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要約

The epicardium is an essential source of multipotent cardiovascular progenitor cells and paracrine factors that are required for cardiovascular development and regeneration. We describe here a method to culture mouse embryonic epicardial cells.

要約

During embryogenesis, the epicardial contribution to coronary vasculature development has been very well established. Cells derived from the epicardium differentiate into smooth muscle cells, fibroblasts and endothelial cells that contribute to the formation of coronary vessels. Here we have established an in vitro culture method for embryonic epicardial cells. Using genetic labelling, we have demonstrated that the majority of the migrating cells in our explant culture are of epicardial origin. Epicardial explant cells also retain the expression of epicardial markers (Wt1 and Tbx18). Furthermore, we provide evidence that epicardial explant cells undergo epithelial to mesenchymal transition (EMT), migrate and differentiate into smooth muscle cells after Transforming growth factor beta 1 (TGF-β1) treatment in a manner indistinguishable from that of epicardial cells in vivo. In conclusion, we provide a novel method for the culture of embryonic epicardial cells, which will help to explore the role of specific genes in epicardial cell biology.

概要

実験データの富は、心外膜は、心臓の開発における重要なステップに影響を与えることが示されています。開発中に、横中隔はproepicardium 1-4として知られている中皮細胞の塊を生じさせます。 proepicardiumからの細胞は、次に移動して、心外膜を形成する心筋を包みます。これに続いて、心外膜細胞のサブセットは、その後、心筋に侵入心外膜由来細胞（EPDCs）の遊走集団を生じるEMTを起こします。実験トレース遺伝子、ならびにレトロウイルス系統はEPDCsは、平滑筋細胞、線維芽細胞、内皮細胞および心筋細胞（もしあれば）を含む種々の系統に分化することを実証しました。したがってEPDCsは、冠血管系および心筋アーキテクチャ1,2,4-9の発展に大きく貢献しています。さらに、心外膜は、心室緻密層10-12の発展のために不可欠です。 EのXAMPLE Gittenbergerドはグルートら proepicardiumの伸長を阻害することが、このような薄い心筋、心臓や異常心室中隔形成の欠損ループとして、その結果、胚致死13等の欠陥の配列につながることを実証しました。胚性心外膜から分泌パラクリン要因は、心筋細胞の増殖および分化を調節します。これと一致して、レチノイン酸（RA）、線維芽細胞増殖因子（FGF）およびWnt /βカテニンシグナル伝達経路などの心外膜特異的欠失は、欠陥のある心筋の増殖および胚致死14-16もたらしました。

心外膜は、大人の心の中に静止状態であると考えられていたが、最近の研究では、発達プログラムが心外傷17,18以下の心外膜に再活性化されることが示されています。活性化されると、細胞はEPDCの形成をもたらす急速な増殖およびEMTを起こします。これらの細胞は、capacitを示しますyは、線維芽細胞や平滑筋細胞ではなく、心筋細胞または内皮細胞18に分化します。また、EPDCsは、損傷部位の血管新生を助ける、したがって梗塞サイズを減少させることにより改善された心機能を促進する血管新生促進因子を分泌します。これらの知見に、心外膜は、心血管の開発、病気と再生の研究に関心を集めています。

トランスジェニック技術は、21世紀の医学研究に革命をもたらしました。トランスジェニック技術の助けを借りて、代謝および病態生理学的に人間の条件を模倣する病気のマウスモデルが正常に開発されています。しかし、これらの変異体における心外膜細胞の挙動を研究すると、初期胚致死性が主な原因課題でした。心外膜は、心臓の開発と再生に果たしていることが重要な役割を考えると、我々は、マウスの噴門上部のためのin vitro培養系を確立していますL細胞。この方法は、心外膜細胞の長期培養を可能にし、心外膜の二つの重要な特性の詳細な検討が容易：移行と分化する能力を。マウスから切除した心室は、遊走アッセイを実施するために使用することができるコラーゲンゲル上で培養することができます。より良い心外膜下の層のコラーゲンが豊富な細胞外マトリックスを複製インビボの細胞生理学を再現する3Dマトリックスで培養されています。あるいは、それらは、次いで、下流の適用の種々のために使用することができる心外膜単層を確立するために、チャンバースライド上で培養することができます。この単分子膜は、移行のために重要であるEMTを受ける心外膜の能力に関する洞察を提供するタイトジャンクショ​​ンタンパク質を染色するために使用することができます。また、分化実験は、これらの細胞上で行うことができます。さらに、遺伝子発現プロファイルは、細胞からRNAを抽出することによって分析することができると定量的ポリメラーゼ連鎖反応（qPCR）を行います。最後に、単層はまた、潜在的な治療薬をテストするために、分子分析を行っ剤を用いて治療することができます。まとめると、この心外膜培養系は、視覚化し、心外膜の開発についての我々の理解をfurthers分子データを収集する機会を提供してくれます。

この方法の別の望ましい特徴は、それが簡単であり、いかなる精巧なセットアップを必要としないことです。簡単に言えば、胚は、心臓を摘出されたE11.5またはE12.5以下で収穫されています。心室はその後、コラーゲンゲルまたはチャンバースライドのいずれかで培養されます。その後、これらの細胞は、下流の実験を行うために使用することができます。

プロトコル

すべての実験は、デューク-NUS大学院医学部制度動物実験委員会によって承認されました。

1.胚性心室を取得

  1. 二酸化炭素ガスの供給または他の承認された安楽死の方法で安楽死チャンバーを用いて所望の胚段階（E11.5またはE12.5）で時限妊娠マウスを生け贄に捧げます。
  2. 解剖台に背の上にマウスを置きます。 70％エタノールで女性の腹部を消毒します。両手で皮膚を保持し、腹壁を露出するように引き離した後、腹の上に皮膚を持ち上げて、刃で小切開（1-2センチ）を作ります。
  3. 今、子宮角を露出させるために腹壁をカット。子宮角を持ち上げ、慎重に脂肪組織と子宮角に取り付けられた血管を切り取るために滅菌ピンセットを使用してください。子宮を取得するために、子宮頸部で切断。
  4. 無菌の冷たい1×リン酸バフを含むペトリ皿に子宮角を配置 ered生理食塩水（PBS）と優しく洗い流します。氷上のペトリ皿を置きます。
  5. 卵黄嚢の内部に残っていると、胎盤を通じて子宮壁に取り付けられた胚を露出させるために（胎盤が配置されているサイトとは反対側）の子宮角の正中線を切断するはさみを使用してください。
  6. 滅菌ピンセットを用いて、胚を解放するために、胚の卵黄嚢を切り​​開い。
  7. 滅菌冷たい1×PBSを含む新しいペトリ皿に胚を置きます。胚を刎ねると、その背中の上に置きます。心臓を露出するために胸壁を開いてカットします。
  8. 心を持ち上げ、胸の壁から心を解放するためにその周りに船を離れてカットする滅菌ピンセットを使用してください。手術ツールで心臓の心外膜に損傷を与えないように注意を払ってください。
  9. 流出路との両方の心房を切り落とします。冷たい1×PBSで別の皿に心室を転送します。氷の上の皿を置きます。
  10. 繰り返して、すべての心室が検索されるまで、1.6から1.9を繰り返します。
ル "> 2。心外膜外植片培養

注意：文化ガラスチャンバースライド上または下流のアプリケーションのためのコラーゲンゲル上のいずれかのこれらの心外膜の外植片。

  1. ガラスチャンバースライド
    1. 、培地を調製したダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）に10％ウシ胎児血清（FBS）、1％ペニシリン/ストレプトマイシンおよび2 ngの/ mlの組換え線維芽細胞増殖因子2（FGF2）を追加します。層流フード内のすべての手順を実行します。
    2. 8ウェルチャンバーの各ウェルに500μlの培地を追加します。
    3. ウェルの中央にそれぞれ切除した心室を置きます。東洋ウェルの底面を下に切開面を維持する脳室。
    4. 穏やかに37℃、5％CO 2細胞培養インキュベーター中でプレートを置きます。
    5. 外植片が付着することを可能にするために妨害を最小限にして文化を維持します。心外膜の単分子層の形成は、48〜72時間後に観察することができます。
    6. epicardの分化のために平滑筋細胞、培養をさらに6日間分化培地における心外膜単層細胞にIAL細胞。分化培地を調製するために、DMEMに10％FBS、1％ペニシリン/ストレプトマイシンおよび50 ngの/ mlの組換え型トランスフォーミング増殖因子β1（TGF-β1）を加えます。
    7. 日おきに培地を変更します。
  2. コラーゲンゲル
    1. 製造業者のプロトコルに従って、商業用3Dコラーゲン培養キットを用いて96ウェルプレート中のコラーゲンゲルを準備します。
    2. コラーゲンゲルの所望のボリュームを準備するには、上下DMEMとピペットの5倍とコラーゲン溶液の適量を混ぜます。溶液は黄色に変わります。
    3. 中和液の対応するボリュームを追加し、ピペッティングにより十分にすぐに混ぜます。解決策は、ピンク色に変わります。
    4. ピペット96ウェルプレートの各ウェルにこの混合物の100μlを。アルに30〜60分間、37℃、5％CO 2インキュベーターでプレートを置き低ゲルが重合します。
    5. 各ウェルに、上記の培養培地を200μlを追加します。
    6. ウェルの中央にそれぞれ切除した心室を置きます。オリエントコラーゲンゲル上で解剖側を下に保つために心室（心室の頂点が実験者に直面している必要があります）。そっと背中細胞培養インキュベーターでプレートを置きます。
    7. 3日後、心室を削除します。別の2日間、細胞培養インキュベーターにバックプレートを置きます。
    8. 日おきに培地を変更します。

3.固定と可視化

注：心外膜細胞を、ガラスチャンバースライド、またはコラーゲンゲルのいずれかで可視化することができます。

  1. 培地アウト吸引し、細胞を洗浄し、滅菌1×等量のPBSを追加します。
  2. セルをカバーするだけの十分な4％パラホルムアルデヒド（PFA）を加えます。 4℃で10分間細胞を固定。
  3. PFAを削除し、で1×PBST（1×PBSで外植片を洗います細胞を透過するため、0.1％トリトンX-100）。
  4. 所望の抗体（ 例えば 、アレクサフルオロ488ファロイジン; ZO-1、αチューブリンおよびα平滑筋アクチン）とイムノ7。

結果

この培養プロトコルを使用して、主要な心外膜細胞は、下流アプリケーションのための高純度で単離することができます。培養した細胞は、EMTを起こし移行し、心外膜細胞が生体内で同じよう分化することができます。

R26 トム/ +胚;当社の主要な心外膜細胞培養物の純度を決定するため...

ディスカッション

心臓の開発と再生に心外膜の重要性が増しに応えるために心外膜の研究を容易にする技術を開発することが極めて重要です。心外膜培養系は、心外膜の研究のための重要な利点をもたらします。

心外膜細胞を単離する別の方法は、蛍光活性化細胞選別（FACS）を使用することです。この方法は、他の系統から心外膜細胞を分離するための心外膜マーカー（または蛍光タン?...

開示事項

The authors declare that they have no competing financial interests.

謝辞

この作品は、DUKE-NUS大学院医学部シンガポール、Manvendra K.シンへゴー基盤とシンガポールNRFの交わり（NRF-NRFF2016-01）からの資金によってサポートされていました。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM)Life tech invitrogen 11995065
Penicillin/streptomycin solutionLife tech invitrogen 15140122
Fetal bovine serum (FBS) Life tech invitrogen 10500064
ParaformaldehydeSigmaP6148-5KG
Recombinant fibroblast growth factor 2 (FGF2)PeproTech450-33
Recombinant transforming growth factor beta 1 (TGF-β1)PeproTech100-21
ZO-1 antibodyLife tech invitrogen 40-2200
α-Tubulin antibodySigmaT 6074
α-smooth muscle actin (SMA) antibodySigmaA 2547
Phalloidin antibodyLife tech invitrogen A12379
3D Collagen Culture kit Millipore ECM 675
8-well chamber slideFisher ScientificNNU 154534-PK
Trizol reagentLife Technologies15596-018
ViiA 7 Real-Time PCR SystemLife Technologies4453536
Superscript First Strand Synthesis kitLife Technologies11904-018

参考文献

  1. Mikawa, T., Fischman, D. A. Retroviral analysis of cardiac morphogenesis: discontinuous formation of coronary vessels. Proc Natl Acad Sci U S A. 89, 9504-9508 (1992).
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