La detección de la corteza Fragmentos Durante la germinación de esporas bacterianas

Resumen

Herein, we describe a colorimetric assay to detect the presence of reducing sugars during bacterial spore germination.

Resumen

The process of endospore germination in Clostridium difficile, and other Clostridia, increasingly is being found to differ from the model spore-forming bacterium, Bacillus subtilis. Germination is triggered by small molecule germinants and occurs without the need for macromolecular synthesis. Though differences exist between the mechanisms of spore germination in species of Bacillus and Clostridium, a common requirement is the hydrolysis of the peptidoglycan-like cortex which allows the spore core to swell and rehydrate. After rehydration, metabolism can begin and this, eventually, leads to outgrowth of a vegetative cell. The detection of hydrolyzed cortex fragments during spore germination can be difficult and the modifications to the previously described assays can be confusing or difficult to reproduce. Thus, based on our recent report using this assay, we detail a step-by-step protocol for the colorimetric detection of cortex fragments during bacterial spore germination.

Introducción

Las endosporas son metabólicamente inactivos formas de bacterias que permiten a las bacterias persisten en ambientes desfavorables. En muchas bacterias formadoras de esporas, la formación de esporas es inducida por la privación de nutrientes, pero este proceso puede ser controlado por los cambios en pH, la exposición a oxígeno o otros factores de estrés ^1. Si bien en su forma de esporas metabólicamente inactivos, las bacterias se resisten a la radiación UV, desecación, temperaturas más altas, y la congelación de ^2. La mayor parte del conocimiento sobre el proceso de esporulación proviene de estudios en el organismo modelo, Bacillus subtilis. El proceso de esporulación comienza con la replicación del ADN y la formación de un ^3,4 filamento axial. Un tabique asimétrico luego se divide la célula en dos compartimientos de tamaño desigual. El compartimiento más grande, la célula madre, envuelve el compartimento más pequeño, el preespora. Tanto la célula madre y preespora coordinar la expresión de genes para madurar la espora y la célula madre, finalmente, lisa, de soltar el Dormant de esporas en el medio ambiente que rodea ^1.

La estructura y composición de esporas se conserva en muchas especies bacterianas. El núcleo de esporas tiene un contenido de agua inferior a la célula vegetativa y es rica en ácido dipicolínico (DPA) ^1,2. Durante la formación de esporas, DPA se bombea en el núcleo de esporas a cambio de agua. Que rodea el núcleo es una membrana de esporas interior donde, en la mayoría de las bacterias formadoras de esporas, los receptores que reconocen las pequeñas moléculas que estimulan la germinación de semillas en germinación ⁽²⁾ se encuentran. Situado a las afueras de la membrana interior de la espora es una capa de peptidoglicano de la pared celular. Una capa de peptidoglicano especializada (corteza) rodea el peptidoglicano de la pared celular y se compone de muchos de los mismos componentes que el peptidoglicano de la pared celular [alternando N-acetilglucosamina (NAG) y ácido N-acetilmurámico (NAM)]. Sin embargo, aproximadamente 50% de los residuos NAM en la corteza se han convertido a murámico-δ-lactama ^5,6 . Durante la germinación de esporas, estos residuos murámico-δ-lactámicos son reconocidos por las esporas de la corteza enzimas líticas (SCLEs), permitiendo así que la corteza a degradarse (un proceso esencial para completar la germinación), pero no la pared celular. Que rodea la corteza es una membrana externa y varias capas de proteínas de la cubierta ^2.

Controlar el proceso de germinación es de importancia crítica para las bacterias formadoras de esporas. La germinación se inicia cuando los receptores germinantes interactúan con sus respectivos semillas en germinación ^2. En muchas bacterias formadoras de esporas, estas semillas en germinación son aminoácidos, azúcares, nucleótidos, iones o combinaciones de los mismos ^2. C. difficile germinación de las esporas es iniciado por combinaciones de ciertos ácidos biliares, [por ejemplo, ácido taurocólico (TA)] y aminoácidos (por ejemplo, glicina) ^7-10. Aunque hay diferencias entre el C. vía la germinación difficile y las vías estudiadas en otra forma esporasbacterias, tales como B. subtilis, común a todos es el requisito absoluto para degradar la corteza de esporas para permitir que una célula vegetativa a crecer a partir de la espora germinada ^2,8. La degradación de la corteza se puede lograr por el SCLEs CwlJ / SleB (como se encuentra en B. subtilis) o SLEC (como se encuentra en muchos Clostridia). hidrólisis de la corteza reduce la restricción en la pared celular y la espora. Esto permite una rehidratación completa del núcleo, un paso necesario en la reactivación de muchas de las proteínas necesarias para el metabolismo celular ^2.

Cuando las esporas germinan, los cambios de esporas inactivas de un estado de fase-brillante a un estado de fase-oscuro y este proceso se pueden medir por un cambio en la densidad óptica (DO) a 600 ¹¹ nm. Un informe anterior sugiere que gran parte de este cambio en OD es debido a la liberación de la DPA de la espora ^12. Durante nuestra reciente estudio, hemos tratado de comparar el tiempo de C. difficile germinación de esporas y seguimiento de laliberación de la DPA y la corteza fragmentos ^9. Para este estudio era fundamental para controlar la liberación de fragmentos de la corteza, ya que comenzó a ser liberado por la germinación de las esporas.

El ensayo colorimétrico se utiliza aquí se basa en un método para la detección de azúcares reductores con extremos desarrollaron Ghuysen et al. ^13. Debido a que otros han descrito protocolos para la detección de azúcares reductores ¹⁴ o han modificado los protocolos ^15, la literatura sobre este tema puede ser confuso. Aquí, un método paso a paso que detalle para la detección colorimétrica de azúcares reductores liberados de la germinación de C. esporas difficile. Aunque este estudio utiliza C. esporas difficile, los azúcares reductores liberados durante la germinación de esporas de otras bacterias formadoras de esporas son capaces de ser detectadas con este protocolo ^9,16,17.

Protocolo

1. Las muestras de generación

1. El calor activa C. difficile esporas a 65 ° C durante 30 minutos y almacenar en hielo.
   Nota: C. esporas difficile pueden ser producidos y purificados como se ha descrito previamente ^7,9,10.
2. Preparar la solución de germinación a X + 1 ml donde X es el número de muestras que deben tomarse durante el ensayo.
   Nota: La solución de la germinación es específico de las especies de bacterias de esporas que se estudian. Para el ensayo de C. difficile germinación de esporas, se utilizó una solución de Tris 10 mM (pH 7,5), NaCl 150 mM, glicina 100 mM y 10 mM de ácido taurocólico en agua desionizada.
3. Antes de comenzar el ensayo, extraer una muestra de la solución de germinación 1,0 ml sin esporas para servir como un espacio en blanco para la detección fragmento de corteza.
4. Añadir esporas a un OD ₆₀₀ de ~ 3,0 a la solución de la germinación y el vórtice rápidamente.
   Nota: Para nuestros estudios de germinación en B. subtilis, se utilizó la misma OD ₆00 esporas como para C. difficile.
   Nota: Esta cantidad de esporas funcionó bien para la liberación fragmento de la corteza durante el seguimiento C. germinación de las esporas difficile. La cantidad de esporas utilizada en este ensayo se debe determinar experimentalmente para cada bacteria o cepa.
5. Extraer una muestra 1,2 ml inmediatamente después de la adición de las esporas y se centrifuga a temperatura ambiente durante 1 min a 14.000 x g. Este es el punto de tiempo cero.
6. Transferir 1,0 ml del sobrenadante de la muestra centrifugada a un tubo nuevo para el análisis de fragmento de corteza posterior.
   Nota: En caso de DPA deben ser supervisados, retirar una muestra de 100 l separada para la detección de DPA en la solución utilizando un ensayo basado en fluorescencia terbio ^9,18,19.
7. Congelar la muestra recogida a -80 ° C.
8. Repita los pasos 1.4 y 1.5, a intervalos regulares hasta que todos los puntos de tiempo completadas.
   Nota: Debido al tiempo requerido para la centrifugación y el muestreo, menos puntos de tiempo THun 2 min aparte no fuera posible durante nuestro procedimiento, por lo que nuestros intervalos de muestreo fueron una vez cada 2 min durante 14 min.
9. Como control positivo para la reducción de la detección de azúcar y la cuantificación, incluyen las siguientes cantidades de N acetilglucosamina (nmol): 0, 12,5, 25, 50, 100, 250, 500, y 5000. Preparar estas muestras al mismo tiempo que las muestras de la corteza y de gestión junto con las muestras de la corteza de manera que la curva estándar es relevante para los datos generados por la germinación de esporas.
10. Después se recogen todas las muestras puntuales tiempo, liofilizar las muestras.
    Nota: Nos liofilizado nuestras muestras en tubos de 2 ml con tapón de rosca.

2. Medición de la corteza Fragmentos

1. Resuspender muestras liofilizadas en 120 l de HCl 3 N suplementado con 1% de fenol y 0,5% β-mercaptoetanol.
2. La transferencia de las muestras resuspendidas a 2 ml tubos con tapa de rosca.
   Nota: Para la reproducibilidad, garantizan toda la muestra liofilizada se suspende de nuevo y se transfiere.
3. Incubar las muestras en un baño de agua de recirculación a 95 ° C durante 4 horas.
4. Después de la incubación, colocar las muestras en hielo hasta que se hayan enfriado.
5. Neutralizar las muestras con 120 l de NaOH 3 M.
6. Añadir 80 l de una solución saturada de bicarbonato sódico y 80 l de una solución de anhídrido acético al 5% a cada muestra y vórtice.
7. Se incuban las muestras a temperatura ambiente durante 10 min.
8. La transferencia de las muestras al baño de agua a 95 ° durante exactamente 3 minutos.
   Nota: Este paso es el tiempo más largos tiempos sensibles y pueden afectar el desarrollo señal descendente.
9. Extraer muestras del baño de agua y enfriar en hielo.
10. Añadir 400 l de 6,54% K ₂ B ₄ O ₇ · 4H ₂ O a cada tubo y vórtice.
11. Se incuban las muestras en un baño de agua de recirculación a 95 ° C durante exactamente 7 min.
    Nota: Este paso es el tiempo más largos tiempos sensibles y pueden afectar el desarrollo señal descendente.
12. retirarlas muestras y colocar en hielo durante 5 min.

3. Reactivo de color

1. Mientras que las muestras están en hielo (paso 2,12), preparar el reactivo de color. Disolver 0,320 g de p -dimethylaminobenzaldehyde (DMAB; el reactivo de Ehrlich) en 1,9 ml de ácido acético glacial.
   Nota: El reactivo es el tiempo, la temperatura y la sensible a la luz y no debe hacerse por adelantado.
2. Después de la DMAB se disuelve completamente, añadir 100 l de HCl y agitar 10 N.
3. Añadir 5 ml de ácido acético glacial y vórtice.

4. Reacción colorimétrica

1. Transferir 100 l de cada muestra de corteza se enfrió a un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.
2. Añadir 700 l de la solución de color recién preparada a cada muestra.
3. Inmediatamente transferir las muestras a un baño de agua a 37 ° e incubar durante exactamente 20 minutos.
4. Transferir 200 l de cada muestra a una placa de 96 pocillos clara.
5. Cuantificar las muestras a 585 nm en un platolector. Las muestras deben comenzar en un color amarillo y una reacción positiva se desplazarán a púrpura. La corteza más presente, más profundo es el color púrpura.

Resultados

La Tabla 1 muestra los resultados típicos que usan las normas de NAG. Los datos se utilizan para generar una curva estándar. Tabla 2 muestra los resultados típicos de un ensayo de germinación en tampón de germinación suplementado con glicina 100 mM y TA 10 mM (condiciones de germinación de promoción) o glicina 100 mM sólo (condiciones no de germinación). En ausencia de TA, C. esporas difficile no germinan y hay poco cambio en ...

Discusión

Tras la estimulación, las esporas se someten el proceso de germinación pierden sus propiedades de resistencia sin la necesidad de la síntesis macromolecular. Cuando se activa la germinación de esporas, el núcleo de esporas de prensa DPA, a cambio de agua ^2. Debido al alto contenido de DPA de la espora latente, el núcleo de esporas está bajo presión osmótica intenso y el peptidoglicano especializada, corteza, ayuda a prevenir el núcleo de la hinchazón actuando, presumiblemente, como una barrera a la...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
2.0 ml screw cap tube	USA scientific	1420-3700
p1000 Eppendorf pipet	Eppendorf
p200 Eppendorf pipet	Eppendorf
p20 Eppendorf pipet	Eppendorf
100 - 1,250 μl pipet tips	VWR	89079-486
1 - 200 μll pipet tips	VWR	89079-458
N-acetyl-D-glucosamine	Sigma	A3286-25G
Hydrochloric Acid - 10 N	BDH-Aristar	BDH3032-3.8LP
Acetic Anhydride	Alfa Aesar	L04295
Sodium Bicarbonate	BDH	BDH0280-500G
Potassium Tetraborate tetrahydrate	Alfa Aesar	39435
Sodium Hydroxide	BDH	BDH8019-500G
4-(Dimethylamino)benzaldehyde	Sigma	156477-100G
Saturated Phenol	Fisher	BP1750-400
2-Mercaptoethanol	Aldrich	M6250-100ML
SpectraMax M3	Molecular Devices
Acetic Acid, Glacial	BDH	BDH3098-3.8LP
Heated, Circulating Water Bath	VWR Scientific	Model 1136
Microtest 96	Falcon	353072	96 well clear tissue culture plates
Culture tubes	VWR	89000-506
Lyophilizer
Heat Blocks
Vortex Machine