במבחנה והתרבות של תאי Epicardial מתוך לב העכבר עוברי

Summary

The epicardium is an essential source of multipotent cardiovascular progenitor cells and paracrine factors that are required for cardiovascular development and regeneration. We describe here a method to culture mouse embryonic epicardial cells.

Abstract

During embryogenesis, the epicardial contribution to coronary vasculature development has been very well established. Cells derived from the epicardium differentiate into smooth muscle cells, fibroblasts and endothelial cells that contribute to the formation of coronary vessels. Here we have established an in vitro culture method for embryonic epicardial cells. Using genetic labelling, we have demonstrated that the majority of the migrating cells in our explant culture are of epicardial origin. Epicardial explant cells also retain the expression of epicardial markers (Wt1 and Tbx18). Furthermore, we provide evidence that epicardial explant cells undergo epithelial to mesenchymal transition (EMT), migrate and differentiate into smooth muscle cells after Transforming growth factor beta 1 (TGF-β1) treatment in a manner indistinguishable from that of epicardial cells in vivo. In conclusion, we provide a novel method for the culture of embryonic epicardial cells, which will help to explore the role of specific genes in epicardial cell biology.

Introduction

שפע של נתוני ניסוי הדגים כי epicardium משפיע שלבים קריטיים בפיתוח לב. במהלך הפיתוח, מחצה transversum מוליד גוש של תאים mesothelial המכונה proepicardium ^1-4. תאים מן proepicardium מכן להעביר ומעטפת שריר הלב להרכיב את epicardium. בעקבות זאת, תת קבוצה של תאים epicardial לעבור והוליד EMT לאוכלוסייה הנדידה של תאים שמקורם epicardium (EPDCs) כי לאחר מכן לפלוש שריר הלב. שושלת גנטית וכן retroviral התחקות ניסויים הוכיחה כי EPDCs להתמיין שושלות שונות, כולל תאי שריר חלק, פיברובלסטים, אנדותל תאי cardiomyocytes (אם בכלל). לכן EPDCs לתרום רבות להתפתחות של כלי הדם הכליליים ואדריכלות שריר הלב ^1,2,4-9. יתר על כן, epicardium חיוני לפיתוח השכבה הקומפקטית חדרית ^10-12. לקבלת דוארxample Gittenberger-דה גרוט et al., הוכיח כי עיכוב התולדה של proepicardium מוביל מערך של ליקויים כגון שריר לב רזה, looping הלקוי של לב היווצרות מחץ interventricular נורמלית וכתוצאה מכך, ¹³ הקטלניות עובריות. גורמי paracrine מופרשי epicardium העוברי לווסת התפשטות cardiomyocyte והבחנה. בקנה אחד עם זו, מחיקה ספציפי epicardium של מסלולי איתות כגון חומצה רטינואית (RA), גורמי גדילה פיברובלסטים (FGFs) ו Wnt / β-קטנין הביאה לצמיחת שריר לב פגומה קטלנית עוברי ^14-16.

למרות epicardium היה ככל הנראה רדום לבבות מבוגרים, מחקרים שנעשה לאחרונה הראו כי תכנית התפתחותית מחדש של epicardium הבא לב פציעת ^17,18. לאחר ההפעלה, התאים עוברים התפשטות מהירה EMT שתוצאתן היווצרות EPDC. תאים אלה מציגים את capacity להתמיין פיברובלסטים ותאי שריר חלק אבל לא cardiomyocytes או תאי האנדותל ^18. בנוסף, EPDCs מפריש גורמי proangiogenic שסיוע של כלי הדם של האזור הפגוע ובכך להקל על תפקוד לב משופר על ידי הקטנת הגודל האוטם. בשל ממצאים אלה, epicardium צברה עניין במחקר של פיתוח, מחלות לב וכלי דם והתחדשות.

טכנולוגיה מהונדסת יש מהפכה במחקר רפואי במאות ה -21. בעזרת טכנולוגיות מהונדסות, במודלים של עכברים חולים מחקו את המצב האנושי מבחינה מטבולית ו pathophysiologically פותחו בהצלחה. עם זאת, לומד את התנהגות התא epicardial מוטנטים אלה כבר אתגר בעיקר בשל הקטלניות עובריים מוקדם. בהתחשב תפקיד משמעותי כי epicardium משחק בפיתוח והתחדשות לב, הקמנו מערכת תרבות במבחנה לעכבר epicardiaתאי l. שיטה זו מאפשרת תרבות ארוכת הטווח של תאי epicardial ומקל על מחקר מפורט של שני המאפיינים החשובים של epicardium: יכולתו להעביר ולבדל. תעלות חדרי המוח נכרת מן העכבר יכול להיות מתורבת על ג'ל קולגן אשר ניתן להשתמש בהם כדי לנהל מבחני הגירה. בתרבית במטריצה ​​3D כי משכפל את תאי מטריקס עשיר קולגן של השכבה subepicardial טוב משכפלת את הפיזיולוגיה תא vivo. לחלופין, הם יכולים להיות מתורבתים בשקופיות קאמריות כדי להקים monolayer epicardial אז מה שיכול לשמש עבור מגוון רחב של יישומים במורד זרם. בשכבה זו יכולה לשמש כדי להכתים חלבונים צומת חזק אשר יספק תובנות על היכולת של epicardium לעבור EMT שהוא חיוני עבור הגירה. בנוסף, ניסויים בידול יכול גם להתבצע על תאים אלה. יתר על כן, פרופיל ביטוי גנים יכול להיות מנותח על ידי חילוץ RNA מן התאיםביצוע תגובת שרשרת פולימראז כמותיים (qPCR). לבסוף, monolayers יכול גם להיות מטופלות בעזרת חומרי ואחריו ניתוח מולקולרי לבדוק רפויים פוטנציאלי. להרכיב, מערכת תרבות epicardial זה מספקת לנו את ההזדמנות כדי להמחיש ולאסוף נתונים מולקולריים אשר מסייע להבנה על פיתוח epicardial.

עוד תכונה רצויה של שיטה זו היא שהיא פשוטה ולא הגדרה מורכבת נדרשת. בקיצור, את העוברים נקצרים בכל הבאה E11.5 או E12.5 בו הלב הוא נכרת. תעלות חדרי המוח אז בתרבית על ג'ל או קולגן או שקופיות קאמריות. כתוצאה מכך, התאים האלה יכולים לשמש כדי לבצע ניסויים במורד זרם.

Protocol

כל הניסויים אושרו על ידי ועדת טיפול בבעלי חיים מוסדיים הספר לרפואה בוגר Duke-NUS ושימוש.

1. אחזור העוברי החדרים

1. קורבן עכבר בהריון בעיתוי בשלב העוברי הרצוי (E11.5 או E12.5) באמצעות תא המתת חסד עם אספקת גז דו תחמוצת הפחמן או שיטה אחרת המתת חסד אושרה.
2. מניחים את העכבר על גבו על שולחן הניתוחים. לחטא את הבטן של הנקבה עם אתנול 70%. הרם את העור מעל הבטן ולעשות חתך קטן (1-2 ס"מ) עם להב, ולאחר מכן החזק את העור בשתי ידיים מתרחק כדי לחשוף את דופן הבטן.
3. עכשיו לחתוך את דופן הבטן לחשוף את קרן הרחם. שימוש במלקחיים סטרילי כדי להרים את קרן הרחם ובזהירות לחתוך את רקמות השומן וכלי דם מצורפות קרן הרחם. חותכים את צוואר הרחם כדי לאחזר את הרחם.
4. מניחים את קרן הרחם בצלחת פטרי שמכילה Buff פוספט 1x קר סטרילי ered מלוח (PBS) ולשטוף בעדינות. מניחים את צלחת פטרי על הקרח.
5. השתמש במספריים לחתוך את קו האמצע של קרן הרחם (מול לאתר שבו השליה ממוקמת) לחשוף את העוברים כי עדיין בתוך שק החלמון ואת המחובר לקיר הרחם דרך השליה.
6. בעזרת מלקחיים סטריליות, לבתק את שק החלמון העוברי לשחרר את העובר.
7. מניחים את העובר בצלחת פטרי חדשה המכילה PBS 1x קר סטרילי. לערוף את העובר ומניחים אותו על גבו. גזור לפתוח את בית החזה כדי לחשוף את הלב.
8. שימוש במלקחיים סטרילי כדי לרומם את הרוח וחתך את הכלי סביבו כדי לשחרר את הלב מקיר החזה. שימו לב מיוחדת שלא לפגוע epicardium של הלב עם כלים כירורגיים.
9. חתוך את דרכי היצוא ושניהם פרוזדורים. מעביר את החדר כדי צלחת נוספת עם PBS 1x הקר. מניח את הצלחת על קרח.
10. חזור על שלבים 1.6-1.9 עד שכל החדרים מאוחזרות.

le "> 2. Epicardial explant תרבות

הערה: תרבות explants epicardial אלה גם בשקופיות קאמרית זכוכית או על ג'ל קולגן עבור יישומים במורד הזרם.

1. זכוכית לשכת שקופיות
   1. כדי להכין את התקשורת והתרבות, להוסיף 10% בסרום שור העובר (FBS), 1% פניצילין / סטרפטומיצין ו -2 ng / צמיחה פיברובלסטים רקומביננטי מ"ל גורם 2 (FGF2) עד בינוני של הנשר שונה של Dulbecco (DMEM). בצע את כל שלבי ברדס הזרימה למינרית.
   2. הוסף מדיה התרבות 500 μl היטב בכל תא 8-היטב.
   3. מניח כל חדר ניכר במרכז באר. אוריינט החדר כדי לשמור על הצד גזור למטה על פני השטח התחתון של הבאר.
   4. בעדינות לשים את הצלחת חממת תרבית תאים 37 מעלות צלזיוס, 5% CO _2.
   5. שמירה על תרבות עם הפרעה מינימלית כדי לאפשר את explants לדבוק. כינונה של monolayer epicardial ניתן לראות לאחר 48-72 שעות.
   6. לבידול של epicardתאי ial לתאי שריר חלק, תרבות תאים בשכבה epicardial בתקשורת בידול עבור 6 ימים נוספים. כדי להכין את התקשורת בידול, להוסיף 10% FBS, 1% פניצילין / סטרפטומיצין ו -50 ng / גורם הגדילה ששינתה את המציאות רקומביננטי מ"ל 1 בטא (TGF-β1) כדי DMEM.
   7. שנה את התקשורת והתרבות לסירוגין.
2. קולגן ג'ל
   1. הכן את ג'ל קולגן צלחת 96-היטב באמצעות ערכת מסחרי 3D קולגן תרבות על פי פרוטוקול של היצרן.
   2. כדי להכין את העוצמה הרצויה של ג'ל קולגן, לערבב את הכמות המתאימה של פתרון קולגן עם 5x של DMEM ו פיפטה למעלה ולמטה. הפתרון צריך להפוך צהוב.
   3. הוספת נפח מקביל של פתרון נטרול ומערבב היטב מייד על ידי pipetting למעלה ולמטה. הפתרון יהפוך ורוד.
   4. פיפטה 100 μl של תערובת זו לבאר כל צלחת 96-היטב. מניחים את צלחת 37 מעלות צלזיוס, 5% CO ₂ באינקובטור במשך 30-60 דקות עד אלהג'ל נמוך לפלמר.
   5. הוסף 200 μl של התקשורת בתרבות שתוארו לעיל היטב כל אחד.
   6. מניח כל חדר ניכר במרכז באר. כוונו את החדר כדי לשמור על הצד הגזור למטה על ג'ל קולגן (הקודקוד של החדר צריך להתמודד עם הנסיין). בעדינות לשים את הצלחת בחזרה בחממת תרבית תאים.
   7. לאחר 3 ימים, להסיר את החדרים. מכניס את הצלחת בחזרה לתוך חממת תרבית תאים עבור 2 ימים נוספים.
   8. שנה את התקשורת והתרבות לסירוגין.

קיבוע ויזואליזציה 3.

הערה: תאי Epicardial ניתן דמיינו על זכוכית או שקופיות קאמריות או ג'ל קולגן.

1. לשאוב את התקשורת והתרבות ולהוסיף נפח שווה של PBS 1x סטרילי כדי לשטוף את התאים.
2. להוסיף מספיק 4% paraformaldehyde (PFA) כדי לכסות את התאים. תקן את התאים במשך 10 דקות ב 4 ° C.
3. הסר PFA ולשטוף explants עם 1x PBST (1x PBS עם0.1% טריטון X-100) כדי permeabilize התאים.
4. Immunostain עם נוגדן הרצוי (למשל אלקסה פלואוריד 488-phalloidin; ZO-1, α-טובולין ו אקטין שריר חלקה α) ^7.

תוצאות

שימוש זה פרוטוקול התרבות, תאי epicardial עיקריים יכולים להיות מבודדים עם טוהר גבוה עבור יישומים במורד זרם. התאים בתרבית מסוגלים לעבור EMT, להעביר ולבדל רק כתאים epicardial לעשות in vivo.

כדי לקבוע את הטו?...

Discussion

זה הוא מכריע לפתח טכניקות להקל על המחקר של epicardium כדי לשרת את המשמעות הגוברת של epicardium בפיתוח לב והתחדשות. מערכת התרבות epicardial תנוחות יתרונות משמעותיים למחקר epicardial.

דרך חלופית לבודד תאים epicardial היא להשתמש מיון התא המופעל פלואורסצנטי...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM)	Life tech invitrogen	11995065
Penicillin/streptomycin solution	Life tech invitrogen	15140122
Fetal bovine serum (FBS)	Life tech invitrogen	10500064
Paraformaldehyde	Sigma	P6148-5KG
Recombinant fibroblast growth factor 2 (FGF2)	PeproTech	450-33
Recombinant transforming growth factor beta 1 (TGF-β1)	PeproTech	100-21
ZO-1 antibody	Life tech invitrogen	40-2200
α-Tubulin antibody	Sigma	T 6074
α-smooth muscle actin (SMA) antibody	Sigma	A 2547
Phalloidin antibody	Life tech invitrogen	A12379
3D Collagen Culture kit	Millipore	ECM 675
8-well chamber slide	Fisher Scientific	NNU 154534-PK
Trizol reagent	Life Technologies	15596-018
ViiA 7 Real-Time PCR System	Life Technologies	4453536
Superscript First Strand Synthesis kit	Life Technologies	11904-018