Culture in vitro de cellules épicardiques De Coeur souris embryonnaires

Résumé

The epicardium is an essential source of multipotent cardiovascular progenitor cells and paracrine factors that are required for cardiovascular development and regeneration. We describe here a method to culture mouse embryonic epicardial cells.

Résumé

During embryogenesis, the epicardial contribution to coronary vasculature development has been very well established. Cells derived from the epicardium differentiate into smooth muscle cells, fibroblasts and endothelial cells that contribute to the formation of coronary vessels. Here we have established an in vitro culture method for embryonic epicardial cells. Using genetic labelling, we have demonstrated that the majority of the migrating cells in our explant culture are of epicardial origin. Epicardial explant cells also retain the expression of epicardial markers (Wt1 and Tbx18). Furthermore, we provide evidence that epicardial explant cells undergo epithelial to mesenchymal transition (EMT), migrate and differentiate into smooth muscle cells after Transforming growth factor beta 1 (TGF-β1) treatment in a manner indistinguishable from that of epicardial cells in vivo. In conclusion, we provide a novel method for the culture of embryonic epicardial cells, which will help to explore the role of specific genes in epicardial cell biology.

Introduction

Une grande quantité de données expérimentales ont montré que l'épicarde influence des étapes cruciales dans le développement cardiaque. Au cours du développement, le septum transversum donne lieu à un amas de cellules mésothéliales connu sous le nom proepicardium ^1-4. Les cellules de la proepicardium migrent ensuite et l'enveloppe du myocarde formant l'épicarde. Par la suite, un sous-ensemble de cellules épicardiques subissent EMT donnant lieu à une population migratoire des cellules dérivées épicarde (EPDCs) qui envahissent la suite du myocarde. lignée génétique ainsi que rétroviral traçage des expériences ont démontré que EPDCs se différencient en diverses lignées, y compris les cellules musculaires lisses, les fibroblastes, les cellules endotheliales et des cardiomyocytes (le cas échéant). Par conséquent EPDCs contribuent de manière significative au développement de la vascularisation coronarienne et de l' architecture du myocarde ^1,2,4-9. En outre, l'épicarde est essentiel pour le développement de la couche compacte ventriculaire ^10-12. Pour exemple Gittenberger de Groot et al. , ont démontré que l' inhibition de l'excroissance du proepicardium conduit à un réseau de défauts tels qu'une mince myocarde, mise en boucle déficiente du coeur et la formation du septum interventriculaire anormale et par conséquent, une létalité embryonnaire ^13. facteurs paracrines sécrétées par l'épicarde embryonnaire modulent la prolifération des cardiomyocytes et la différenciation. Conformément à cela, la suppression spécifique de l' épicarde des voies de signalisation comme l' acide rétinoïque (RA), les facteurs de croissance des fibroblastes (FGF) et Wnt / β-caténine a entraîné une croissance du myocarde défectueux et une létalité embryonnaire ^14-16.

Bien que l'épicarde croyait être au repos dans les cœurs adultes, des études récentes ont montré que le programme de développement est réactivé dans l'épicarde après une lésion cardiaque ^17,18. Lors de l'activation, les cellules subissent une prolifération rapide et EMT qui aboutissent à la formation EPDC. Ces cellules présentent l'Capacity se différencier en fibroblastes et des cellules musculaires lisses mais non cardiomyocytes ou des cellules endothéliales ^18. En outre, les EPDCs sécrètent des facteurs pro-angiogéniques que l'aide dans la vascularisation de la zone lésée et faciliter ainsi la fonction cardiaque améliorée en réduisant la taille de l'infarctus. En raison de ces résultats, l'épicarde a gagné l'intérêt pour l'étude du développement cardio-vasculaire, la maladie et la régénération.

La technologie transgénique a révolutionné la recherche médicale dans le 21e siècle. À l'aide des technologies transgéniques, des modèles de souris malades mimant la condition humaine et pathophysiologique métaboliquement ont été développés avec succès. Cependant, l'étude du comportement des cellules épicardique dans ces mutants a été un défi principalement due à une létalité embryonnaire précoce. Considérant le rôle important que l'épicarde joue dans le développement cardiaque et la régénération, nous avons mis en place un système de culture in vitro pour epicardia de la sourisl cellules. Cette méthode permet la culture à long terme des cellules épicardiques et facilite l'étude détaillée des deux propriétés importantes de l'épicarde: sa capacité à migrer et à se différencier. Ventricules excisé de la souris peuvent être cultivées sur des gels de collagène qui peuvent être utilisés pour réaliser des dosages de migration. Être cultivé dans une matrice 3D qui reproduit la matrice extracellulaire riche en collagène de la couche épicardique mieux récapitule in vivo dans la physiologie cellulaire. En variante, elles peuvent être cultivées sur des lames de la chambre, afin d'établir une monocouche épicardique qui peut ensuite être utilisé pour une variété d'applications en aval. Cette monocouche peut être utilisé pour colorer les protéines des jonctions serrées qui fourniront un aperçu sur la capacité de l'épicarde à subir EMT qui est crucial pour la migration. En outre, des expériences de différenciation peuvent également être effectuées sur ces cellules. En outre, le profil d'expression génique peut être analysé par extraction de l'ARN à partir des cellules eteffectuer une réaction en chaîne par polymérase quantitative (qPCR). Enfin, les monocouches peuvent également être traités avec des agents, suivie d'une analyse moléculaire pour tester les agents thérapeutiques potentiels. Mis ensemble, ce système de culture épicardique nous offre la possibilité de visualiser et de recueillir des données moléculaires qui favorise notre compréhension sur le développement épicardique.

Une autre caractéristique souhaitable de cette méthode est qu'elle est simple et aucune installation complexe est nécessaire. En bref, les embryons sont récoltés à E11.5 ou E12.5 suivant laquelle le cœur est excisée. Les ventricules sont ensuite cultivées soit sur un gel de collagène ou des diapositives de chambre. Ensuite, ces cellules peuvent être utilisées pour réaliser des expériences en aval.

Protocole

Toutes les expériences ont été approuvées par le Comité institutionnel de protection et d'utilisation des animaux Duke-NUS Graduate Medical School.

1. Récupération de la Embryonic ventricules

1. Sacrifiez une souris enceinte chronométré au stade embryonnaire souhaité (E11.5 ou E12.5) en utilisant une chambre de l'euthanasie avec l'approvisionnement en gaz de dioxyde de carbone ou d'une autre méthode d'euthanasie approuvée.
2. Placez la souris sur le dos sur une table de dissection. Désinfecter l'abdomen de la femelle avec 70% d'éthanol. Soulevez la peau sur le ventre et faire une petite incision (1-2 cm) avec une lame, puis maintenez la peau avec les deux mains et tirez pour exposer la paroi abdominale.
3. Maintenant, coupez la paroi abdominale pour exposer la corne utérine. Utilisez des pinces stériles pour soulever la corne utérine et soigneusement couper les tissus adipeux et les vaisseaux sanguins attachés à la corne utérine. Couper au niveau du col pour récupérer l'utérus.
4. Placez la corne utérine dans une boîte de Pétri contenant du froid stérile 1x Phosphate Buff Ered Saline (PBS) et rincer doucement. Placez la boîte de Pétri sur de la glace.
5. Utilisez des ciseaux pour couper à travers la ligne médiane de la corne de l'utérus (en face du site où le placenta est situé) pour exposer les embryons qui sont encore à l'intérieur du sac vitellin et attaché à la paroi utérine à travers le placenta.
6. En utilisant des pinces stériles, couper ouvert le jaune sac embryonnaire pour libérer l'embryon.
7. Placez l'embryon dans une nouvelle boîte de Pétri contenant stérile froid 1x PBS. Décapitez l'embryon et le placer sur son dos. Couper ouvert la paroi thoracique afin d'exposer le cœur.
8. Utilisez des pinces stériles pour soulever le cœur et couper les vaisseaux autour de lui pour libérer le coeur de la paroi thoracique. Faites attention à ne pas endommager l'épicarde du coeur avec les outils chirurgicaux.
9. Coupez le tube de sortie et les deux oreillettes. Transférer le ventricule à un autre plat avec 1x PBS froid. Placer le plat sur la glace.
10. Répétez les étapes 1,6-1,9 jusqu'à ce que tous les ventricules sont récupérés.

le "> 2. épicardique Explantation Culture

Note: Culture ces explants épicardiques soit sur des lames de la chambre de verre ou sur un gel de collagène pour des applications en aval.

1. Verre Chambre Diapositives
   1. Pour préparer le milieu de culture, ajouter 10% de sérum bovin fœtal (FBS), 1% de pénicilline / streptomycine et 2 ng / ml de facteur de croissance fibroblastique recombinant 2 (FGF2) au milieu de Eagle modifié par Dulbecco (DMEM). Effectuer toutes les étapes de la hotte à flux laminaire.
   2. Ajouter 500 ul de milieu de culture à chaque puits d'une chambre à 8 puits.
   3. Placer chaque ventricule excisé au centre d'un puits. Orientez le ventricule de garder le côté disséquée vers le bas sur la surface inférieure du puits.
   4. Placez délicatement la plaque dans un 37 ° C, 5% de CO ₂ culture cellulaire incubateur.
   5. Maintenir la culture avec un minimum de perturbation pour permettre aux explants d'adhérer. La formation de la monocouche épicardique peut être observée après 48-72 h.
   6. Pour la différenciation des Epicardcellules ial dans les cellules musculaires lisses, la culture des cellules monocouches épicardiques dans les milieux de différenciation pendant encore 6 jours. Pour préparer le milieu de différenciation, ajouter 10% de FBS, 1% de pénicilline / streptomycine et 50 ng / ml de facteur de croissance transformant bêta 1 recombinant (TGF-β1) de DMEM.
   7. Changer le milieu de culture tous les deux jours.
2. collagène Gel
   1. Préparer le gel de collagène dans une plaque à 96 puits en utilisant un kit 3D collagène culture commerciale selon le protocole du fabricant.
   2. Pour préparer le volume désiré de gel de collagène, mélanger la quantité appropriée de solution de collagène avec 5x de DMEM et la pipette de haut en bas. La solution doit virer au jaune.
   3. Ajouter un volume correspondant de solution de neutralisation et bien mélanger immédiatement par pipetage de haut en bas. La solution va virer au rose.
   4. Pipette 100 pi de ce mélange dans chaque puits d'une plaque de 96 puits. Placer la plaque dans un 37 ° C, 5% de CO ₂ incubateur pendant 30-60 min à albas du gel à polymériser.
   5. Ajouter 200 ul de milieux de culture décrits ci-dessus à chaque puits.
   6. Placer chaque ventricule excisé au centre d'un puits. Orienter le ventricule à garder le côté disséqué sur le gel de collagène (apex du ventricule doit faire face à l'expérimentateur). Placez délicatement la plaque dans l'incubateur de culture cellulaire.
   7. Après 3 jours, retirez les ventricules. Mettez la plaque arrière dans l'incubateur de culture cellulaire pendant 2 jours.
   8. Changer le milieu de culture tous les deux jours.

3. Fixation et visualisation

Remarque: les cellules épicardiques peuvent être visualisées soit sur des diapositives de chambre de verre ou un gel de collagène.

1. Aspirer les milieux de culture et ajouter un volume égal de stérile 1x PBS pour laver les cellules.
2. Ajouter suffisamment à seulement 4% de paraformaldehyde (PFA) pour couvrir les cellules. Fixer les cellules pendant 10 min à 4 ° C.
3. Retirer PFA et laver explants avec 1x PBST (PBS 1x avec0,1% de triton X-100) pour perméabiliser les cellules.
4. Immunocoloration avec un anticorps désiré (par exemple , Alexa Fluor 488-phalloïdine; ZO-1, α-tubuline et α-actine musculaire lisse) ^7.

Résultats

En utilisant ce protocole de culture, les cellules épicardiques primaires peuvent être isolés avec une grande pureté pour des applications en aval. Les cellules cultivées sont capables de subir une EMT, migrer et se différencier comme les cellules épicardiques faire in vivo.

Pour déterminer la pureté de notre culture cellulaire épicardique primaire, nous avons analysé les explants épicardiques générés p...

Discussion

Il est essentiel de développer des techniques qui facilitent l'étude de l'épicarde pour répondre à l'importance croissante de l'épicarde dans le développement cardiaque et la régénération. Le système de culture épicardique représente des avantages importants pour la recherche épicardique.

Une autre façon d'isoler des cellules épicardiques consiste à utiliser un tri cellulaire activé par fluorescence (FACS). Cette méthode repose sur l'utilisation de ...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM)	Life tech invitrogen	11995065
Penicillin/streptomycin solution	Life tech invitrogen	15140122
Fetal bovine serum (FBS)	Life tech invitrogen	10500064
Paraformaldehyde	Sigma	P6148-5KG
Recombinant fibroblast growth factor 2 (FGF2)	PeproTech	450-33
Recombinant transforming growth factor beta 1 (TGF-β1)	PeproTech	100-21
ZO-1 antibody	Life tech invitrogen	40-2200
α-Tubulin antibody	Sigma	T 6074
α-smooth muscle actin (SMA) antibody	Sigma	A 2547
Phalloidin antibody	Life tech invitrogen	A12379
3D Collagen Culture kit	Millipore	ECM 675
8-well chamber slide	Fisher Scientific	NNU 154534-PK
Trizol reagent	Life Technologies	15596-018
ViiA 7 Real-Time PCR System	Life Technologies	4453536
Superscript First Strand Synthesis kit	Life Technologies	11904-018