세균 포자 발아 동안 코어 텍스 조각 검출

요약

Herein, we describe a colorimetric assay to detect the presence of reducing sugars during bacterial spore germination.

초록

The process of endospore germination in Clostridium difficile, and other Clostridia, increasingly is being found to differ from the model spore-forming bacterium, Bacillus subtilis. Germination is triggered by small molecule germinants and occurs without the need for macromolecular synthesis. Though differences exist between the mechanisms of spore germination in species of Bacillus and Clostridium, a common requirement is the hydrolysis of the peptidoglycan-like cortex which allows the spore core to swell and rehydrate. After rehydration, metabolism can begin and this, eventually, leads to outgrowth of a vegetative cell. The detection of hydrolyzed cortex fragments during spore germination can be difficult and the modifications to the previously described assays can be confusing or difficult to reproduce. Thus, based on our recent report using this assay, we detail a step-by-step protocol for the colorimetric detection of cortex fragments during bacterial spore germination.

서문

내생 포자는 대사 세균이 불리한 환경에서 지속 할 수 있도록 박테리아의 휴면 형태이다. 많은 포자 - 형성 박테리아 포자 형성 영양 결핍에 의해 유도되지만,이 공정은 산소 또는 다른 스트레스 ¹ pH를 노출의 변화에 의해 제어 될 수있다. 이들 대사 휴면 포자 형태 동안 박테리아는 UV 방사선, 탈수, 고온 ^{및이 냉동} 레지스트. 포자 형성 과정에 대한 지식의 대부분 모델에서 생체 연구 고초균에서 온다. 포자 형성 과정은 DNA 복제 및 축 ^3,4- 필라멘트의 형성으로 시작된다. 비대칭 격막은이 불평등 크기의 구획에 셀을 분할한다. 더 큰 구획은, 머더 셀은 더 작은 구획은 forespore을 삼키기. 머더 셀과 도만을 방출 포자 결국 lyses 머더 세포 성숙의 유전자 발현을 조정 forespore 두주변 환경 ^1에 t 포자.

포자 구조 및 조성은 다양한 세균 종에 걸쳐 보존되어있다. 포자 코어는 식물 세포보다 낮은 수분 함량을 갖고 dipicolinic 산 (DPA) ^-1,2- 풍부하다. 포자 형성하는 동안, DPA 물 교환 포자 코어로 펌핑된다. 코어 주변 대부분의 포자 형성 균에, 발아 (germinants)을 자극하는 작은 분자를 인식하는 수용체 ² 위치, 내부 포자 막이다. 단 포자의 내막 밖에있는 세포벽의 펩티도 글리 칸 층이다. 특수한 펩티 층 (피질) 세포벽 펩티을 둘러싸고 [N 아세틸 글루코사민 (NAG)와 N-acetylmuramic 산 (NAM)이 교대] 세포벽 펩티 같은 많은 구성 요소로 구성된다. 그러나, 피질의 NAM 잔기의 약 50 %가 무람-δ 락탐 ^5,6- 변환되었습니다 입니다. 포자 발아 동안이 무람-δ 락탐 잔기 따라서 피질 아니라 칸막이 벽 (발아 마칠 공정)을 저하 할 수 포자 피질 용균 효소 (SCLEs)에 의해 인식된다. 피질 주변은 외부 막과 코트 ^단백질이 여러 층이다.

발아 과정을 제어하는​​ 포자 형성 세균 매우 중요하다. 싹 트는 수용체는 해당 germinants ^2와 상호 작용할 때 발아가 시작됩니다. 많은 포자 - 형성 박테리아에서 이러한 germinants ² 이의 아미노산, 당, 뉴클레오티드, 이온 또는 이들의 조합이다. C. 디피 포자 발아 특정 담즙산 [예를 들어, 타우로 콜린 산 (TA)] 및 아미노산 (예컨대, 글리신) ^7-10의 조합에 의해 개시된다. C. 사이의 차이가 있지만 디피 발아 경로와에서 공부 경로 다른 포자 형성같은 B와 박테리아, 서브 틸리 모든 공통 식물 세포는 포자 발아 ^2,8 성장할 수 있도록 포자 외피 저하하는 절대 조건이다. 또는 SLEC (B. 서브 틸리에서 발견) (많은 클로스 트리 디아에서 발견) 코어 텍스 저하는 SCLEs CwlJ / SleB에 의해 달성 될 수있다. 피질 가수 분해 세포벽 및 포자의 제한을 감소시킨다. 이는 전체 코어 수분 보충, 세포 대사 ^(2)에 필요한 단백질의 대부분을 재 활성화에 필요한 단계 수 있습니다.

포자가 발아 할 때 위상이 어두운 상태로 공정 상 밝은 상태로부터 휴면 포자 변화는 600에서 광학 밀도 (OD)의 변화에​​ 의해 측정 할 수있다 나노 ^11. 이전의 보고서는 OD의 변화의 대부분은 포자 ¹² DPA의 출시로 인해 있음을 시사한다. 우리의 최근의 연구 동안, 우리는 C.의 타이밍을 비교하고자 남과 어울리지 않는 포자 발아 및 모니터링되는DPA와 피질 조각 ⁹ 릴리스. 그들은 포자를 발아가 발표되기 시작으로이 연구는 피질 조각의 방출을 모니터링하는 것이 중요했다.

여기에서 사용되는 비색 분석이 환원 말단에 당류를 검출하는 방법에 기초 하였다 Ghuysen 외. ^(13)을 개발 ^하였다. 다른 사람이 환원당 ^(14)의 검출을위한 프로토콜을 설명했습니다 또는 이러한 프로토콜 ^15을 수정 한 때문에이 주제에 대한 문헌은 혼란 스러울 수 있습니다. 여기서, C. 발아에서 해방 환원당의 비색 검출 상세히에게 단계별 방법 우리 남과 어울리지 않는 포자. 이 연구는 C.를 사용하지만 남과 어울리지 않는 포자는 다른 포자 형성 균의 포자의 발아 중에 방출 된 환원당이 프로토콜 ^9,16,17 검출 할 수있다.

프로토콜

1. 생성 샘플

1. 열 C를 활성화 디피는 얼음에 30 분 및 저장을 위해 65 ° C에서 포자.
   참고 : C를 앞서 설명한 바와 같이 ^7,9,10 디피 포자를 제조 및 정제 할 수있다.
2. X는 샘플의 수는 분석 중에 촬영하는 X + 1 용액에서 발아 용액을 제조 하였다.
   참고 : 박테리아의 종류가 연구되고 포자에 발아 솔루션은 고유의 것입니다. C.을 분석하십시오 디피 포자 발아, 우리는 10 mM 트리스 (PH 7.5), 150 mM의 NaCl을 탈 이온수 100 mM의 글리신 및 10 mM의 타우로 콜린 산의 용액을 사용 하였다.
3. 분석을 시작하기 전에, 피질 조각 검출을위한 빈 역할을하는 포자없이 발아 솔루션의 1.0 ml의 샘플을 그립니다.
4. OD 빨리 발아 솔루션 및 소용돌이에 ~ 3.0 _(600)에 포자를 추가합니다.
   참고 : B. 우리의 발아 연구 내용 서브 틸리 스, 우리는 같은 OD를 사용 ₍₆₎C. 용으로 00 포자 디피.
   참고 : 포자의이 금액은 C. 동안 모니터링 피질 조각 방출을 위해 잘 작동 남과 어울리지 않는 포자 발아. 이 분석에 사용 된 포자의 크기는 각각의 박테리아 균주 또는 실험적으로 결정되어야한다.
5. 즉시 14,000 × g에서 1 분 동안 실온에서 원심 분리 포자를 첨가 한 후 1.2 ml의 샘플을 제거한다. 이것은 제로 시점이다.
6. 후속 피질 단편 분석을위한 신선한 튜브 원심 분리 된 샘플로부터 상등액 1.0 ㎖에 옮긴다.
   주 : 테르븀 형광 ^9,18,19에 기초한 분석을 이용하여 상기 용액에서 DPA의 검출을위한 별도의 100 μL 샘플을 제거 DPA가 모니터링해야해야한다.
7. -80 ° C에서 수집 된 샘플을 고정.
8. 모든 시점이 완료 될 때까지 반복하여 일정한 간격으로 1.4 및 1.5 단계를 반복합니다.
   참고 : 시간의 원심 분리 및 샘플링 시점 적은 일에 필요하기 때문에2 분 떨어져 우리의 절차를 수행하는 동안 불가능했던, 그래서 우리의 샘플링 간격은 한 번에 14 분 동안 매 2 분이었다.
9. 0, 12.5, 25, 50, 100, 250, 500, 5000 : 설탕 검출 및 정량화를 감소시키기위한 포지티브 대조군으로서, N의 -acetylglucosamine (nmol의) 다음의 양을 포함한다. 껍질 샘플과 동시에 이들 샘플을 준비하고, 표준 곡선이 포자를 발아에 의해 생성 된 데이터와 관련되도록 껍질 샘플과 함께 실행.
10. 모든 시점의 샘플을 수집 한 후, 샘플을 동결 건조.
    참고 : 우리는 2 ml의 스크류 캡 튜브에 우리의 샘플을 동결 건조.

2. 코어 텍스 조각을 측정

1. 1 %의 페놀 및 0.5 % β 메르 캅토 에탄올이 보충 된 3 N HCl을 120 μL에 재현 탁하여 동결 건조 샘플.
2. 2 ml의 스크류 캡 튜브에 재현 탁 샘플을 전송합니다.
   참고 : 재현성를 들어, 모든 동결 건조 된 시료를 재현 탁하고 전송되어 있는지 확인합니다.
<리> 4 시간 동안 95 ° C에서 재순환 수조에서 샘플을 품어.
3. 그들은 멋진 때까지 배양 한 후, 얼음에 샘플을 배치합니다.
4. 3 M NaOH를 120 μL로 샘플을 중화.
5. 포화 중탄산 나트륨 용액 80 ㎕를 각 샘플 및 와류에 5 % 아세트산 무수물 용액 80 μL를 추가한다.
6. 실온에서 10 분 동안 샘플을 인큐베이션.
7. 정확히 3 분 동안 다시 95 ° C의 물을 욕조에 샘플을 전송합니다.
   참고 :이 단계는 민감하고 긴 시간이 하향 신호의 개발에 영향을 미칠 수있는 시간입니다.
8. 수조에서 샘플을 제거하고 얼음에 냉각.
9. 각 튜브와 소용돌이에 6.54 % K ₂ B ₄ O ₇ · 4H ₂ O의 400 μl를 추가합니다.
10. 정확히 7 분 동안 95 ℃에서 재순환 수욕 샘플을 인큐베이션.
    참고 :이 단계는 민감하고 긴 시간이 하향 신호의 개발에 영향을 미칠 수있는 시간입니다.
11. 없애다5 분 동안 얼음에 샘플 및 장소.

3. 색상 시약

1. 샘플을 얼음 (단계 2.12)에 있지만, 컬러 시약을 준비한다. (; 에를리히 시약 DMAB) 빙초산의 1.9 ml의에서 P는 -dimethylaminobenzaldehyde의 0.320 g을 녹여.
   참고 : 시약 시간, 온도, 빛에 민감하고 사전에 할 수 없습니다.
2. DMAB가 완전히 용해 후 10 N 염산과 소용돌이의 100 μl를 추가합니다.
3. 빙초산과 소용돌이의 5 ML을 추가합니다.

4. 비색 반응

1. 전송 각 100 ㎕ 새로운 1.5 ml의 microcentrifuge 관에 피질 샘플을 냉각시켰다.
2. 각 샘플에 갓 준비 색 용액 700 μl를 추가합니다.
3. 즉시 37 ° C의 물을 욕조에 샘플을 전송하고 정확히 20 분 동안 품어.
4. 무려 96 웰 플레이트에 각 시료 200 μl를 전송합니다.
5. 접시에 585 nm에서 샘플을 정량화리더. 샘플은 노란색에서 시작해야하며, 긍정적 인 반응이 보라색으로 이동합니다. 더 피질에 존재하는, 깊은 보라색 색상입니다.

결과

표 1 NAG 표준을 사용하여 통상적 인 결과를 나타낸다. 데이터는 표준 곡선을 생성하는데 사용된다. 표 2는 100 mM의 글리신 및 10mM의 TA (발아 촉진 조건) 또는 100 mM의 글리신 만 (비 발아 조건)으로 보충 발아 버퍼에서 발아 시험에서 전형적인 결과를 나타낸다. TA, C.가없는 디피 포자가 발아하지 않고, 용액의 피질 단편의 존재 하에서 거의 변?...

토론

자극 후, 발아 과정을 거치고 포자 고분자 합성에 대한 필요없이 저항 특성을 잃는다. 포자 발아가 트리거되면 포자 코어는 ^물이 교환 DPA를 발표한다. 인해 휴면 포자의 높은 DPA 콘텐츠 포자 코어는 ^팽창이 장벽으로, 아마도 작용하여 팽윤 코어 방지 강렬한 삼투압 및 전문 펩티, 피질 중이다.

상기 방법은 보라색의 색조에 변화 측정으로 환원당의 존재를 검?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
2.0 ml screw cap tube	USA scientific	1420-3700
p1000 Eppendorf pipet	Eppendorf
p200 Eppendorf pipet	Eppendorf
p20 Eppendorf pipet	Eppendorf
100 - 1,250 μl pipet tips	VWR	89079-486
1 - 200 μll pipet tips	VWR	89079-458
N-acetyl-D-glucosamine	Sigma	A3286-25G
Hydrochloric Acid - 10 N	BDH-Aristar	BDH3032-3.8LP
Acetic Anhydride	Alfa Aesar	L04295
Sodium Bicarbonate	BDH	BDH0280-500G
Potassium Tetraborate tetrahydrate	Alfa Aesar	39435
Sodium Hydroxide	BDH	BDH8019-500G
4-(Dimethylamino)benzaldehyde	Sigma	156477-100G
Saturated Phenol	Fisher	BP1750-400
2-Mercaptoethanol	Aldrich	M6250-100ML
SpectraMax M3	Molecular Devices
Acetic Acid, Glacial	BDH	BDH3098-3.8LP
Heated, Circulating Water Bath	VWR Scientific	Model 1136
Microtest 96	Falcon	353072	96 well clear tissue culture plates
Culture tubes	VWR	89000-506
Lyophilizer
Heat Blocks
Vortex Machine