저자
연락처

로그인

JoVE 비디오를 활용하시려면 도서관을 통한 기관 구독이 필요합니다. 전체 비디오를 보시려면 로그인하거나 무료 트라이얼을 시작하세요.

기사 소개

  • 요약
  • 초록
  • 서문
  • 프로토콜
  • 결과
  • 토론
  • 공개
  • 감사의 말
  • 자료
  • 참고문헌
  • 재인쇄 및 허가

요약

The epicardium is an essential source of multipotent cardiovascular progenitor cells and paracrine factors that are required for cardiovascular development and regeneration. We describe here a method to culture mouse embryonic epicardial cells.

초록

During embryogenesis, the epicardial contribution to coronary vasculature development has been very well established. Cells derived from the epicardium differentiate into smooth muscle cells, fibroblasts and endothelial cells that contribute to the formation of coronary vessels. Here we have established an in vitro culture method for embryonic epicardial cells. Using genetic labelling, we have demonstrated that the majority of the migrating cells in our explant culture are of epicardial origin. Epicardial explant cells also retain the expression of epicardial markers (Wt1 and Tbx18). Furthermore, we provide evidence that epicardial explant cells undergo epithelial to mesenchymal transition (EMT), migrate and differentiate into smooth muscle cells after Transforming growth factor beta 1 (TGF-β1) treatment in a manner indistinguishable from that of epicardial cells in vivo. In conclusion, we provide a novel method for the culture of embryonic epicardial cells, which will help to explore the role of specific genes in epicardial cell biology.

서문

실험 데이터의 재산은 심장 외막은 심장 개발에 중요한 단계에 영향을 미치는 것을 설명했다. 개발하는 동안, 격벽 transversum는 proepicardium 1-4라고도 중피 세포 덩어리를 일으킨다. proepicardium의 세포는 마이그레이션 및 심장 외막을 형성 심근 봉투. 이 후, 심 외막 세포의 일부는 이후 심근을 침범 심장 외막 유래 세포 (EPDCs)의 철새 인구 EMT주는 상승을 받다. 실험 추적 유전자뿐만 아니라 레트로 바이러스 계보 EPDCs가 평활근 세포, 섬유 아세포, 내피 세포 및 심근 (있는 경우)를 포함한 다양한 계통으로 분화 것을 증명했다. 따라서 EPDCs는 관상 동맥 혈관과 심근 아키텍처 1,2,4-9의 발전에 크게 기여하고 있습니다. 또한, 상기 외막은 심실 컴팩트 10-12 층의 개발이 필수적이다. 전자의 경우xample Gittenberger - 드 그루 등. proepicardium의 생장을 억제하는 등의 얇은 심근, 심장과 비정상적인 심실 중격 형성의 부족 루프로 그 결과, 배아 치사 (13) 결함의 배열에 이르게 것을 보여 주었다. 배아 심장 외막에서 분비 분비 인자는 심근 세포의 증식과 분화를 조절한다. 이과 일치, 같은 레티노 산 (RA), 섬유 아세포 성장 인자 (FGFs)과의 Wnt / β-catenin이 같은 신호 전달 경로의 심장 외막 특정 삭제에 결함이 심근 성장과 배아 치사 14-16의 결과.

심장 외막이 성인의 마음에 대기 것으로 생각되었지만, 최근의 연구는 발달 프로그램은 심장 부상 17, 18 다음 심장 외막에 활성화되는 것으로 나타났습니다. 활성화되면, 세포 EPDC 형성 될 급속한 증식과 EMT를 겪는다. 이러한 세포는 capacit 전시Y는 섬유 아세포 및 평활근 세포가 아니라 심근 세포 또는 혈관 내피 세포 (18)로 분화한다. 또한 EPDCs는 손상된 영역의 혈관에서 지원하므로이 경색 크기를 감소시킴으로써 개선 된 심장 기능을 촉진한다는 proangiogenic 인자를 분비한다. 때문에 이러한 결과로, 심장 외막은 심장 혈관 개발, 질병 및 재생 연구에 대한 관심을 얻고있다.

형질 전환 기술은 21 세기 의학 연구에 혁명을했다. 형질 전환 기술의 도움으로 대사 및 pathophysiologically 인간 조건을 모방 질환 마우스 모델이 성공적으로 개발되었다. 그러나, 이러한 돌연변이 체의 심 외막 세포의 행동을 연구하는 것은 초기 배아 치사에 주로 도전하고있다. 심장 외막은 심장 개발 및 재생에서 활약하는 중요한 역할을 고려할 때, 우리는 마우스 epicardia에 대한 체외 배양 시스템을 확립리터 세포. 이 방법은 심 외막 세포의 장기 배양이 가능하고 외막의 두 가지 중요한 특성의 상세한 연구를 용이하게한다 : 이동 및 분화하는 능력. 마우스에서 적출 심실은 마이그레이션 분석을 수행하는 데 사용할 수있는 콜라겐 겔상에서 배양 될 수있다. 더 subepicardial 층의 콜라겐이 풍부한 세포 외 기질을 복제하는 생체 세포 생리학을 되풀이되었습니다 차원 매트릭스에서 배양된다. 대안들은 다음 하류 다양한 용도에 사용할 수있는 외막 단층을 설정하기 위해 챔버 슬라이드상에서 배양 될 수있다. 이 단분자막은 마이그레이션 중요 EMT를 받아야하는 심장 외막의 능력에 대한 통찰력을 제공한다 꽉 접합 단백질 염색하기 위해 사용될 수있다. 또한, 분화 실험은 이러한 세포상에서 수행 될 수있다. 또한, 유전자 발현 프로파일을 세포로부터 RNA를 추출하여 분석 할 수 있고,정량적 폴리머 라제 연쇄 반응 (qPCR에)을 수행. 마지막으로, 단일 층은 잠재적 인 치료제를 테스트하는 분자 분석 하였다 제로 처리 될 수있다. 함께 넣어,이 심 외막 문화 시스템은 시각화 및 심 외막 개발에 대한 우리의 이해를 발전한다 분자 데이터를 수집 할 수있는 기회를 우리에게 제공한다.

이 방법의 또 다른 바람직한 특징은 간단하고 더 복잡한 설정이 필요하지 않다는 것이다. 간단히, 배아는 심장이 절제되어 E11.5 또는 E12.5 다음에 수확된다. 심실은 콜라겐 젤 또는 챔버 슬라이드 중 하나에 배양. 이어서, 이들 세포는 하류 실험을 수행 할 수있다.

프로토콜

모든 실험은 듀크 - NUS 대학원 의과 대학 기관 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인되었습니다.

1. 배아 심실 가져

  1. 탄산 가스 공급 장치 또는 다른 승인 안락사 법으로 안락사 챔버를 사용하여 원하는 배아 단계 (E11.5 또는 E12.5)에서 타이밍 임신 마우스를 희생한다.
  2. 해부 테이블에 그 뒷면에 마우스를 놓습니다. 70 % 에탄올로 여성의 복부를 소독. 배꼽을 통해 피부를 들어 올려 블레이드와 작은 절개 (1-2cm)를 확인 후, 두 손으로 피부를 유지하고 복부 벽을 노출 멀리 당기십시오.
  3. 이제 자궁 경적을 노출하는 복벽을 잘라. 자궁 뿔을 들어 올려 멸균 집게를 사용하여 조심스럽게 자궁에 부착 된 지방 조직과 혈관을 절단. 자궁 경부에서 절단하여 자궁을 검색 할 수 있습니다.
  4. 멸균 차가운 1X 인산 버프를 포함하는 배양 접시에 자궁 경적을 배치 겹으로 식염수 (PBS) 부드럽게 씻어. 얼음에 페트리 접시를 놓습니다.
  5. 난황 내부에 여전히 및 태반을 통해 자궁 벽에 부착 된 배아를 노출 (반대 태반이있는 사이트) 자궁 뿔의 중간 선을 잘라 가위를 사용합니다.
  6. 멸균 집게를 사용하여 배아를 무료로 배아 난황을 자르면.
  7. 멸균 차가운 1X PBS를 포함하는 새로운 배양 접시에서 배아를 놓습니다. 배아 목을 벨과 뒷면에 배치합니다. 심장을 노출 가슴 벽을 자르면.
  8. 마음을 들어 올려 가슴 벽에서 마음을 무료로 주변의 혈관을 절단하기 위해 멸균 집게를 사용합니다. 수술 도구를 사용하여 심장의 심장 외막이 손상되지 않도록 특별한주의를 기울이십시오.
  9. 유출 관 모두 심방을 낸다. 차가운 1X PBS와 다른 요리에 심실을 전송합니다. 얼음 접시를 놓습니다.
  10. 반복 모든 심실이 검색됩니다 때까지 1.6-1.9 단계를 반복합니다.
제작 "> 2. 심 외막 이식편 문화

참고 : 문화 유리 챔버 슬라이드 또는 다운 스트림 애플리케이션을위한 콜라겐 겔에 하나이 심 외막 외식.

  1. 유리 챔버 슬라이드
    1. 상기 배양 배지를 준비하는 둘 베코 변형 이글 배지 (DMEM)에 10 % 소 태아 혈청 (FBS), 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신이 NG / ml의 재조합 섬유 아세포 성장 인자 2 (FGF2)를 추가한다. 층류 후드의 모든 단계를 수행한다.
    2. 8 잘 챔버의 각 웰에 500 ㎕의 배양 배지를 추가합니다.
    3. 잘의 중심에 각 절제 심실를 놓습니다. 웰의 바닥면 아래로 절개면을 유지하는 심실의 방향.
    4. 조심스럽게 37 ° C, 5 % CO 2 세포 배양 인큐베이터에서 접시를 넣어.
    5. 외식을 준수 할 수 있도록 최소한의 방해와 문화를 유지한다. 심 외막 단분자막의 형성은 48 ~ 72 시간 후에 관찰 할 수있다.
    6. epicard의 차별화평활근 세포 배양을위한 다른 6일 분화 배지에서 단층 세포 외막에 IAL 세포. 상기 분화 배지 DMEM을 준비하고, 10 % FBS, 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신 및 50 ng의 / ml의 재조합 변형 성장 인자 베타 1 (TGF-β1)를 추가한다.
    7. 다른 일에 배양 배지를 변경합니다.
  2. 콜라겐 젤
    1. 제조사의 프로토콜에 따라 상업적 3D 콜라겐 배양 키트를 사용하여 96- 웰 플레이트에서 콜라겐 겔을 준비한다.
    2. 콜라겐 겔의 원하는 부피를 제조 DMEM의 5 배와 피펫 상하로 콜라겐 용액의 적당량을 혼합한다. 이 솔루션은 노란색 설정해야합니다.
    3. 중화 액의 대응 볼륨을 추가로 pipetting 아래로 잘 즉시 섞는다. 이 솔루션은 분홍색으로 바뀝니다.
    4. 피펫 96- 웰 플레이트의 각 웰에이 혼합물을 100 ㎕. 알을 30-60 분 동안 37 ° C, 5 % CO 2 인큐베이터에서 플레이트를 놓고낮은 겔 중합합니다.
    5. 각 웰에 전술 배양 배지 200 μl를 추가합니다.
    6. 잘의 중심에 각 절제 심실를 놓습니다. 동양은 심실은 (실험자에 직면해야 심실의 정점) 콜라겐 젤의 절개면을 아래로 유지합니다. 조심스럽게 다시 세포 배양 인큐베이터에서 접시를 넣어.
    7. 삼일 후, 심실를 제거합니다. 또 다른 2 일간 세포 배양 인큐베이터에 다시 접시를 넣어.
    8. 다른 일에 배양 배지를 변경합니다.

3. 고정 및 시각화

주 : 외막 세포를 유리 슬라이드 챔버 또는 콜라겐 겔 하나에 가시화 될 수있다.

  1. 문화 미디어 대기음하고 세포를 씻어 살균 1X PBS의 동일한 볼륨을 추가합니다.
  2. 세포를 충당하기 위해 충분한 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA)를 추가합니다. 4 ° C에서 10 분 동안 세포를 고정합니다.
  3. PFA를 제거하고 1X PBST (와 1X PBS와 함께 외식을 씻어0.1 % 트리톤 X-100) 세포 Permeabilize 하시려면한다.
  4. 원하는 항체 (예를 들어, 알렉사 플 루어 488 - 팔로이 딘, ZO-1, α-튜 불린과 α - 평활근 액틴)를 발현 사이 7.

결과

이 배양 프로토콜을 사용하여, 주 외막 세포 하류 애플리케이션 고순도로 분리 할 수​​있다. 배양 된 세포는 EMT를 받아야 마이그레이션 및 심 외막 세포가 생체 내에서와 마찬가지로 구별 할 수 있습니다.

우리의 기본 심 외막 세포 배양의 순도를 결정하기 위해, 우리는 Sema3d GFPCre / +에서 발생하...

토론

심장 개발과 재생의 심장 외막의 증가 중요성에 부응하기 위해 심장 외막의 연구를 촉진 기술을 개발하는 것이 중요한 것입니다. 심 외막 문화 시스템은 심 외막 연구에 상당한 이점을 포즈.

심 외막 세포를 분리하는 다른 방법은 형광 활성화 세포 분류 (FACS)를 사용하는 것이다. 이 방법은, 다른 계통에서 외막 세포를 분리하는 외막 마커 (또는 형광 단백질의 심장 외막 세포 ...

공개

The authors declare that they have no competing financial interests.

감사의 말

이 작품은 DUKE-NUS 대학원 의과 대학 싱가포르, Manvendra K. 싱에 총리 재단, 싱가포르 NRF의 교제 (NRF-NRFF2016-01)에서 기금에 의해 지원되었다.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM)Life tech invitrogen 11995065
Penicillin/streptomycin solutionLife tech invitrogen 15140122
Fetal bovine serum (FBS) Life tech invitrogen 10500064
ParaformaldehydeSigmaP6148-5KG
Recombinant fibroblast growth factor 2 (FGF2)PeproTech450-33
Recombinant transforming growth factor beta 1 (TGF-β1)PeproTech100-21
ZO-1 antibodyLife tech invitrogen 40-2200
α-Tubulin antibodySigmaT 6074
α-smooth muscle actin (SMA) antibodySigmaA 2547
Phalloidin antibodyLife tech invitrogen A12379
3D Collagen Culture kit Millipore ECM 675
8-well chamber slideFisher ScientificNNU 154534-PK
Trizol reagentLife Technologies15596-018
ViiA 7 Real-Time PCR SystemLife Technologies4453536
Superscript First Strand Synthesis kitLife Technologies11904-018

참고문헌

  1. Mikawa, T., Fischman, D. A. Retroviral analysis of cardiac morphogenesis: discontinuous formation of coronary vessels. Proc Natl Acad Sci U S A. 89, 9504-9508 (1992).
  2. Mikawa, T., Gourdie, R. G. Pericardial mesoderm generates a population of coronary smooth muscle cells migrating into the heart along with ingrowth of the epicardial organ. Dev Biol. 174, 221-232 (1996).
  3. Manner, J., Perez-Pomares, J. M., Macias, D., Munoz-Chapuli, R. The origin, formation and developmental significance of the epicardium: a review. Cells Tissues Organs. 169, 89-103 (2001).
  4. Gittenberger-de Groot, A. C., Vrancken Peeters, M. P., Mentink, M. M., Gourdie, R. G., Poelmann, R. E. Epicardium-derived cells contribute a novel population to the myocardial wall and the atrioventricular cushions. Circ Res. 82, 1043-1052 (1998).
  5. von Gise, A., Pu, W. T. Endocardial and epicardial epithelial to mesenchymal transitions in heart development and disease. Circ Res. 110, 1628-1645 (2012).
  6. Katz, T. C., et al. Distinct compartments of the proepicardial organ give rise to coronary vascular endothelial cells. Dev Cell. 22, 639-650 (2012).
  7. Singh, M. K., Lu, M. M., Massera, D., Epstein, J. A. MicroRNA-processing enzyme Dicer is required in epicardium for coronary vasculature development. J Biol Chem. 286, 41036-41045 (2011).
  8. Degenhardt, K., Singh, M. K., Epstein, J. A. New approaches under development: cardiovascular embryology applied to heart disease. J Clin Invest. 123, 71-74 (2013).
  9. Singh, M. K., Epstein, J. A. Epicardium-derived cardiac mesenchymal stem cells: expanding the outer limit of heart repair. Circ Res. 110, 904-906 (2012).
  10. Manner, J. Experimental study on the formation of the epicardium in chick embryos. Anat Embryol (Berl). 187, 281-289 (1993).
  11. Manner, J., Schlueter, J., Brand, T. Experimental analyses of the function of the proepicardium using a new microsurgical procedure to induce loss-of-proepicardial-function in chick embryos. Dev Dyn. 233, 1454-1463 (2005).
  12. Pennisi, D. J., Ballard, V. L., Mikawa, T. Epicardium is required for the full rate of myocyte proliferation and levels of expression of myocyte mitogenic factors FGF2 and its receptor, FGFR-1, but not for transmural myocardial patterning in the embryonic chick heart. Dev Dyn. 228, 161-172 (2003).
  13. Gittenberger-de Groot, A. C., Vrancken Peeters, M. P., Bergwerff, M., Mentink, M. M., Poelmann, R. E. Epicardial outgrowth inhibition leads to compensatory mesothelial outflow tract collar and abnormal cardiac septation and coronary formation. Circ Res. 87, 969-971 (2000).
  14. Lavine, K. J., et al. Endocardial and epicardial derived FGF signals regulate myocardial proliferation and differentiation in vivo. Dev Cell. 8, 85-95 (2005).
  15. Merki, E., et al. Epicardial retinoid X receptor alpha is required for myocardial growth and coronary artery formation. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 18455-18460 (2005).
  16. Stuckmann, I., Evans, S., Lassar, A. B. Erythropoietin and retinoic acid, secreted from the epicardium, are required for cardiac myocyte proliferation. Dev Biol. 255, 334-349 (2003).
  17. Huang, G. N., et al. C/EBP transcription factors mediate epicardial activation during heart development and injury. Science. 338, 1599-1603 (2012).
  18. Zhou, B., et al. Adult mouse epicardium modulates myocardial injury by secreting paracrine factors. J Clin Invest. 121, 1894-1904 (2011).
  19. Christoffels, V. M., et al. Tbx18 and the fate of epicardial progenitors. Nature. 458, 8-9 (2009).
  20. Rudat, C., Kispert, A. Wt1 and epicardial fate mapping. Circ Res. 111, 165-169 (2012).
  21. Duim, S. N., Kurakula, K., Goumans, M. J., Kruithof, B. P. Cardiac endothelial cells express Wilms' tumor-1: Wt1 expression in the developing, adult and infarcted heart. J Mol Cell Cardiol. 81, 127-135 (2015).
  22. Iyer, D., et al. Robust derivation of epicardium and its differentiated smooth muscle cell progeny from human pluripotent stem cells. Development. 142, 1528-1541 (2015).
  23. Witty, A. D., et al. Generation of the epicardial lineage from human pluripotent stem cells. Nat Biotechnol. 32, 1026-1035 (2014).

재인쇄 및 허가

JoVE'article의 텍스트 или 그림을 다시 사용하시려면 허가 살펴보기

허가 살펴보기

더 많은 기사 탐색

110ProepicardiumEMT

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

개인 정보 보호

이용 약관

정책

연락처

사서에게 추천하기

JoVE 뉴스레터

연구

교육

저자

사서

JoVE 소개

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. 판권 소유