Экстракорпоральное культуры эпикардиального клеток из эмбриональных сердца

Резюме

The epicardium is an essential source of multipotent cardiovascular progenitor cells and paracrine factors that are required for cardiovascular development and regeneration. We describe here a method to culture mouse embryonic epicardial cells.

Аннотация

During embryogenesis, the epicardial contribution to coronary vasculature development has been very well established. Cells derived from the epicardium differentiate into smooth muscle cells, fibroblasts and endothelial cells that contribute to the formation of coronary vessels. Here we have established an in vitro culture method for embryonic epicardial cells. Using genetic labelling, we have demonstrated that the majority of the migrating cells in our explant culture are of epicardial origin. Epicardial explant cells also retain the expression of epicardial markers (Wt1 and Tbx18). Furthermore, we provide evidence that epicardial explant cells undergo epithelial to mesenchymal transition (EMT), migrate and differentiate into smooth muscle cells after Transforming growth factor beta 1 (TGF-β1) treatment in a manner indistinguishable from that of epicardial cells in vivo. In conclusion, we provide a novel method for the culture of embryonic epicardial cells, which will help to explore the role of specific genes in epicardial cell biology.

Введение

Богатство экспериментальных данных показано, что Эпикард влияет на критические шаги в развитии сердца. В процессе разработки, перегородку transversum приводит к глыбе мезотелиальной клеток , известных как proepicardium ^1-4. Клетки из proepicardium затем мигрируют и конверт миокард, образующий эпикарда. Вслед за этим подмножеством эпикарда клетки подвергаются ЕМТ порождая миграционным популяции эпикарда клеток, полученных (EPDCs), которые впоследствии проникают в миокард. Генетический а также ретровирусный родословная отслеживании эксперименты показали, что EPDCs дифференцироваться в различные клоны, включая гладкомышечные клетки, фибробласты, эндотелиальные клетки и кардиомиоциты (если таковые имеются). Поэтому EPDCs вносят значительный вклад в развитие коронарных сосудов и миокарда архитектуры ^1,2,4-9. Кроме того, эпикарда имеет важное значение для развития желудочковой компактного слоя ^10-12. При еXample Gittenberger-де Грут и др. показали , что ингибирование вырост proepicardium приводит к массиву дефектов , таких как тонкий миокарда, дефицитной зацикливание сердца и аномальному образованию межжелудочковой перегородки и в результате, к эмбриональной летальности ^13. ПАРАКРИННОЙ факторы, секретируемые из эмбрионального эпикарда модулировать пролиферацию кардиомиоцитов и дифференцировки. В соответствии с этим, эпикарда конкретных удаление сигнальных путей , таких как ретиноевая кислота (RA), факторы роста фибробластов (ФРФ) и Wnt / -катенина привело к дефектной роста миокарда и эмбриональной летальности ^14-16.

Хотя эпикарда , как полагают, в состоянии покоя у взрослых сердец, недавние исследования показали , что программа развития будет возобновлена ​​в эпикарда после остановки травмы ^17,18. После активации клетки подвергаются быстрой пролиферации и EMT, которые приводят к образованию EPDC. Эти клетки демонстрируют CapacitY дифференцироваться в фибробластах и клетках гладкой мускулатуры , но не кардиомиоцитов или эндотелиальных клеток ^18. Кроме того, EPDCs секретируют проангиогенные факторы, которые помогают в васкуляризации поврежденной области и тем самым облегчают улучшенную функцию сердца за счет уменьшения размера инфаркта. Из-за этих выводов Эпикард приобрел интерес к изучению сердечно-сосудистых заболеваний, развития и регенерации.

Трансгенные технологии произвели революцию медицинских исследований в 21-м веке. С помощью трансгенных технологий, заболевшие мышиные модели, имитирующие человеческое состояние метаболически и патофизиологически были успешно разработаны. Однако, изучая эпикарда поведение клеток в этих мутантов было проблемой, главным образом из-за ранней эмбриональной летальности. Учитывая значительную роль , которую играет в эпикарда сердца развития и регенерации, мы создали систему культивирования в пробирке для epicardia мышил клетки. Этот метод позволяет долгосрочную культуру эпикарда клеток и облегчает детальное изучение двух важных свойств эпикарда: его способность мигрировать и дифференцироваться. Исключены желудочки от мыши могли быть культивированы на коллагеновые гели, которые могут быть использованы для проведения анализов миграции. Культивируются в 3D - матрицу , которая повторяет коллаген богатых внеклеточного матрицу субэпикардиального слоя лучше повторяет в естественных условиях физиологии клетки. В качестве альтернативы они могут быть культивированы на камерные слайды в целях создания эпикарда монослой, который затем может быть использован для различных последующих применений. Этот монослой может быть использован для окрашивания для плотных соединений белков, которые будут обеспечивать представление о способности эпикарда претерпевать EMT что имеет решающее значение для миграции. Кроме того, эксперименты дифференцировки также могут быть выполнены на этих клетках. Кроме того, профиль экспрессии генов может быть проанализирован путем экстракции РНК из клеток ивыполняя количественной полимеразной цепной реакции (КПЦР). И, наконец, монослои также можно лечить с агентами, за которыми следует молекулярный анализ, чтобы проверить на потенциальных терапевтических средств. Соединенный, эта система эпикардиальная культура дает нам возможность визуализировать и собирать молекулярные данные, которые наше понимание улучшить систему о эпикардиального развития.

Другим желательным признаком этого способа заключается в том, что он прост и не требует дополнительных настроек. Вкратце, зародыши собирают на E11.5 или E12.5, после чего вырезают сердце. Желудочки затем культивировали на любом коллагеновым гелем или камерные слайды. Затем эти клетки могут быть использованы для проведения экспериментов ниже по течению.

протокол

Все эксперименты были одобрены Institutional уходу и использованию животных комитета Duke-NUS Высшей медицинской школы путем.

1. Получение эмбриональных желудочки

1. Пожертвуйте приурочено беременной мыши на желаемом эмбриональной стадии (E11.5 или E12.5), используя эвтаназии камеру с подачи газообразного диоксида углерода или другого утвержденного метода эвтаназии.
2. Поместите мышь на спине на секционном столе. Лечить живот самки с 70% -ным этанолом. Подтяжка кожи над животом и сделать небольшой разрез (1-2 см) с лезвием, а затем, удерживая кожу обеими руками и отодвинуться, чтобы обнажить брюшную стенку.
3. Теперь вырежьте брюшной стенки разоблачить рога матки. Используйте стерильного пинцета, чтобы поднять рог матки и аккуратно срезана жировые ткани и кровеносные сосуды, прикрепленные к роге матки. Вырезать на шейку матки для извлечения матки.
4. Поместите рога матки в чашку Петри, содержащую стерильный холодный 1x фосфатного Буфф Ered физиологический раствор (PBS) и промыть аккуратно. Поместите чашку Петри на льду.
5. Используйте ножницы, чтобы вырезать через среднюю линию рога матки (напротив того места, где находится плацента), чтобы выставить эмбрионов, которые до сих пор внутри желтка и прикрепляется к стенке матки через плаценту.
6. Использование стерильного пинцета, разрезали эмбрионального желтка, чтобы освободить эмбриона.
7. Поместите эмбрион в новую чашку Петри, содержащую стерильный холодный 1x PBS. Обезглавьте эмбриона и разместить его на своей спине. Разрежьте стенки грудной клетки, чтобы разоблачить сердце.
8. Используйте стерильного пинцета, чтобы поднять сердце и отсекли сосуды вокруг него, чтобы освободить сердце от грудной стенки. Обратите особое внимание, чтобы не повредить эпикарда сердца с хирургическими инструментами.
9. Обрежьте тракта оттока и оба предсердия. Передача желудочек другому блюдо с холодным 1x PBS. Поместите блюдо на льду.
10. Повторите шаги 1,6-1,9 пока все желудочки найденную.

ле "> 2. эпикардиального эксплант

Примечание: Культура эти эпикардиальные эксплантов либо на стекле камеры горках или на коллагеновый гель для последующих применений.

1. Стеклянная палата Слайды
   1. Для приготовления культуральных сред, добавить 10% эмбриональной бычьей сыворотки (FBS), 1% пенициллина / стрептомицина и 2 нг / мл фактора роста фибробластов рекомбинантный 2 (FGF2) в среду Дульбекко, модифицированную по Игла (DMEM). Выполните все действия, описанные в ламинарном потоке.
   2. Добавить 500 мкл культуральной среды в каждую лунку 8-луночного камеры.
   3. Поместите каждую вырезанную желудочек в центре колодца. Сориентируйте желудочек, чтобы держать расчлененный стороной вниз на нижней поверхности скважины.
   4. Осторожно положите пластинку в 37 ° C, 5% CO ₂ инкубатор для культивирования клеток.
   5. Поддерживать культуру с минимальным нарушением, чтобы позволить эксплантов придерживаться. Формирование эпикарда монослой можно наблюдать через 48-72 ч.
   6. Для дифференциации epicardIAL клеток в гладкие мышечные клетки, культуры эпикардиального монослой клеток в среде для дифференцировки в течение еще 6 дней. Для приготовления дифференцировки, добавить 10% FBS, 1% пенициллина / стрептомицина и 50 нг / мл рекомбинантного трансформирующий фактор роста бета 1 (TGF- 1) к среде DMEM.
   7. Изменение культуральной среды на разные дни.
2. Коллаген гель
   1. Подготовка коллагеновый гель в 96-луночный планшет с использованием коммерческого набора 3D Коллаген культуры в соответствии с протоколом производителя.
   2. Для получения нужного объема коллагеновый гель, смешать соответствующее количество раствора коллагена с 5х из DMEM и пипетки вверх и вниз. Решение должно желтеют.
   3. Добавьте соответствующий объем нейтрализации раствора и хорошо сразу перемешать с помощью пипетки вверх и вниз. Решение станет розовым.
   4. Пипетка 100 мкл этой смеси в каждую лунку 96-луночного планшета. Поместите пластинку в 37 ° C, 5% CO ₂ инкубаторе в течение 30-60 мин в Альнизкий гель полимеризуется.
   5. Добавить 200 мкл культуральной среды, описанных выше, в каждую лунку.
   6. Поместите каждую вырезанную желудочек в центре колодца. Orient желудочек держать расчлененный стороной вниз на коллагеновый гель (верхушки желудочка должна быть обращена к экспериментатору). Осторожно положите пластину обратно в инкубатор для культивирования клеток.
   7. После 3-х дней, удалите желудочки. Поместите пластину обратно в клеточную культуральную инкубаторе в течение еще 2-х дней.
   8. Изменение культуральной среды на разные дни.

3. Закрепление и визуализация

Примечание: эпикарда клетки могут быть визуализированы на любой из палат слайдах из стекла или коллагеновый гель.

1. Аспирацию из средств массовой культуры и добавляют равный объем стерильного 1x PBS, чтобы промыть клетки.
2. Добавьте только достаточно 4% параформальдегида (PFA), чтобы покрыть клетки. Закрепить клетки в течение 10 мин при температуре 4 ° С.
3. Удалить PFA и мыть эксплантов с 1x PBST (1x PBS с0,1% Тритон Х-100), чтобы клетки проницаемыми.
4. Immunostain с желаемого антитела (например , Alexa Fluor 488-фаллоидином; ZO-1, α-тубулина и α-актин гладких мышц) ^7.

Результаты

При использовании этого протокола культуры, первичные эпикарда клетки могут быть выделены с высокой степенью чистоты для последующих применений. Культивируемые клетки способны подвергаться EMT, мигрируют и дифференцируются как клетки эпикарда делать в естественн?...

Обсуждение

Это имеет решающее значение для разработки методов, которые облегчают изучение эпикарда для удовлетворения растущего значения эпикарда сердечного развития и регенерации. Система эпикардиальная культуры создает значительные преимущества для эпикардиального исследований.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM)	Life tech invitrogen	11995065
Penicillin/streptomycin solution	Life tech invitrogen	15140122
Fetal bovine serum (FBS)	Life tech invitrogen	10500064
Paraformaldehyde	Sigma	P6148-5KG
Recombinant fibroblast growth factor 2 (FGF2)	PeproTech	450-33
Recombinant transforming growth factor beta 1 (TGF-β1)	PeproTech	100-21
ZO-1 antibody	Life tech invitrogen	40-2200
α-Tubulin antibody	Sigma	T 6074
α-smooth muscle actin (SMA) antibody	Sigma	A 2547
Phalloidin antibody	Life tech invitrogen	A12379
3D Collagen Culture kit	Millipore	ECM 675
8-well chamber slide	Fisher Scientific	NNU 154534-PK
Trizol reagent	Life Technologies	15596-018
ViiA 7 Real-Time PCR System	Life Technologies	4453536
Superscript First Strand Synthesis kit	Life Technologies	11904-018