Erkennen Cortex Fragmente während der bakteriellen Sporenauskeimung

Zusammenfassung

Herein, we describe a colorimetric assay to detect the presence of reducing sugars during bacterial spore germination.

Zusammenfassung

The process of endospore germination in Clostridium difficile, and other Clostridia, increasingly is being found to differ from the model spore-forming bacterium, Bacillus subtilis. Germination is triggered by small molecule germinants and occurs without the need for macromolecular synthesis. Though differences exist between the mechanisms of spore germination in species of Bacillus and Clostridium, a common requirement is the hydrolysis of the peptidoglycan-like cortex which allows the spore core to swell and rehydrate. After rehydration, metabolism can begin and this, eventually, leads to outgrowth of a vegetative cell. The detection of hydrolyzed cortex fragments during spore germination can be difficult and the modifications to the previously described assays can be confusing or difficult to reproduce. Thus, based on our recent report using this assay, we detail a step-by-step protocol for the colorimetric detection of cortex fragments during bacterial spore germination.

Einleitung

Endospores metabolisch ruhenden Formen von Bakterien, die Bakterien erlauben, in ungünstigen Umgebungen zu bestehen. In vielen sporenbildenden Bakterien, wird die Sporenbildung von Nährstoffmangel induziert aber dieser Prozess kann ¹ durch Änderungen der pH - Wert, der Exposition gegenüber Sauerstoff oder anderen Spannungen gesteuert werden. Während in ihrer metabolisch ruhenden Sporenform, wider Bakterien UV - Strahlung, Austrocknung, höhere Temperaturen und Einfrieren ^2. Der größte Teil des Wissens über die Sporulation Prozess stammt aus Studien im Modellorganismus Bacillus subtilis. Die Sporulation Prozess beginnt mit der DNA - Replikation und die Bildung eines axialen Glühfaden ^3,4. Eine asymmetrische Septum teilt sich dann die Zelle in zwei ungleich große Fächer. Die größere Kammer, die Mutterzelle, verschlingt die kleinere Kammer, die forespore. Sowohl die Mutterzelle und forespore Genexpression koordinieren, um die Sporen und die Mutterzelle zu reifen schließlich lysiert, die Freigabe der dormant Sporen in die Umgebung ^1.

Die Sporen Struktur und Zusammensetzung ist in vielen Bakterienarten konserviert. Die Spore Kern hat einen geringeren Wassergehalt als die vegetative Zelle und ist reich mit Dipicolinsäure (DPA) ^1,2. Während die Sporenbildung wird DPA in die Spore Kern im Austausch für Wasser gepumpt. Den Kern umgibt , ist eine innere Membran sporen wo in den meisten sporenbildenden Bakterien, die Rezeptoren , die die kleinen Moleküle erkennen , die Keimung (Keimungsmittel) stimulieren ² befindet. Das Hotel liegt etwas außerhalb der inneren Membran der Spore ist eine Schicht aus Zellwandpeptidoglycan. Eine spezialisierte Peptidoglycan Schicht (Cortex) umgibt die Peptidoglycan-Zellwand und viele der gleichen Komponenten wie Zellwandpeptidoglycan [alternierende N-Acetylglucosamin (NAG) und N-Acetylmuraminsäure (NAM)] zusammengesetzt ist. Jedoch etwa 50% der NAM - Reste in der Hirnrinde haben muramic-δ-lactam ^5,6 umgewandelt . Während der Sporenkeimung, diese muramic-δ-Lactam-Reste werden durch die Sporenrinde lytische Enzyme (SCLEs) erkannt, so dass die Rinde ermöglicht abgebaut werden (ein Prozess wesentlich Keimung abzuschließen), aber nicht die Zellwand. Die Rinde umgibt , ist eine äußere Membran und mehrere Schichten von Hüllproteinen ^2.

den Prozess der Keimung Steuerung ist von entscheidender Bedeutung für die sporenbildende Bakterien. Die Keimung wird eingeleitet , wenn Keimungsinduktor Rezeptoren interagieren mit ihren jeweiligen Keimungsmittel ^2. In vielen sporenbildende Bakterien sind diese Keimungsmittel Aminosäuren, Zucker, Nukleotide, Ionen oder Kombinationen davon . ² C. difficile Sporenkeimung durch Kombinationen bestimmter Gallensäuren, [zB Taurocholsäure (TA)] und Aminosäuren (beispielsweise Glycin) ^7-10 eingeleitet. Obwohl es Unterschiede zwischen der C. difficile Keimung Weg und die untersuchten Wege in andere sporenbildendeBakterien, wie B. subtilis, allen gemeinsam ist die absolute Notwendigkeit der Spore Kortex abzubauen eine vegetative Zelle zu ermöglichen , von der gekeimten Spore ^2,8 zu wachsen. Cortex Abbau kann durch die SCLEs CwlJ / SLEB erreicht werden oder SLEC (wie in B. subtilis gefunden) (wie in vielen Clostridia gefunden). Cortex Hydrolyse verringert die Beschränkung der Zellwand und der Spore. Dies ermöglicht eine volle Kern Rehydratisierung notwendiger Schritt in ² viele der Proteine ​​, die für den Zellstoffwechsel zu reaktivieren.

Wenn Sporen keimen, die ruhende Sporen ändert sich von einem phasen hellen Zustand in einen Phase-Dunkel-Zustand und dieser Prozess kann durch eine Veränderung der optischen Dichte (OD) bei 600 zu messen nm ^11. Ein früherer Bericht legt nahe , dass ein großer Teil dieser Änderung in der OD auf die Freisetzung von DPA aus der Spore ¹² zurückzuführen ist. Während unserer Studie haben wir versucht , den Zeitpunkt C zu vergleichen difficile Sporenkeimung und überwacht dieFreisetzung von DPA und Cortex - Fragmente ^9. Für diese Studie war es wichtig, die Freisetzung von Cortex-Fragmente zu überwachen, wie sie begann von keimen Sporen freigesetzt werden.

Die kolorimetrischen Test hier verwendet wurde , basiert auf einem Verfahren zur Bereitstellung von Zuckern mit reduzierenden Enden entwickelt Ghuysen et al erfasst wird . ^13. Weil andere ¹⁴ - Protokolle zum Nachweis von reduzierenden Zuckern beschrieben haben oder diese Protokolle ¹⁵ modifiziert, kann die Literatur zu diesem Thema verwirrend sein. Hier stellen wir ausführlich die Schritt- für -Schritt - Verfahren zur kolorimetrischen Detektion von Zuckern befreit keimen C. Reduktions difficile - Sporen. Obwohl diese Studie verwendet C. difficile - Sporen sind die reduzierenden Zucker während der Keimung von Sporen von anderen sporenbildenden Bakterien freigesetzt können mit diesem Protokoll ^9,16,17 erkannt werden.

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Protokoll

1. Erstellen von Proben

1. Wärme aktivieren C. difficile Sporen bei 65 ° C für 30 min und auf Eis lagern.
   Hinweis: C. difficile - Sporen hergestellt und gereinigt werden , wie zuvor beschrieben , ^7,9,10.
2. Bereiten Sie die Keimung Lösung bei X + 1 ml, wobei X die Anzahl der Abtastwerte ist, die während des Assays entnommen werden.
   Anmerkung: Die Keimlösung ist spezifisch für die Spezies von Bakterien untersucht-Sporen werden. Für C. Testen difficile Sporenkeimung, verwendeten wir eine Lösung von 10 mM Tris (pH 7,5), 150 mM NaCl, 100 mM Glycin und 10 mM Taurocholsäure in deionisiertem Wasser.
3. Vor der Durchführung des Tests, ziehen eine 1,0 ml Probe der Keimungslösung ohne Sporen als Rohling für Cortex-Fragment Erkennung dienen.
4. Hinzufügen Sporen zu einer OD ₆₀₀ von ~ 3,0 auf die Keimung Lösung und vortex schnell.
   Hinweis: Für unsere Keimung Studien in B. subtilis, wir haben das gleiche OD ₆00 Sporen als für C. difficile.
   Hinweis: Diese Menge an Sporen funktionierte gut für die Überwachung der Hirnrinde Fragment während C. difficile Spore Keimung. Die Menge von Sporen in diesem Assay verwendet wird, sollte experimentell für jedes Bakterium oder Belastung bestimmt werden.
5. Entfernen, um eine 1,2 ml Probe unmittelbar nach der Sporen Zugabe und Zentrifuge bei Raumtemperatur für 1 min bei 14.000 × g. Dies ist der Zeitpunkt Null.
6. Übertragen 1,0 ml des Überstands aus der zentrifugierten Probe in ein frisches Röhrchen zur anschließenden cortex Fragmentanalyse.
   Hinweis: Sollte DPA muss überwacht werden, eine separate 100 ul - Probe zum Nachweis von DPA in der Lösung zu entfernen unter Verwendung eines Assays auf Basis von Terbium - Fluoreszenz ^9,18,19.
7. Fixieren Sie die gesammelte Probe bei -80 ° C.
8. Wiederholen Sie die Schritte 1.4 und 1.5 in regelmäßigen Abständen, bis alle Zeitpunkte abgeschlossen.
   Hinweis: Da der Zeitaufwand für die Zentrifugation und Probenentnahmen, Zeitpunkte weniger thein 2 min waren abgesehen nicht möglich während unseres Verfahrens, so dass unsere Abtastintervallen waren einmal alle 2 min für 14 min.
9. Als Positivkontrolle für Zucker Nachweis und die Quantifizierung Verringerung umfassen die folgenden Mengen an N Acetylglucosamin (nmol): 0, 12,5, 25, 50, 100, 250, 500 und 5.000. Bereiten Sie diese Proben in der gleichen Zeit wie Cortex Proben und führen zusammen mit den Cortex-Proben, so dass die Standard-Kurve an die Daten relevant sind, erzeugt durch Sporen keimen.
10. Nachdem alle Zeitpunkt Proben gesammelt werden, lyophilisieren die Proben.
    Anmerkung: Wir gefriergetrocknet, unsere Proben in 2 ml mit Schraubverschluss Röhrchen.

2. Messung Cortex Fragmente

1. lyophilisierte Proben in 120 ul 3 N HCl supplementiert mit 1% Phenol und 0,5% β-Mercaptoethanol resuspendieren.
2. Übertragen Sie die resuspendierten Proben auf 2 ml mit Schraubverschluss Röhrchen.
   Hinweis: Für die Reproduzierbarkeit, sicherzustellen, dass alle die gefriergetrocknete Probe suspendiert und übertragen wird.
3. Inkubieren der Proben in einem Umlaufwasserbad bei 95 ° C für 4 Stunden.
4. Nach der Inkubation, legen Sie die Proben auf Eis, bis sie kühl sind.
5. Neutralisieren der Proben mit 120 ul 3 M NaOH.
6. Hinzufügen, 80 ul einer gesättigten Natriumhydrogencarbonat-Lösung und 80 ul einer 5% Essigsäureanhydrid-Lösung zu jeder Probe und vortexen.
7. Inkubieren der Proben bei Raumtemperatur für 10 min.
8. Übertragen Sie die Proben zurück zu dem 95 ° C warmen Wasserbad für genau 3 min.
   Hinweis: Dieser Schritt ist zeitkritisch und längere Zeiten nachgeschaltete Signalentwicklung beeinflussen können.
9. Entfernen Proben aus dem Wasserbad und kühlen auf Eis.
10. In 400 ul 6,54% K ₂ B ₄ O ₇ · 4H ₂ O in jedes Röhrchen und Wirbel.
11. Inkubieren der Proben in einem Umlaufwasserbad bei 95 ° C für genau 7 min.
    Hinweis: Dieser Schritt ist zeitkritisch und längere Zeiten nachgeschaltete Signalentwicklung beeinflussen können.
12. Entfernendie Proben und auf Eis für 5 min.

3. Farbreagenz

1. Während Proben auf Eis (Schritt 2.12) sind, bereiten Sie das Farbreagenz. Man löst 0,320 g p -dimethylaminobenzaldehyde (DMAB; Ehrlich-Reagens) in 1,9 ml Eisessig.
   Hinweis: Das Reagenz ist Zeit, Temperatur und lichtempfindlich und sollte nicht im Voraus gemacht werden.
2. Nachdem der DMAB vollständig auflöst, 100 ul 10 N HCl und Wirbel.
3. 5 ml Eisessig und Wirbel.

4. kolorimetrische Reaktion

1. Transfer 100 ul jeder gekühlten Kortex Probe in ein neues 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen.
2. In 700 ul der frisch zubereiteten Farblösung zu jeder Probe.
3. Unmittelbar übertragen Sie die Proben auf einem 37 ° C Wasserbad und für genau 20 min inkubiert.
4. Übertragen Sie 200 ul jeder Probe auf eine klare 96-Well-Platte.
5. Quantifizierung der Proben bei 585 nm auf einer PlatteLeser. Die Proben sollten bei einer gelben Farbe und eine positive Reaktion auf lila verschiebt starten. Je mehr Hirnrinde vorhanden ist, desto tiefer die violette Farbe.

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Ergebnisse

Tabelle 1 zeigt typische Ergebnisse mit NAG - Standards. Daten verwendet werden , um eine Standardkurve zu erzeugen. Die Tabelle 2 zeigt typische Ergebnisse von einem Keimungsassay in Keimung Puffer , ergänzt mit 100 mM Glycin und 10 mM TA (Keimung fördernden Bedingungen) oder 100 mM Glycin allein (nicht-keimende Bedingungen). In Abwesenheit von TA, C. difficile - Sporen keimen nicht , und es gibt wenig Änderung in Gegenwart von cortex Fragme...

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Diskussion

Nach Stimulation unterzogen Sporen den Prozess der Keimung verlieren ihre Beständigkeitseigenschaften ohne die Notwendigkeit einer makromolekularen Synthese. Wenn Sporenauskeimung ausgelöst wird, ² die Spore Kern freigibt DPA im Austausch für Wasser. Aufgrund der hohen DPA - Gehalt der ruhenden Spore, die sporen Kern unter intensiver osmotischen Druck und dem Fach Peptidoglycan, Hirnrinde, hilft durch Einwirken vermutlich als Barriere für Expansions ² den Kern aufquellen verhindern.

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
2.0 ml screw cap tube	USA scientific	1420-3700
p1000 Eppendorf pipet	Eppendorf
p200 Eppendorf pipet	Eppendorf
p20 Eppendorf pipet	Eppendorf
100 - 1,250 μl pipet tips	VWR	89079-486
1 - 200 μll pipet tips	VWR	89079-458
N-acetyl-D-glucosamine	Sigma	A3286-25G
Hydrochloric Acid - 10 N	BDH-Aristar	BDH3032-3.8LP
Acetic Anhydride	Alfa Aesar	L04295
Sodium Bicarbonate	BDH	BDH0280-500G
Potassium Tetraborate tetrahydrate	Alfa Aesar	39435
Sodium Hydroxide	BDH	BDH8019-500G
4-(Dimethylamino)benzaldehyde	Sigma	156477-100G
Saturated Phenol	Fisher	BP1750-400
2-Mercaptoethanol	Aldrich	M6250-100ML
SpectraMax M3	Molecular Devices
Acetic Acid, Glacial	BDH	BDH3098-3.8LP
Heated, Circulating Water Bath	VWR Scientific	Model 1136
Microtest 96	Falcon	353072	96 well clear tissue culture plates
Culture tubes	VWR	89000-506
Lyophilizer
Heat Blocks
Vortex Machine