Cultura in vitro de células epicárdicas De Coração embrionárias de camundongos

Resumo

The epicardium is an essential source of multipotent cardiovascular progenitor cells and paracrine factors that are required for cardiovascular development and regeneration. We describe here a method to culture mouse embryonic epicardial cells.

Resumo

During embryogenesis, the epicardial contribution to coronary vasculature development has been very well established. Cells derived from the epicardium differentiate into smooth muscle cells, fibroblasts and endothelial cells that contribute to the formation of coronary vessels. Here we have established an in vitro culture method for embryonic epicardial cells. Using genetic labelling, we have demonstrated that the majority of the migrating cells in our explant culture are of epicardial origin. Epicardial explant cells also retain the expression of epicardial markers (Wt1 and Tbx18). Furthermore, we provide evidence that epicardial explant cells undergo epithelial to mesenchymal transition (EMT), migrate and differentiate into smooth muscle cells after Transforming growth factor beta 1 (TGF-β1) treatment in a manner indistinguishable from that of epicardial cells in vivo. In conclusion, we provide a novel method for the culture of embryonic epicardial cells, which will help to explore the role of specific genes in epicardial cell biology.

Introdução

A riqueza de dados experimentais têm mostrado que o epicárdio influencia passos críticos no desenvolvimento cardíaco. Durante o desenvolvimento, o septo transverso dá origem a um grupo de células mesoteliais conhecidos como o proepicardium ^1-4. As células do proepicardium seguida, migrar e envelope do miocárdio formando o epicárdio. Depois disso, um subconjunto de células do epicárdio sofrer EMT dando origem a uma população de células derivadas migratória-epicárdio (EPDCs) que invadem posteriormente o miocárdio. Genética retroviral, bem como a linhagem rastreio experimentos demonstraram que EPDCs diferenciar em linhagens diferentes, incluindo células musculares lisas, fibroblastos, células endoteliais e cardiomiócitos (se qualquer). Portanto EPDCs contribuir significativamente para o desenvolvimento da vasculatura coronária e miocárdica arquitectura ^1,2,4-9. Além disso, o epicárdio é essencial para o desenvolvimento da camada compacta do ventrículo ^10-12. para example Gittenberger-Groot et ai. demonstraram que a inibição do crescimento do proepicardium leva a uma variedade de defeitos, tais como uma fina miocárdio, looping deficiente do coração e septo interventricular formação anormal e, como resultado, a letalidade embrionária ^13. factores parácrinos secretadas a partir do epicárdio embrionário modular a proliferação e diferenciação de cardiomiócitos. Consistente com isto, supressão específica do epicárdio de vias de sinalização, tais como o ácido retinóico (RA), factores de crescimento de fibroblastos (FGF) e Wnt / β-catenina resultou no crescimento do miocárdio com defeito e letalidade embrionária ^14-16.

Embora o epicárdio se acreditava ser de repouso em corações adultos, estudos recentes têm mostrado que o programa de desenvolvimento é reativado no epicárdio após lesão cardíaca ^17,18. Após a activação, as células sofrem uma rápida proliferação e EMT que resultam na formação EPDC. Estas células exibem a capacitY para se diferenciarem em fibroblastos e células do músculo liso, mas não cardiomiócitos e células endoteliais ^18. Além disso, os pró-angiogénico EPDCs segregam factores que ajuda na vascularização da área ferida e, assim, facilitar a melhoria da função cardíaca ao reduzir o tamanho do enfarte. Devido a estes resultados, o epicárdio ganhou interesse no estudo do desenvolvimento cardiovascular, doença e regeneração.

tecnologia transgênica tem revolucionado a investigação médica no século 21. Com o auxílio de tecnologias transgénicos, modelos de ratos doentes que mimetizam a condição humana metabolicamente e fisiopatologicamente ter sido desenvolvida com sucesso. No entanto, o estudo do comportamento das células do epicárdio nestes mutantes tem sido um desafio devido principalmente a letalidade embrionária precoce. Considerando o papel significativo que o epicárdio desempenha no desenvolvimento cardíaco e regeneração, nós estabelecemos um sistema de cultura in vitro para epicardia ratocélulas L. Este método permite que a cultura de longo prazo das células do epicárdio e facilita o estudo detalhado das duas propriedades importantes do epicárdio: a sua capacidade para migrar e diferenciar-se. Os ventrículos cortados do rato poderia ser cultivados em géis de colagénio que podem ser utilizados para conduzir ensaios de migração. Sendo cultivadas em uma matriz 3D que replica a matriz extracelular rica em colágeno da camada subepicárdica recapitula a na fisiologia da célula vivo melhor. Alternativamente, eles podem ser cultivadas em lâminas de câmara, a fim de estabelecer uma monocamada epicárdico que pode então ser utilizado para uma variedade de aplicações a jusante. Esta monocamada pode ser utilizado para corar para proteínas de junções apertadas, que irá proporcionar conhecimentos sobre a capacidade do epicárdio se submeter EMT que é crucial para a migração. Além disso, as experiências de diferenciação pode também ser levada a cabo sobre estas células. Além disso, o perfil de expressão do gene pode ser analisado através da extracção de ARN a partir das células erealização da reacção em cadeia da polimerase quantitativa (qPCR). Por último, as monocamadas também poderiam ser tratados com agentes seguido por uma análise molecular para testar potenciais agentes terapêuticos. Juntos, este sistema de cultura epicárdica nos proporciona a oportunidade de visualizar e reunir dados molecular que possibilita a compreensão sobre o desenvolvimento do epicárdio.

Outra característica desejável deste método é que é simples e não é necessária configuração elaborada. Em resumo, os embriões são colhidos em E11.5 E12.5 ou após o que o coração é excisado. Os ventrículos são então cultivadas em qualquer um gel de colagénio ou lâminas de câmara. Subsequentemente, estas células podem ser usadas para conduzir experiências jusante.

Protocolo

Todos os experimentos foram aprovados pelo Comitê Animal Care Institucional e Use a Duke-NUS Graduate Medical School.

1. Recuperar o Embryonic ventrículos

1. Sacrificar um rato grávida cronometrado na fase embrionária desejado (E11.5 ou E12.5), utilizando uma câmara de eutanásia com fornecimento de gás dióxido de carbono ou outro método de eutanásia aprovado.
2. Posicione o mouse sobre as suas costas sobre uma mesa de dissecação. Desinfectar o abdômen da fêmea, com 70% de etanol. Levante a pele sobre a barriga e fazer uma pequena incisão (1-2 cm) com uma lâmina, em seguida, mantenha a pele com ambas as mãos e puxe para expor a parede abdominal.
3. Agora cortar a parede abdominal para expor o corno uterino. Use uma pinça estéreis para levantar o corno uterino e cortar cuidadosamente os tecidos de gordura e vasos sanguíneos ligados ao corno uterino. Corte no colo do útero para recuperar o útero.
4. Coloque o corno uterino em uma placa de petri contendo estéril frio 1x fosfato Buff Ered Saline (PBS) e lave delicadamente. Colocar a placa de petri em gelo.
5. Utilize uma tesoura para cortar através da linha mediana da trompa uterina (oposto ao local onde a placenta está localizado) para expor os embriões que estão ainda dentro do saco vitelino e ligados a parede uterina através da placenta.
6. Utilizando uma pinça estéril, cortado do saco vitelino embrionário para liberar o embrião.
7. Coloque o embrião de uma nova placa de Petri contendo estéril frio 1x PBS. Decapitar o embrião e colocá-lo em suas costas. Cortado da parede torácica para expor o coração.
8. Use uma pinça estéreis para levantar o coração e cortar os vasos em torno dele para libertar o coração da parede torácica. Preste atenção especial para não danificar o epicárdio do coração com as ferramentas cirúrgicas.
9. Aparar a via de saída e ambos os átrios. Transferir o ventrículo a outro prato com 1x PBS frio. Coloque o prato no gelo.
10. Repita os passos de 1,6-1,9 até que todos os ventrículos são recuperadas.

le "> 2. Cultura Explant Epicárdica

Nota: Cultura esses explantes do epicárdio, quer em lâminas de câmara de vidro ou em gel de colágeno para aplicações a jusante.

1. Slides câmara de vidro
   1. Para preparar o meio de cultura, adicionar 10% de soro fetal de bovino (FBS), 1% de penicilina / estreptomicina e 2 ng / ml de factor de crescimento de fibroblastos recombinante 2 (FGF2) para meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM). Executar todas as etapas da capela de fluxo laminar.
   2. Adicionar 500 ul de meio de cultura a cada poço de uma câmara de 8 poços.
   3. Colocar cada ventrículo excisado no centro de um poço. Orientar o ventrículo para manter o lado dissecados para baixo sobre a superfície do fundo do poço.
   4. Suavemente colocar a placa num banho a 37 ° C, 5% de CO ₂ incubadora de cultura de células.
   5. Manter a cultura com uma perturbação mínima para permitir que os explantes a aderir. A formação da monocamada epicárdio pode ser observada depois de 48-72 horas.
   6. Para a diferenciação de epicardcélulas ial em células musculares lisas, a cultura das células do epicárdio monocamada em meio de diferenciação por mais 6 dias. Para preparar os meios de diferenciação, adicionam-se 10% de FBS, 1% de penicilina / estreptomicina e 50 ng / ml de factor de crescimento de transformação recombinante beta 1 (TGF-β1) para DMEM.
   7. Alterar o meio de cultura em dias alternados.
2. colágeno Gel
   1. Prepara-se o gel de colagénio numa placa de 96 poços utilizando um kit de cultura 3D colagénio comercial de acordo com o protocolo do fabricante.
   2. Para preparar o volume desejado de gel de colagénio, misturar a quantidade apropriada de solução de colagénio com 5x de DMEM e pipeta cima e para baixo. A solução deve ficar amarelo.
   3. Adicionar um volume correspondente de solução de neutralização e misture bem imediatamente pipetando cima e para baixo. A solução vai virar rosa.
   4. Pipetar 100 ul desta mistura em cada poço de uma placa de 96 poços. Colocar a placa num banho a 37 ° C, 5% de _CO2 durante 30-60 min para albaixo o gel para polimerizar.
   5. Adicionar 200 ul de meio de cultura descritas acima para cada poço.
   6. Colocar cada ventrículo excisado no centro de um poço. Orient o ventrículo para manter o lado dissecados para baixo sobre o gel de colágeno (ápice do ventrículo deve enfrentar o experimentador). Suavemente colocar a placa de volta na incubadora de cultura de células.
   7. Após 3 dias, remover os ventrículos. Colocar a placa de volta na incubadora de cultura de células durante mais 2 dias.
   8. Alterar o meio de cultura em dias alternados.

3. Fixação e Visualização

Nota: as células epicárdicas pode ser visualizado em ambos lâminas de câmara de vidro ou de gel de colagénio.

1. Aspirar o meio de cultura e adicionar um volume igual de PBS estéril 1x para lavar as células.
2. Adicionar apenas o suficiente paraformaldeído a 4% (PFA) para cobrir as células. Fixar as células durante 10 min a 4 ° C.
3. Remover e lavar PFA explantes com 1x PBST (PBS 1x com0,1% de Triton X-100) para permeabilizar as células.
4. Imunocoloração com anticorpo desejado (por exemplo, Alexa Fluor 488-faloidina; ZO-1, α-tubulina e actina de músculo liso-α) ^7.

Resultados

Usando este protocolo cultura, as células do epicárdio primárias podem ser isolados com elevado grau de pureza para aplicações a jusante. As células cultivadas são capazes de sofrer EMT, migrar e diferenciar células do epicárdio, assim como faz in vivo.

Para determinar a pureza da nossa cultura de células do epicárdio primário, analisamos os explantes do epicárdio gerados a partir Sema3d

Discussão

É crucial para desenvolver técnicas que facilitam o estudo do epicárdio para atender à crescente importância do epicárdio no desenvolvimento cardíaco e regeneração. O sistema de cultura do epicárdio representa vantagens significativas para a investigação do epicárdio.

Um modo alternativo para isolar as células do epicárdio é a utilização de triagem de células activadas por fluorescência (FACS). Este método baseia-se na utilização de marcadores do epicárdio (ou express...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM)	Life tech invitrogen	11995065
Penicillin/streptomycin solution	Life tech invitrogen	15140122
Fetal bovine serum (FBS)	Life tech invitrogen	10500064
Paraformaldehyde	Sigma	P6148-5KG
Recombinant fibroblast growth factor 2 (FGF2)	PeproTech	450-33
Recombinant transforming growth factor beta 1 (TGF-β1)	PeproTech	100-21
ZO-1 antibody	Life tech invitrogen	40-2200
α-Tubulin antibody	Sigma	T 6074
α-smooth muscle actin (SMA) antibody	Sigma	A 2547
Phalloidin antibody	Life tech invitrogen	A12379
3D Collagen Culture kit	Millipore	ECM 675
8-well chamber slide	Fisher Scientific	NNU 154534-PK
Trizol reagent	Life Technologies	15596-018
ViiA 7 Real-Time PCR System	Life Technologies	4453536
Superscript First Strand Synthesis kit	Life Technologies	11904-018