كشف اللحاء شظايا خلال البكتيرية سبور الإنبات

Summary

Herein, we describe a colorimetric assay to detect the presence of reducing sugars during bacterial spore germination.

Abstract

The process of endospore germination in Clostridium difficile, and other Clostridia, increasingly is being found to differ from the model spore-forming bacterium, Bacillus subtilis. Germination is triggered by small molecule germinants and occurs without the need for macromolecular synthesis. Though differences exist between the mechanisms of spore germination in species of Bacillus and Clostridium, a common requirement is the hydrolysis of the peptidoglycan-like cortex which allows the spore core to swell and rehydrate. After rehydration, metabolism can begin and this, eventually, leads to outgrowth of a vegetative cell. The detection of hydrolyzed cortex fragments during spore germination can be difficult and the modifications to the previously described assays can be confusing or difficult to reproduce. Thus, based on our recent report using this assay, we detail a step-by-step protocol for the colorimetric detection of cortex fragments during bacterial spore germination.

Introduction

الأبواغ هي عملية الأيض أشكال نائمة من البكتيريا التي تسمح للبكتيريا ان تستمر في البيئات غير المواتية. في كثير من البكتيريا المكونة للبوغ، هو فعل تشكيل بوغ بالحرمان من المغذيات ولكن يمكن التحكم في هذه العملية من خلال التغييرات في درجة الحموضة، والتعرض للأكسجين أو ضغوط أخرى ^1. بينما في شكل بوغ نائمة عملية الأيض، والبكتيريا تقاوم الأشعة فوق البنفسجية، جفاف، ارتفاع درجات الحرارة، وتجميد ^2. معظم المعارف على عملية تكاثر يأتي من دراسات في الكائن الحي نموذج، العصوية الرقيقة. تبدأ عملية تبوغ مع تكرار الحمض النووي وتشكيل ^3،4 خيوط المحوري. والحاجز غير المتماثلة ثم يقسم الخلية إلى قسمين الحجم غير متكافئ. مقصورة أكبر، الخلية الأم، يجتاح حجرة صغيرة، وforespore. كل من الخلية الأم وforespore تنسيق التعبير الجيني لانضاج الجراثيم والخلية الأم انحلال في نهاية المطاف، والإفراج عن دورمانر بوغ في البيئة المحيطة ^1.

يتم حفظها هيكل الجراثيم والتكوين عبر العديد من الأنواع البكتيرية. جوهر بوغ يحتوي على نسبة الماء أقل من الخلية النباتية وغنية بحمض dipicolinic (د ب أ) ^1،2. خلال تشكيل بوغ، يتم ضخ DPA في صلب بوغ في مقابل الماء. المحيطة الأساسية هو غشاء بوغ الداخلي حيث، في معظم البكتيريا بوغ تشكيل، والمستقبلات التي تعترف الجزيئات الصغيرة التي تحفز إنبات (germinants) تقع ^2. يقع خارج الغشاء الداخلي للبوغ هو طبقة من ببتيدوغليكان جدار الخلية. وهناك طبقة ببتيدوغليكان المتخصصة (القشرة) تحيط ببتيدوغليكان جدار الخلية وتتكون من العديد من نفس المكونات كما ببتيدوغليكان جدار الخلية [بالتناوب N-اسيتيل (ناغ) وحمض N-acetylmuramic (NAM)]. ومع ذلك، فقد تم تحويل ما يقرب من 50٪ من بقايا حركة عدم الانحياز في القشرة لالموراميك-δ لاكتام ^5،6 . خلال إنبات الجراثيم، يتم التعرف على هذه المخلفات الموراميك-δ لاكتام من قبل بوغ قشرة الانزيمات التحللي (SCLEs)، مما يسمح للقشرة إلى أن يتحلل (وهي عملية ضرورية لإتمام الإنبات) ولكن ليس جدار الخلية. المحيطة القشرة هو الغشاء الخارجي وعدة طبقات من البروتينات معطف ^2.

السيطرة على عملية الإنبات أمرا شديد الأهمية للبكتيريا تشكيل بوغ. يبدأ الإنبات عندما تتفاعل مستقبلات germinant مع germinants كل فيما يخصه ^2. في كثير من البكتيريا المكونة للبوغ، هذه germinants هي الأحماض الأمينية والسكريات، النيوكليوتيدات، أيونات أو خليط منها ^2. C. يبدأ صعب بوغ إنبات عن طريق مزيج من بعض أنواع الحوامض الصفراء، [على سبيل المثال، حمض taurocholic (TA)] والأحماض الأمينية (على سبيل المثال، الجلايسين) ^7-10. على الرغم من وجود اختلافات بين C. العسيرة مسار الإنبات ومسارات درس في البعض تشكيل بوغالبكتيريا، مثل B. الرقيقة، مشتركة بين جميع هو شرط مطلق للحط من القشرة بوغ للسماح للخلية النباتية لتنمو من بذرة نبتت ^2،8. تدهور القشرة يمكن أن يتحقق من قبل SCLEs CwlJ / SleB (كما هو موجود في B. الرقيقة) أو SleC (كما هو موجود في كثير من المطثيات). قشرة المائي يقلل من القيود على جدار الخلية والجراثيم. وهذا يسمح لمعالجة الجفاف الأساسية كاملة، خطوة ضرورية في تنشيط العديد من البروتينات اللازمة لعمليات أيض الخلايا ^2.

عندما تنبت الجراثيم، والتغيرات بوغ نائمة من دولة مرحلة مشرقة لدولة مرحلة مظلمة وهذه العملية يمكن قياس التغير في الكثافة الضوئية (OD) في 600 نانومتر ^11. ويشير التقرير السابق أن جزءا كبيرا من هذا التغيير في التطوير التنظيمي ويرجع ذلك إلى الإفراج عن DPA من بوغ ^12. خلال دراستنا الأخيرة، سعينا لمقارنة توقيت C. صعب بوغ الإنبات ومراقبةالافراج عن الشؤون السياسية والقشرة شظايا ^9. لهذه الدراسة انه من الضروري مراقبة الإفراج عن شظايا القشرة لأنها بدأت سيصدر من قبل الإنبات جراثيم.

واستند الفحص اللونية المستخدمة هنا على طريقة للكشف عن السكريات مع الحد من الغايات وضعت Ghuysen وآخرون. ^13. لأن الآخرين قد وصف بروتوكولات للكشف عن السكريات المختزلة ¹⁴ أو عدلت هذه البروتوكولات ^15، والأدب حول هذا الموضوع يمكن أن يكون مربكا. هنا، ونحن بالتفصيل طريقة خطوة بخطوة للكشف اللونية من السكريات المختزلة تتحرر من الإنبات C. جراثيم صعب. على الرغم من يستخدم هذه الدراسة C. جراثيم صعب، والسكريات المختزلة صدر خلال إنبات الجراثيم من البكتيريا الأخرى لتشكيل بوغ هي قادرة على أن الكشف عن هذا البروتوكول ^9،16،17.

Protocol

1. عينات توليد

1. الحرارة تفعيل C. صعب الجراثيم عند 65 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة وتخزينها على الجليد.
   ملاحظة: C. جراثيم صعب يمكن أن تنتج وتنقيته كما هو موضح سابقا ^7،9،10.
2. إعداد الحل الإنبات في X + 1 مل حيث X هو عدد العينات التي تؤخذ أثناء الفحص.
   ملاحظة: الحل إنبات محددة لأنواع من البكتيريا الجراثيم التي تجري دراستها. لمعايرة C. صعب بوغ الإنبات، استخدمنا حل 10 ملي تريس (7.5 درجة الحموضة)، 150 مم كلوريد الصوديوم، و 100 الجلايسين ملي و 10 ملي حمض taurocholic في الماء منزوع الأيونات.
3. قبل البدء في الفحص، رسم 1.0 مل عينة من الحل إنبات الجراثيم دون أن تكون فارغة للكشف عن القشرة شظية.
4. إضافة الجراثيم إلى OD ₆₀₀ من ~ 3.0 إلى حل الإنبات ودوامة بسرعة.
   ملاحظة: للحصول على الدراسات الإنبات لدينا في B. الرقيقة، استخدمنا نفس OD ₆00 الجراثيم بالنسبة للC. صعب.
   ملاحظة: هذا المبلغ من الجراثيم عملت بشكل جيد للرصد القشرة الافراج عن جزء خلال C. صعب بوغ الإنبات. وينبغي أن تحدد كمية من الجراثيم المستخدمة في هذا الاختبار تجريبيا لكل بكتيريا أو السلالة.
5. إزالة 1.2 مل عينة فورا بعد إضافة الجراثيم وأجهزة الطرد المركزي في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 دقيقة في 14000 × ز. وهذه هي النقطة الساعة الصفر.
6. نقل 1.0 مل من طاف من العينة طرد لأنبوب جديد لتحليل قشرة جزء لاحق.
   ملاحظة: يجب DPA تحتاج إلى رصد، إزالة عينة 100 ميكرولتر منفصلة للكشف عن DPA في الحل باستخدام مقايسة على أساس التيربيوم مضان ^9،18،19.
7. تجميد العينة التي تم جمعها في -80 درجة مئوية.
8. كرر الخطوات من 1.4 و 1.5 على فترات منتظمة حتى الانتهاء من جميع نقاط الوقت.
   ملاحظة: بسبب الوقت اللازم لالطرد المركزي وأخذ العينات، ونقاط وقت أقل عشركان ل2 دقيقة بعيدا يكن من الممكن أثناء إجراء دينا، لذلك كانت فترات أخذ العينات لدينا مرة واحدة كل دقيقة 2 لمدة 14 دقيقة.
9. كما تحكم إيجابية للحد من الكشف عن السكر وتقدير، وتشمل المبالغ التالية N -acetylglucosamine (نانومول): 0، 12.5، 25، 50، 100، 250، 500، و 5،000. إعداد هذه العينات في نفس الوقت الذي عينات القشرة وتشغيل جنبا إلى جنب مع عينات القشرة بحيث منحنى هو معيار ذات الصلة البيانات التي تم إنشاؤها من قبل الإنبات جراثيم.
10. بعد أن يتم جمع كل العينات نقطة زمنية، يجفد العينات.
    ملاحظة: نحن مجفف بالتجميد عينات لدينا في 2 مل أنابيب المسمار الحد الأقصى.

2. قياس اللحاء شظايا

1. و resuspend العينات مجفف بالتجميد في 120 ميكرولتر من 3 N حمض الهيدروكلوريك تستكمل مع الفينول 1٪ و 0.5٪ β-المركابتويثانول.
2. نقل العينات معلق إلى 2 مل أنابيب المسمار الحد الأقصى.
   ملاحظة: للحصول على التكاثر، وضمان معلق كل عينة مجفف بالتجميد ونقل.
<لى> احتضان هذه العينات في حمام مائي إعادة تدوير في درجة حرارة 95 درجة مئوية لمدة 4 ساعات.
3. بعد الحضانة، ووضع العينات على الجليد حتى أنها باردة.
4. تحييد العينات مع 120 ميكرولتر من 3 M هيدروكسيد الصوديوم.
5. إضافة 80 ميكرولتر من محلول بيكربونات الصوديوم المشبعة و 80 ميكرولتر من 5٪ محلول أنهيدريد الخل لكل عينة ودوامة.
6. احتضان العينات في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقيقة.
7. نقل العينات إلى 95 ° C حمام الماء لمدة 3 دقائق بالضبط.
   ملاحظة: هذه الخطوة وقتا طويلا الأوقات الحساسة وأطول يمكن أن يؤثر على نمو إشارة المصب.
8. إزالة عينات من الحمام المائي وتبرد على الجليد.
9. إضافة 400 ميكرولتر من 6.54٪ K ₂ B ₄ O ₇ · 4H ₂ O لكل أنبوب والدوامة.
10. احتضان هذه العينات في حمام مائي إعادة تدوير في درجة حرارة 95 درجة مئوية لمدة 7 دقائق بالضبط.
    ملاحظة: هذه الخطوة وقتا طويلا الأوقات الحساسة وأطول يمكن أن يؤثر على نمو إشارة المصب.
11. إزالةالعينات ومكان على الجليد لمدة 5 دقائق.

3. اللون الكاشف

1. بينما العينات على الجليد (الخطوة 2.12)، وإعداد كاشف اللون. حل 0.320 غرام من ص -dimethylaminobenzaldehyde (DMAB، كاشف إرليخ) في 1.9 مل من حمض الخليك الجليدي.
   ملاحظة: الكاشف الوقت ودرجة الحرارة والضوء حساسة ويجب أن لا يتم مقدما.
2. بعد DMAB يذوب تماما، إضافة 100 ميكرولتر من 10 N حمض الهيدروكلوريك ودوامة.
3. إضافة 5 مل من حمض الخليك الجليدي ودوامة.

4. رد الفعل اللونية

1. نقل 100 ميكرولتر من كل عينة تبرد القشرة إلى أنبوب microcentrifuge 1.5 مل جديد.
2. إضافة 700 ميكرولتر من محلول اللون الطازجة إلى كل عينة.
3. على الفور نقل العينات إلى 37 درجة مئوية الماء حمام واحتضان لمدة 20 دقيقة بالضبط.
4. نقل 200 ميكرولتر من كل عينة إلى لوحة 96-جيدا واضحة.
5. تحديد العينات عند 585 نانومتر على طبق من ذهبقارئ. وينبغي أن تبدأ عينات في اللون الأصفر، وسوف رد فعل إيجابي يتحول إلى اللون الأرجواني. المزيد من القشرة الوقت الحاضر، وعمق اللون الأرجواني.

النتائج

ويبين الجدول 1 نتائج نموذجية باستخدام معايير ناج. وتستخدم البيانات لإنشاء منحنى القياسية. ويبين الجدول 2 النتائج نموذجية من فحص الإنبات في المخزن إنبات تستكمل مع 100 الجلايسين ملي و 10 ملي TA (الظروف المعززة للإنبات) أو 100 الجلايسين مل?...

Discussion

على التحفيز، الجراثيم التي تمر بعملية الإنبات تفقد خصائص مقاومة من دون الحاجة إلى تركيب الجزيئات. عندما يتم تشغيل إنبات الجراثيم، جوهر بوغ النشرات DPA مقابل الماء ^2. نظرا لما يحتويه DPA عالية من الجراثيم نائمة، جوهر بوغ تحت الضغط الاسموزي الشديد وببتيدوغليكان الم...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
2.0 ml screw cap tube	USA scientific	1420-3700
p1000 Eppendorf pipet	Eppendorf
p200 Eppendorf pipet	Eppendorf
p20 Eppendorf pipet	Eppendorf
100 - 1,250 μl pipet tips	VWR	89079-486
1 - 200 μll pipet tips	VWR	89079-458
N-acetyl-D-glucosamine	Sigma	A3286-25G
Hydrochloric Acid - 10 N	BDH-Aristar	BDH3032-3.8LP
Acetic Anhydride	Alfa Aesar	L04295
Sodium Bicarbonate	BDH	BDH0280-500G
Potassium Tetraborate tetrahydrate	Alfa Aesar	39435
Sodium Hydroxide	BDH	BDH8019-500G
4-(Dimethylamino)benzaldehyde	Sigma	156477-100G
Saturated Phenol	Fisher	BP1750-400
2-Mercaptoethanol	Aldrich	M6250-100ML
SpectraMax M3	Molecular Devices
Acetic Acid, Glacial	BDH	BDH3098-3.8LP
Heated, Circulating Water Bath	VWR Scientific	Model 1136
Microtest 96	Falcon	353072	96 well clear tissue culture plates
Culture tubes	VWR	89000-506
Lyophilizer
Heat Blocks
Vortex Machine