech invitrogen	A12379
3D Collagen Culture kit	Millipore	ECM 675
8-well chamber slide	Fisher Scientific	NNU 154534-PK
Trizol reagent	Life Technologies	15596-018
ViiA 7 Real-Time PCR System	Life Technologies	4453536
Superscript First Strand Synthesis kit	Life Technologies	11904-018