JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Herein, we describe a colorimetric assay to detect the presence of reducing sugars during bacterial spore germination.

Аннотация

The process of endospore germination in Clostridium difficile, and other Clostridia, increasingly is being found to differ from the model spore-forming bacterium, Bacillus subtilis. Germination is triggered by small molecule germinants and occurs without the need for macromolecular synthesis. Though differences exist between the mechanisms of spore germination in species of Bacillus and Clostridium, a common requirement is the hydrolysis of the peptidoglycan-like cortex which allows the spore core to swell and rehydrate. After rehydration, metabolism can begin and this, eventually, leads to outgrowth of a vegetative cell. The detection of hydrolyzed cortex fragments during spore germination can be difficult and the modifications to the previously described assays can be confusing or difficult to reproduce. Thus, based on our recent report using this assay, we detail a step-by-step protocol for the colorimetric detection of cortex fragments during bacterial spore germination.

Введение

Эндоспоры метаболически покоящиеся формы бактерий, которые позволяют бактериям сохраняться в неблагоприятных условиях. Во многих спорообразующих бактерий, образование спор индуцируется недостатка питательных веществ , но этот процесс может контролироваться изменением до рН, воздействия кислорода или других напряжений 1. В то время как в их метаболически латентной форме спор, бактерий противостоять УФ - излучения, высушивание, более высокие температуры и заморозки 2. Большая часть знаний о процессе спорообразования исходит из исследований в модели организма, Сенная палочка. Процесс спорообразования начинается процесс репликации ДНК и образованием осевого 3,4 нити. Асимметричным перегородку затем делит клетку на две неравные размерных отсеков. Чем больше отсек, материнская клетка, поглотит меньший отсек, в forespore. И мать клетки и forespore координируют экспрессию генов созревать спору и материнской клетки в конечном итоге лизирует, выпустив Дормант Спора в окружающую среду 1.

Структура и состав спорово сохраняется во многих видов бактерий. Ядро Спора имеет более низкое содержание воды , чем в растительной клетке , и богата дипиколиновая кислоты (ДПА) 1,2. Во время образования спор ДПА перекачивается в активную зону споровой в обмен на воду. Вокруг ядра является внутренняя мембрана Спора , где в большинстве спорообразующих бактерий, рецепторы , которые распознают небольшие молекулы , которые стимулируют прорастание (germinants) расположены 2. Расположенный в непосредственной близости внутренней мембраны Спора представляет собой слой пептидогликана клеточной стенки. Специализированный пептидогликана слой (кора головного мозга) окружает клеточной стенки пептидогликана и состоит из многих из тех же компонентов, как клеточной стенки пептидогликана [чередующимися N-ацетилглюкозамина (NAG) и N-ацетилмурамовой кислоты (NAM)]. Тем не менее, примерно 50% остатков NAM в коре, были преобразованы в мурамовой-б-лактамные 5,6 . Во время прорастания спор, эти мурамовой-δ-лактамные остатки признаются спорово коры головного мозга литических ферментов (SCLEs), что позволяет кортекс деградировать (процесс существенный для завершения прорастание), но не клеточную стенку. Вокруг коры головного мозга является наружной мембраны и несколько слоев белков оболочки 2.

Управление процессом прорастания является критически важным для спорообразующих бактерий. Всхожесть инициируется , когда germinant рецепторы взаимодействуют с соответствующими germinants 2. Во многих спорообразующих бактерий, эти germinants являются аминокислоты, сахара, нуклеотиды, ионы или их комбинации 2. С. несговорчивый прорастание спор инициируется комбинаций определенных желчных кислот, [например, таурохолевая кислота (TA)] и аминокислот (например, глицина) 7-10. Хотя существуют различия между С. несговорчивый прорастание пути и пути изученных в других спорообразующихбактерии, такие как B. Сенная, общим для всех является абсолютным требованием , чтобы ухудшить спорами кору головного мозга , чтобы позволить вегетативные клетки расти из проросших спор 2,8. Деградация Cortex может быть достигнуто с помощью SCLEs CwlJ / SleB (как найдено в B. Сенная) или SLEC (например, во многих клостридий). гидролиз Cortex уменьшает ограничение на клеточной стенке и спорами. Это позволяет полный основной регидратации, необходимый шаг в реактивации многие из белков , необходимых для клеточного метаболизма 2.

Когда споры прорастают, недействующие изменения споровые из состояния фазы яркий в состояние фазы темноте, и этот процесс может быть измерено по изменению оптической плотности (OD) при 600 нм 11. В предыдущем докладе говорится , что большая часть этого изменения в ОД связано с выходом ДПА из спору 12. Во время нашего недавнего исследования, мы стремились сравнить сроки C. несговорчивый Прорастание спор и отслеживаетсявыпуск DPA и фрагментов коры головного мозга 9. Для этого исследования было важно контролировать выделение фрагментов коры головного мозга, когда они начали быть освобождены прорастающих спор.

Колориметрический анализ , используемый здесь был основан на методе обнаружения сахаров с отрезными концами разработаны Ghuysen и др. 13. Так как другие описали протоколы для обнаружения восстанавливающих сахаров 14 или модифицировали эти протоколы 15, литература по этому вопросу может привести к путанице. Здесь мы подробно метод шаг за шагом для колориметрического обнаружения восстанавливающих сахаров , освобожденной от прорастающих C. несговорчивый спорами. Хотя это исследование использует C. несговорчивый споры, восстанавливающие сахара , выделяющиеся во время прорастания спор из других спорообразующих бактерий могут быть обнаружены с этим протоколом 9,16,17.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

1. Генерирование Образцы

  1. Тепло активировать C. несговорчивый споры при 65 ° С в течение 30 мин и хранить на льду.
    Примечание: C. Споры несговорчивый могут быть получены и очищены , как описано ранее 7,9,10.
  2. Приготовьте раствор всхожесть на X + 1 мл, где Х обозначает число выборок, которые необходимо принять во время теста.
    Примечание: Решение прорастание является специфическим для Spore изучаемые виды бактерий. Для опробования C. несговорчивый Прорастание спор, мы использовали раствор 10 мМ Трис (рН 7,5), 150 мМ NaCl, 100 мМ глицин и 10 мМ таурохолевая кислоты в деионизированной воде.
  3. Перед началом теста, рисовать 1,0 мл пробу раствора для проращивания без спор, чтобы служить в качестве заготовки для обнаружения фрагмента коры головного мозга.
  4. Добавить спор на OD 600 из ~ 3,0 до раствора для проращивания и вихря быстро.
    Примечание: Для наших исследований в всхожести B. Сенная, мы использовали тот же OD 600 Споры , как для C. несговорчивый.
    Примечание: Это количество спор хорошо работает для мониторинга фрагмента коры головного мозга во время высвобождения C. несговорчивый прорастание спор. Количество спор, используемый в этом тесте должны быть определены экспериментально для каждой бактерии или штамма.
  5. Удаление 1,2 мл образца сразу же после добавления спорами и центрифугировать при комнатной температуре в течение 1 мин при 14000 & bull; g. Это точка нулевое время.
  6. Передача 1,0 мл надосадочной жидкости из центрифугированной пробы в свежую пробирку для последующего анализа фрагментов коры головного мозга.
    Примечание: Если ДПА необходимо контролировать, удалить отдельную пробу объемом 100 мкл для выявления ДПВ в растворе с использованием анализа , основанного на тербия флуоресценции 9,18,19.
  7. Замораживание собранного образца при температуре -80 ° С.
  8. Повторите шаги 1.4 и 1.5 через регулярные промежутки времени, пока все моменты времени не завершено.
    Примечание: Из-за времени, необходимого для центрифугирования и отбора проб, моменты времени меньше йAn 2 мин друг от друга не было возможно во время нашей процедуры, так что наши интервалы выборки были один раз каждые 2 мин в течение 14 мин.
  9. В качестве положительного контроля для снижения сахара обнаружения и количественной оценки, включают в себя следующие суммы N -acetylglucosamine (нмоль): 0, 12,5, 25, 50, 100, 250, 500 и 5000. Подготовка этих образцов в то же время как образцы коры головного мозга и работать вместе с образцами коры головного мозга таким образом, что стандартная кривая имеет отношение к данным, генерируемых прорастающих спор.
  10. После того, как все образцы временной точки собраны, лиофилизации образцы.
    Примечание: Мы лиофилизировали наши образцы в 2 мл завинчивающейся крышкой трубки.

2. Измерение Cortex Фрагменты

  1. Ресуспендируют лиофилизированных образцов в 120 мкл 3 N HCl с добавлением 1% фенола и 0,5% бета-меркаптоэтанол.
  2. Передача ресуспендировали образцов в 2-мл завинчивающейся крышкой трубки.
    Примечание: Для воспроизводимости, обеспечить все Лиофилизированный образец вновь суспендируют и передан.
  3. Инкубируйте образцы на водяной бане рециркуляционным при 95 ° С в течение 4 часов.
  4. После инкубации поместите образцы на льду, пока они не остыли.
  5. Нейтрализовать образцы с 120 мкл 3 М NaOH.
  6. Добавляют 80 мкл насыщенного раствора бикарбоната натрия и 80 мкл 5% -ного раствора ангидрида уксусной кислоты в каждом образце и вихря.
  7. Инкубируйте образцы при комнатной температуре в течение 10 мин.
  8. Передача образцов обратно в C водяной бане 95 ° в течение ровно 3 мин.
    Примечание: Этот шаг является чувствительным ко времени и более длительное время может повлиять на развитие нисходящего сигнала.
  9. Удалить образцы из водяной бани и охлаждают на льду.
  10. Добавить 400 мкл 6,54% K 2 B 4 O 7 · 4H 2 O в каждую пробирку и вихря.
  11. Инкубируйте образцы на водяной бане рециркуляционным при 95 ° С в течение ровно 7 мин.
    Примечание: Этот шаг является чувствительным ко времени и более длительное время может повлиять на развитие нисходящего сигнала.
  12. Удалитьобразцы и место на льду в течение 5 мин.

3. Цвет Реагент

  1. В то время как образцы на льду (шаг 2,12), подготовить реагент цвета. Растворите 0,320 г р -dimethylaminobenzaldehyde (КСППР; реагента Эрлиха) в 1,9 мл ледяной уксусной кислоты.
    Примечание: Реагент время, температура и чувствительна к свету и не должны быть сделаны заранее.
  2. После того, как КСППР полностью растворяется, добавляют 100 мкл 10 N HCl и вихря.
  3. Добавляют 5 мл ледяной уксусной кислоты и вихря.

4. колориметрической реакции

  1. Передача 100 мкл каждого образца охлажденный кортекса к новой 1,5 мл микроцентрифужных трубки.
  2. Добавьте 700 мкл свежеприготовленного раствора цвета для каждого образца.
  3. Немедленно передать образцы на C водяной бане при 37 ° и инкубировать в течение 20 мин ТОЧНО.
  4. Перенести 200 мкл каждого образца в виде прозрачного 96-луночного планшета.
  5. Количественно образцов при 585 нм на пластинечитатель. Образцы должны начинаться в желтый цвет и положительная реакция будет переходить на фиолетовый. Чем больше коры головного мозга присутствует, тем глубже фиолетовый цвет.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

В таблице 1 приведены типичные результаты с использованием стандартов Nag. Данные используются для получения стандартной кривой. В таблице 2 представлены типичные результаты анализа на всхожесть всхожесть буфере с добавлением 100 мМ 10 мМ TA (всхожесть у...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

При стимуляции, спорами происходит процесс прорастания теряют свои свойства сопротивления без необходимости синтеза макромолекул. Когда спор прорастание срабатывает, ядро Спора выпускает DPA в обмен на воду 2. Из - за высокого содержания DPA неактивного споровых, ядро Спора под сил?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Раскрытие информации

The authors have nothing to disclose.

Благодарности

Проект описывается при поддержке премии Номер 5R01AI116895 из Национального института аллергии и инфекционных заболеваний. Содержание исключительно ответственности авторов и не обязательно отражает официальную точку зрения Национального института аллергии и инфекционных заболеваний или Национального института здоровья.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
2.0 ml screw cap tubeUSA scientific1420-3700
p1000 Eppendorf pipetEppendorf
p200 Eppendorf pipetEppendorf
p20 Eppendorf pipetEppendorf
100 - 1,250 μl pipet tipsVWR89079-486
1 - 200 μll pipet tipsVWR89079-458
N-acetyl-D-glucosamineSigmaA3286-25G
Hydrochloric Acid - 10 NBDH-AristarBDH3032-3.8LP
Acetic AnhydrideAlfa AesarL04295
Sodium BicarbonateBDHBDH0280-500G
Potassium Tetraborate tetrahydrateAlfa Aesar39435
Sodium HydroxideBDHBDH8019-500G
4-(Dimethylamino)benzaldehydeSigma156477-100G
Saturated PhenolFisherBP1750-400
2-MercaptoethanolAldrichM6250-100ML
SpectraMax M3Molecular Devices
Acetic Acid, GlacialBDHBDH3098-3.8LP
Heated, Circulating Water BathVWR ScientificModel 1136
Microtest 96Falcon35307296 well clear tissue culture plates
Culture tubesVWR89000-506
Lyophilizer
Heat Blocks
Vortex Machine

Ссылки

  1. Al-Hinai, M. A., Jones, S. W., Papoutsakis, E. T. The Clostridium sporulation programs: diversity and preservation of endospore differentiation. Microbiol Mol Biol Rev. 79, 19-37 (2015).
  2. Setlow, P. Germination of spores of Bacillus species: what we know and do not know. J Bacteriol. 196, 1297-1305 (2014).
  3. Tan, I. S., Ramamurthi, K. S. Spore formation in Bacillus subtilis. Environ Microbiol Rep. 6, 212-225 (2014).
  4. Fimlaid, K. A., Shen, A. Diverse mechanisms regulate sporulation sigma factor activity in the Firmicutes. Curr Opin Microbiol. 24, 88-95 (2015).
  5. Popham, D. L., Helin, J., Costello, C. E., Setlow, P. Analysis of the peptidoglycan structure of Bacillus subtilis endospores. J Bacteriol. 178, 6451-6458 (1996).
  6. Atrih, A., Zollner, P., Allmaier, G., Foster, S. J. Structural analysis of Bacillus subtilis 168 endospore peptidoglycan and its role during differentiation. J Bacteriol. 178, 6173-6183 (1996).
  7. Sorg, J. A., Sonenshein, A. L. Bile salts and glycine as cogerminants for Clostridium difficile spores. J. Bacteriol. 190, 2505-2512 (2008).
  8. Paredes-Sabja, D., Shen, A., Sorg, J. A. Clostridium difficile spore biology: sporulation, germination, and spore structural proteins. Trends Microbiol. 22 (7), (2014).
  9. Francis, M. B., Allen, C. A., Sorg, J. A. Spore cortex hydrolysis precedes DPA release during Clostridium difficile spore germination. J Bacteriol. 197 (14), (2015).
  10. Francis, M. B., Allen, C. A., Shrestha, R., Sorg, J. A. Bile acid recognition by the Clostridium difficile Germinant Receptor, CspC, is important for establishing infection. PLoS Pathog. 9, e1003356(2013).
  11. Moir, A., Smith, D. A. The Genetics of bacterial spore germination. Annu. Rev. Microbiol. 44, 531-553 (1990).
  12. Zhang, P., Kong, L., Wang, G., Setlow, P., Li, Y. Q. Combination of Raman tweezers and quantitative differential interference contrast microscopy for measurement of dynamics and heterogeneity during the germination of individual bacterial spores. Journal of biomedical optics. 15, 056010(2010).
  13. Ghuysen, J. -M., Tipper, D. J., Strominger, J. L. Enzymes that degrade bacterial cell walls. Methods Enzymol. 8, 685-699 (1966).
  14. Park, J. T., Johnson, M. J. A submicrodetermination of glucose. J Biol Chem. 181, 149-151 (1949).
  15. Thompson, J. S., Shockman, G. D. A modification of the Park and Johnson reducing sugar determination suitable for the assay of insoluble materials: its application to bacterial cell walls. Anal Biochem. 22, 260-268 (1968).
  16. Paredes-Sabja, D., Setlow, P., Sarker, M. R. SleC is essential for cortex peptidoglycan hydrolysis during germination of spores of the pathogenic bacterium Clostridium perfringens. J Bacteriol. 191, 2711-2720 (2009).
  17. Paredes-Sabja, D., Sarker, M. R. Effect of the cortex-lytic enzyme SleC from non-food-borne Clostridium perfringens on the germination properties of SleC-lacking spores of a food poisoning isolate. Can J Microbiol. 56, 952-958 (2010).
  18. Hindle, A. A., Hall, E. A. Dipicolinic acid (DPA) assay revisited and appraised for spore detection. The Analyst. 124, 1599-1604 (1999).
  19. Kort, R., et al. Assessment of heat resistance of bacterial spores from food product isolates by fluorescence monitoring of dipicolinic acid release. Appl Environ Microbiol. 71, 3556-3564 (2005).
  20. Elson, L. A., Morgan, W. T. A colorimetric method for the determination of glucosamine and chondrosamine. The Biochemical journal. 27, 1824-1828 (1933).
  21. Ramirez, N., Abel-Santos, E. Requirements for germination of Clostridium sordellii spores in vitro. J. Bacteriol. 192, 418-425 (2010).
  22. Akoachere, M., et al. Indentification of an in vivo inhibitor of Bacillus anthracis spore germination. J. Biol. Chem. 282, 12112-12118 (2007).
  23. Duncan, C. L., Strong, D. H. Improved medium for sporulation of Clostridium perfringens. Appl Microbiol. 16, 82-89 (1968).
  24. Heffron, J. D., Lambert, E. A., Sherry, N., Popham, D. L. Contributions of four cortex lytic enzymes to germination of Bacillus anthracis spores. J Bacteriol. 192, 763-770 (2010).
  25. Meador-Parton, J., Popham, D. L. Structural analysis of Bacillus subtilis spore peptidoglycan during sporulation. J Bacteriol. 182, 4491-4499 (2000).
  26. Lambert, E. A., Popham, D. L. The Bacillus anthracis SleL (YaaH) protein is an N-acetylglucosaminidase involved in spore cortex depolymerization. J Bacteriol. 190, 7601-7607 (2008).
  27. Wang, S., Shen, A., Setlow, P., Li, Y. Q. Characterization of the Dynamic Germination of Individual Clostridium difficile Spores Using Raman Spectroscopy and Differential Interference Contrast Microscopy. J Bacteriol. 197, 2361-2373 (2015).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

112N

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены