Cultivo in vitro de células a partir de epicárdicos del corazón de embriones de ratón

Resumen

The epicardium is an essential source of multipotent cardiovascular progenitor cells and paracrine factors that are required for cardiovascular development and regeneration. We describe here a method to culture mouse embryonic epicardial cells.

Resumen

During embryogenesis, the epicardial contribution to coronary vasculature development has been very well established. Cells derived from the epicardium differentiate into smooth muscle cells, fibroblasts and endothelial cells that contribute to the formation of coronary vessels. Here we have established an in vitro culture method for embryonic epicardial cells. Using genetic labelling, we have demonstrated that the majority of the migrating cells in our explant culture are of epicardial origin. Epicardial explant cells also retain the expression of epicardial markers (Wt1 and Tbx18). Furthermore, we provide evidence that epicardial explant cells undergo epithelial to mesenchymal transition (EMT), migrate and differentiate into smooth muscle cells after Transforming growth factor beta 1 (TGF-β1) treatment in a manner indistinguishable from that of epicardial cells in vivo. In conclusion, we provide a novel method for the culture of embryonic epicardial cells, which will help to explore the role of specific genes in epicardial cell biology.

Introducción

Una gran cantidad de datos experimentales han puesto de manifiesto que el epicardio influye en los pasos críticos en el desarrollo cardíaco. Durante el desarrollo, el tabique transverso da lugar a un grupo de células mesoteliales conocidos como proepicardio ^1-4. Las células de la proepicardio luego migran y el sobre el miocardio que forma el epicardio. Después de esto, un subconjunto de células epicárdicas someterse a aumento EMT dando a una población migratorio de las células derivadas del epicardio se (EPDCs) que posteriormente invaden el miocardio. linaje genético, así como el rastreo retroviral experimentos han demostrado que EPDCs diferenciarse en varios linajes, incluyendo células de músculo liso, fibroblastos, células endoteliales y cardiomiocitos (si los hay). Por lo tanto EPDCs contribuyen significativamente al desarrollo de la vasculatura coronaria y la arquitectura miocárdica ^1,2,4-9. Además, el epicardio es esencial para el desarrollo de la capa compacta ventricular ^10-12. Delanteroxample Gittenberger-de Groot et al. demostró que la inhibición de la excrecencia de la proepicardio conduce a una serie de defectos, tales como el miocardio delgada, looping deficiente del corazón y la formación de septum interventricular anormal y, como resultado, la letalidad embrionaria ^13. factores paracrinos secretadas desde el epicardio embrionario modular la proliferación de los cardiomiocitos y la diferenciación. En consonancia con esto, la deleción-epicardio específica de las vías de señalización tales como el ácido retinoico (RA), factores de crecimiento de fibroblastos (FGFs) y Wnt / β-catenina resultó en el crecimiento del miocardio defectuoso y letalidad embrionaria ^14-16.

Aunque el epicardio se creía que era quiescente en corazones adultos, estudios recientes han demostrado que el programa de desarrollo se reactiva en el epicardio después de una lesión cardiaca ^17,18. Tras la activación, las células se someten a una rápida proliferación y EMT que dan lugar a la formación de EPDC. Estas células exhiben el capacity de diferenciarse en fibroblastos y células musculares lisas pero no cardiomiocitos o células endoteliales ^18. Además, los EPDCs secretan factores proangiogénicos que ayudan en la vascularización de la zona lesionada y así facilitar la mejora de la función cardíaca mediante la reducción del tamaño del infarto. Debido a estos resultados, el epicardio ha ganado interés en el estudio del desarrollo cardiovascular, la enfermedad y la regeneración.

La tecnología transgénica ha revolucionado la investigación médica en el siglo 21. Con la ayuda de tecnologías transgénicas, los modelos de ratón enfermas que imitan la condición humana metabólicamente y fisiopatológico se han desarrollado con éxito. Sin embargo, el estudio del comportamiento de células epicárdica en estos mutantes ha sido un reto debido principalmente a la letalidad embrionaria temprana. Teniendo en cuenta el importante papel que juega el epicardio en el desarrollo y la regeneración cardiaca, hemos establecido un sistema de cultivo in vitro para ratón epicardiacélulas L. Este método permite que el cultivo a largo plazo de las células epicárdicas y facilita el estudio detallado de las dos propiedades importantes del epicardio: su capacidad de migrar y diferenciarse. Los ventrículos escindió del ratón podrían ser cultivadas en geles de colágeno que pueden ser utilizados para llevar a cabo los ensayos de migración. De haber sido cultivadas en una matriz 3D que reproduce la matriz extracelular rica en colágeno de la capa subepicárdica mejor recapitula la fisiología celular in vivo. Alternativamente, pueden ser cultivadas en portaobjetos de cámara con el fin de establecer una monocapa epicárdica que luego se puede utilizar para una variedad de aplicaciones aguas abajo. Esta monocapa se puede utilizar para teñir para proteínas de unión estrecha que proporcionará información sobre la capacidad del epicardio a someterse a EMT que es crucial para la migración. Además, los experimentos de diferenciación también pueden llevarse a cabo en estas células. Además, el perfil de expresión génica se puede analizar mediante la extracción de ARN de las células yla realización de la reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (qPCR). Por último, las monocapas también podrían ser tratados con agentes, seguido de un análisis molecular para probar posibles terapias. En conjunto, este sistema de cultivo epicárdica nos proporciona la oportunidad de visualizar y obtener datos molecular que promueve nuestro entendimiento sobre el desarrollo del epicardio.

Otra característica deseable de este método es que es sencilla y no se requiere ninguna configuración compleja. En resumen, los embriones se recogieron a E11.5 E12.5 o después de lo cual se extirpó el corazón. Los ventrículos se cultivan a continuación en cualquiera de gel de colágeno o la cámara de diapositivas. Posteriormente, estas células se pueden utilizar para llevar a cabo experimentos de aguas abajo.

Protocolo

Todos los experimentos fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de Duke-NUS Graduate Medical School.

1. Recuperación de la embrionaria Ventrculos

1. Sacrificar un ratón embarazadas transitoria en la etapa embrionaria deseada (E11.5 E12.5 o) usando una cámara de eutanasia con el suministro de gas de dióxido de carbono u otro método de eutanasia aprobada.
2. Coloca el ratón sobre su espalda en una mesa de disección. Desinfectar el abdomen de la hembra con un 70% de etanol. Levante la piel sobre el vientre y hacer una pequeña incisión (1-2 cm) con una cuchilla, a continuación, mantenga la piel con ambas manos y tire de él para exponer la pared abdominal.
3. Ahora corte de la pared abdominal para exponer la trompa uterina. El uso de fórceps estériles para levantar el cuerno uterino y corte con cuidado los tejidos grasos y los vasos sanguíneos unidos a la trompa uterina. Cortar el cuello del útero para recuperar el útero.
4. Coloque el cuerno uterino en una placa de Petri que contiene fosfato estéril fría 1x Buff Ered salino (PBS) y enjuagar suavemente. Coloque la placa de Petri en el hielo.
5. Use las tijeras para cortar a través de la línea media del cuello uterino (opuesta al sitio donde se encuentra la placenta) para exponer los embriones que aún se encuentran en el interior del saco vitelino y pegado a la pared uterina a través de la placenta.
6. El uso de pinzas estériles, cortar abierto el saco vitelino embrionario para liberar al embrión.
7. Coloque el embrión en una nueva placa de Petri que contiene estéril frío 1x PBS. Decapitar al embrión y colocarlo en su parte posterior. A cielo abierto de la pared torácica para exponer el corazón.
8. El uso de fórceps estériles para levantar el corazón y cortar los vasos alrededor de ella para liberar el corazón de la pared torácica. Prestar especial atención para no dañar el epicardio del corazón con las herramientas quirúrgicas.
9. Se quita el tracto de salida y ambas aurículas. Transferir el ventrículo a otro plato con 1x PBS frío. Coloque el plato en el hielo.
10. Repita los pasos 1.6-1.9 hasta que todos los ventrículos se recuperan.

Le "> 2. epicárdica explante Cultura

Nota: Cultura estos explantes epicárdicas ya sea en la cámara de diapositivas de vidrio o en gel de colágeno para aplicaciones posteriores.

1. Cámara de vidrio diapositivas
   1. Para preparar el medio de cultivo, añadir 10% de suero bovino fetal (FBS), 1% de penicilina / estreptomicina y 2 ng / ml de factor de crecimiento de fibroblastos recombinante 2 (FGF2) para el medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM). Realizar todos los pasos de la campana de flujo laminar.
   2. Añadir 500 l de medios de cultivo a cada pocillo de una cámara de 8 pocillos.
   3. Coloque cada ventrículo escindido en el centro de un pozo. Oriente el ventrículo para mantener el lado diseccionado hacia abajo en la superficie inferior del pozo.
   4. Introduzca suavemente la placa en un 37 ° C, 5% de CO ₂ incubadora de cultivo celular.
   5. Mantener el cultivo con el mínimo de perturbación para permitir que los explantes se adhieran. La formación de la monocapa epicárdica puede ser observado después de 48 a 72 hr.
   6. Para la diferenciación de epicardial células en células musculares lisas, cultivar las células epicárdicas monocapa en medio de diferenciación para otros 6 días. Para preparar el medio de diferenciación, añadir 10% de FBS, 1% de penicilina / estreptomicina y 50 ng / ml de factor de crecimiento transformante beta recombinante 1 (TGF-β1) a DMEM.
   7. Cambiar el medio de cultivo en días alternos.
2. Gel de colágeno
   1. Preparar el gel de colágeno en una placa de 96 pocillos usando un kit comercial Cultura 3D colágeno de acuerdo con el protocolo del fabricante.
   2. Para preparar el volumen deseado de gel de colágeno, se mezcla la cantidad apropiada de solución de colágeno con 5x de DMEM y la pipeta hacia arriba y abajo. La solución debe tornarse amarilla.
   3. Añadir un volumen correspondiente de la solución de neutralización y mezclar bien inmediatamente pipeteando arriba y abajo. La solución se vuelve rosada.
   4. Pipetear 100 l de esta mezcla en cada pocillo de una placa de 96 pocillos. Colocar la placa en un 37 ° C, 5% de _CO2 durante 30-60 minutos a Albajo el gel se polimerice.
   5. Añadir 200 l de medios de cultivo descritos anteriormente a cada pocillo.
   6. Coloque cada ventrículo escindido en el centro de un pozo. Oriente el ventrículo para mantener el lado diseccionado hacia abajo en el gel de colágeno (ápex del ventrículo debe enfrentar el experimentador). Introduzca suavemente la placa posterior en la incubadora de cultivo celular.
   7. Después de 3 días, retire los ventrículos. Coloque la placa de nuevo en la incubadora de cultivo celular durante otros 2 días.
   8. Cambiar el medio de cultivo en días alternos.

3. Fijación y Visualización

Nota: las células epicárdicas pueden visualizarse en cualquiera de portaobjetos de cámara de vidrio o gel de colágeno.

1. Aspirar los medios de cultivo y añadir un volumen igual de PBS estéril 1x para lavar las células.
2. Añadir la cantidad necesaria paraformaldehído al 4% (PFA) para cubrir las células. Fijar las células durante 10 minutos a 4 ° C.
3. Retire PFA y lavar con explantes 1x PBST (PBS 1x con0,1% Tritón X-100) para permeabilizar las células.
4. Inmunotinción con anticuerpo deseado (por ejemplo, Alexa Fluor 488-faloidina; ZO-1, α-tubulina y actina de músculo liso α-) ^7.

Resultados

El uso de este protocolo de cultivo, las células epicárdicas primarios se pueden aislar con alta pureza para aplicaciones posteriores. Las células cultivadas son capaces de someterse a EMT, migrar y diferenciarse al igual que las células epicárdicas hacen en vivo.

Para determinar la pureza de nuestro cultivo de células del epicardio primaria, se analizaron los explantes epicárdicas generados a partir de Sem...

Discusión

Es fundamental para el desarrollo de técnicas que facilitan el estudio del epicardio para atender a la creciente importancia del epicardio en el desarrollo cardiaco y la regeneración. El sistema de cultivo epicárdica plantea ventajas significativas para la investigación epicárdica.

Una forma alternativa para aislar las células epicárdicas es utilizar la clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS). Este método se basa en el uso de marcadores epicárdicas (o expresió...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM)	Life tech invitrogen	11995065
Penicillin/streptomycin solution	Life tech invitrogen	15140122
Fetal bovine serum (FBS)	Life tech invitrogen	10500064
Paraformaldehyde	Sigma	P6148-5KG
Recombinant fibroblast growth factor 2 (FGF2)	PeproTech	450-33
Recombinant transforming growth factor beta 1 (TGF-β1)	PeproTech	100-21
ZO-1 antibody	Life tech invitrogen	40-2200
α-Tubulin antibody	Sigma	T 6074
α-smooth muscle actin (SMA) antibody	Sigma	A 2547
Phalloidin antibody	Life tech invitrogen	A12379
3D Collagen Culture kit	Millipore	ECM 675
8-well chamber slide	Fisher Scientific	NNU 154534-PK
Trizol reagent	Life Technologies	15596-018
ViiA 7 Real-Time PCR System	Life Technologies	4453536
Superscript First Strand Synthesis kit	Life Technologies	11904-018