Detecção de Cortex Fragmentos Durante bacteriana germinação de esporos

Resumo

Herein, we describe a colorimetric assay to detect the presence of reducing sugars during bacterial spore germination.

Resumo

The process of endospore germination in Clostridium difficile, and other Clostridia, increasingly is being found to differ from the model spore-forming bacterium, Bacillus subtilis. Germination is triggered by small molecule germinants and occurs without the need for macromolecular synthesis. Though differences exist between the mechanisms of spore germination in species of Bacillus and Clostridium, a common requirement is the hydrolysis of the peptidoglycan-like cortex which allows the spore core to swell and rehydrate. After rehydration, metabolism can begin and this, eventually, leads to outgrowth of a vegetative cell. The detection of hydrolyzed cortex fragments during spore germination can be difficult and the modifications to the previously described assays can be confusing or difficult to reproduce. Thus, based on our recent report using this assay, we detail a step-by-step protocol for the colorimetric detection of cortex fragments during bacterial spore germination.

Introdução

Endospores são metabolicamente formas latentes de bactérias que permitem que as bactérias para persistir em ambientes desfavoráveis. Em muitas bactérias formadoras de esporos, a formação de esporos é induzida pela privação de nutrientes, mas este processo pode ser controlada por alterações de pH, exposição ao oxigénio ou outros stresses ^1. Embora em sua forma de esporos metabolicamente dormente, as bactérias resistir à radiação UV, a dessecação, temperaturas mais elevadas e que congela ^2. A maior parte do conhecimento sobre o processo de esporulação vem de estudos no organismo modelo, Bacillus subtilis. O processo de esporulação começa com a replicação do ADN e a formação de um filamento de ^3,4 axial. Um septo assimétrica, em seguida, divide a célula em dois compartimentos de tamanho desigual. O compartimento maior, a célula mãe, engolfa o compartimento mais pequeno, o forespore. Tanto a célula mãe e forespore coordenar a expressão do gene para amadurecer o esporo e a célula mãe, eventualmente, lisa, liberando o Dormant de esporos para o ambiente circundante ^um.

A estrutura e a composição de esporos é conservada entre várias espécies bacterianas. O núcleo de esporos tem um teor de água inferior a célula vegetativa e é rica em ácido dipicolínico (DPA) ^1,2. Durante a formação de esporos, DPA é bombeado para dentro do núcleo de esporos em troca de água. Em torno do núcleo é uma membrana de esporos interior, onde, na maioria das bactérias formadoras de esporos, os receptores que reconhecem as pequenas moléculas que estimulam a germinação (germinants) estão localizados a ^2. Localizado no exterior membrana interna do esporo é uma camada de peptidoglicano da parede celular. Uma camada de peptidoglicano especializado (córtex) rodeia o peptidoglicano da parede celular e é composta de muitos dos mesmos componentes como peptidoglicano da parede celular [alternando N-acetilglucosamina (NAG) e ácido N-acetilmurâmico (NAM)]. No entanto, aproximadamente 50% dos resíduos de NAM no córtex foram convertidos para murâmico-δ-lactama ^5,6 . Durante a germinação de esporos, estes resíduos murâmico-δ-lactâmicos são reconhecidos pelos esporos do córtex enzimas líticas (SCLEs), permitindo assim que o córtex para ser degradada (um processo essencial para completar a germinação) mas não a parede celular. Rodeando o córtex é uma membrana exterior e várias camadas de proteínas de revestimento ^2.

Controlando o processo de germinação é criticamente importante para as bactérias formadoras de esporos. A germinação é iniciada quando os receptores germinativa interagir com seus respectivos germinants ^2. Em muitas bactérias formadoras de esporos, estes são germinants amino ácidos, açúcares, nucleótidos, iões, ou combinações destes ^dois. C. difficile germinação de esporos é iniciada por meio de combinações de certos ácidos biliares, [por exemplo, ácido taurocólico (TA)] e aminoácidos (por exemplo, glicina) ^7-10. Embora existam diferenças entre o C. via de germinação difficile e as vias estudadas em outra forma de esporobactérias, tais como B. subtilis, comum a todos é a exigência absoluta para degradar o córtex esporos para permitir que uma célula vegetativa a crescer a partir do esporos germinados ^2,8. Córtex degradação pode ser conseguida pela SCLEs CwlJ / SleB (como encontrado em B. subtilis) ou SLEC (como encontrado em muitos Clostridia). hidrólise córtex reduz a restrição na parede da célula e esporo. Isto permite uma re-hidratação completa do núcleo, um passo necessário para a reactivação muitas das proteínas necessárias para o metabolismo celular ^2.

Quando esporos germinam, as mudanças de esporos a partir de um estado dormente de fase brilhante para um estado de fase-escuro e este processo pode ser medido por uma alteração na densidade óptica (DO) a 600 nm ^11. Um relatório anterior sugere que grande parte dessa mudança de OD é devido à liberação da DPA do esporo ^12. Durante a nossa recente estudo, buscou-se comparar o tempo de C. difficile germinação de esporos e acompanhou olançamento do DPA e córtex fragmentos ^9. Para este estudo foi fundamental para monitorar o lançamento de fragmentos de córtex, quando começaram a ser lançado pela germinação de esporos.

O ensaio colorimétrico aqui utilizado baseou-se num método para a detecção de açúcares com extremidades redutoras desenvolvido Ghuysen et ai. ^13. Porque os outros têm descrito protocolos para a detecção de açúcares redutores ¹⁴ ou modificou os protocolos ^15, a literatura sobre este assunto pode ser confuso. Aqui, nós detalhe um método passo-a-passo para a detecção colorimétrica de açúcares redutores libertados de germinação C. esporos difficile. Embora este estudo utiliza C. esporos difficile, os açúcares redutores libertados durante a germinação de esporos a partir de outras bactérias formadoras de esporos são capazes de serem detectadas com este protocolo ^9,16,17.

Protocolo

1. As amostras de Geração

1. Calor ativar C. difficile esporos a 65 ° C durante 30 min e armazenar em gelo.
   Nota: C. esporos difficile pode ser produzida e purificada tal como descrito anteriormente ^7,9,10.
2. Preparar a solução de germinação a X + 1 ml onde X é o número de amostras a serem tomadas durante o ensaio.
   Nota: A solução de germinação é específico para as espécies de bactérias esporos sendo estudado. Para ensaiar C. difficile a germinação de esporos, foi utilizada uma solução de Tris 10 mM (pH 7,5), NaCl 150 mM, glicina 100 mM e 10 mM de ácido taurocólico em água desionizada.
3. Antes de iniciar o ensaio, retirar uma amostra da solução de 1,0 ml sem germinação de esporos para servir como uma estrutura para a detecção fragmento córtex.
4. Adicionar esporos a um OD ₆₀₀ de ~ 3.0 para a solução de germinação e vortex rapidamente.
   Nota: Para os nossos estudos de germinação em B. subtilis, foi utilizada a mesma OD ₆00 esporos como por C. difficile.
   Nota: Esta quantidade de esporos funcionou bem para monitoramento córtex liberação fragmento durante C. germinação de esporos difficile. A quantidade de esporos utilizada neste ensaio devem ser determinadas experimentalmente para cada bactéria ou estirpe.
5. Remover uma amostra de 1,2 ml, imediatamente após adição dos esporos e centrifugação à temperatura ambiente durante 1 min a 14.000 x g. Este é o ponto de tempo zero.
6. Transferir 1,0 ml do sobrenadante a partir da amostra centrifugada para um tubo fresco para a análise de fragmentos de córtex posterior.
   Nota: Se DPA necessitam de ser monitorizados, remover uma amostra de 100 ul em separado para a detecção de DPA na solução utilizando um ensaio baseado em fluorescência térbio ^9,18,19.
7. Congelar a amostra recolhida a -80 ° C.
8. Repita os passos 1.4 e 1.5, em intervalos regulares, até que todos os pontos de tempo completo.
   Nota: Devido ao tempo necessário para a centrifugação e amostragem, momentos menos thum 2 min apart não fosse possível durante o nosso procedimento, para que os nossos intervalos de amostragem eram uma vez a cada 2 min para 14 min.
9. Como um controlo positivo para reduzir a detecção e quantificação de açúcar, incluem as seguintes quantidades de N-acetilglicosamina (nmol): 0, 12,5, 25, 50, 100, 250, 500, e 5000. Preparar estas amostras ao mesmo tempo como amostras de córtex e execute, juntamente com as amostras de córtex de modo que a curva padrão é relevante para os dados gerados pela germinação de esporos.
10. Depois de todas as amostras ponto de tempo são recolhidas, liofilizar as amostras.
    Nota: Nós liofilizado nossas amostras em tubos de 2 ml com tampa de rosca.

2. Medir Cortex Fragments

1. Ressuspender as amostras liofilizadas em 120 mL de HCl 3 N suplementado com 1% de fenol e 0,5% β-mercaptoetanol.
2. Transferir as amostras em suspensão para 2 ml tubos com tampa de rosca.
   Nota: Para reprodutibilidade, assegurar toda a amostra liofilizada �ressuspenso e transferidos.
3. Incubar as amostras num banho de água em recirculação, a 95 ° C durante 4 h.
4. Após a incubação, colocar as amostras em gelo até que eles são legais.
5. Neutraliza-se a amostras com 120 uL de NaOH 3 M.
6. Adicionar 80 ul de uma solução saturada de bicarbonato de sódio e 80 mL de uma solução de anidrido acético a 5% a cada amostra e vortex.
7. Incubam-se as amostras à temperatura ambiente durante 10 min.
8. Transferir as amostras de volta para o banho de água C 95 ° para exatamente 3 min.
   Nota: Esta etapa é hora vezes sensíveis e mais longas podem afetar o desenvolvimento do sinal a jusante.
9. Retirar amostras a partir do banho de água e arrefece-se em gelo.
10. Adicionar 400 uL de 6,54% K ₂ B ₄ O ₇ · 4H ₂ O para cada tubo e vortex.
11. Incubam-se as amostras num banho de água em recirculação, a 95 ° C durante exactamente 7 min.
    Nota: Esta etapa é hora vezes sensíveis e mais longas podem afetar o desenvolvimento do sinal a jusante.
12. Removeras amostras e colocar em gelo durante 5 min.

3. Cor Reagente

1. Enquanto as amostras estão no gelo (Passo 2,12), preparar o reagente de cor. Dissolve-se 0,320 g de p -dimethylaminobenzaldehyde (DMAB; reagente de Ehrlich) em 1,9 ml de ácido acético glacial.
   Nota: O reagente é o tempo, temperatura e sensível à luz e não devem ser feitas com antecedência.
2. Após o DMAB se dissolva completamente, adicionar 100 mL de HCl 10 N e vortex.
3. Adicionar 5 ml de ácido acético glacial e agitar com vortex.

4. reacção colorimétrica

1. Transferir 100 uL de cada amostra arrefecida córtex para um novo tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.
2. Adicionar 700 ul da solução de cor recém-preparadas para cada amostra.
3. transferir imediatamente as amostras para um banho de água C 37 ° e incubar por exatamente 20 min.
4. Transferir 200 ul de cada amostra para uma placa de 96 poços clara.
5. Quantificar as amostras a 585 nm em um pratoleitor. As amostras devem começar em uma cor amarela e uma reacção positiva se deslocará para roxo. Quanto mais córtex presente, quanto mais profunda a cor roxa.

Resultados

A Tabela 1 mostra os resultados típicos usando padrões de NAG. Os dados são utilizados para gerar uma curva padrão. A Tabela 2 mostra os resultados típicos de um ensaio de germinação de germinação em tampão suplementado com 100 mM de glicina e TA 10 mM (condições de promoção da germinação) ou de glicina 100 mM apenas (condições não-germinação). Na ausência de TA, C. difficile esporos germinam e não há pouca alteração na...

Discussão

Após estimulação, os esporos submetidos ao processo de germinação perder as suas propriedades de resistência, sem a necessidade de síntese macromolecular. Quando a germinação de esporos é acionado, o núcleo de esporos libera DPA em troca de água ^2. Devido ao elevado teor de DPA do esporo dormente, o núcleo é de esporos sob intensa pressão osmótica e o peptidoglicano especializado, córtex, ajuda a impedir que o núcleo de inchaço, agindo, presumivelmente, como uma barreira para a expansão

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
2.0 ml screw cap tube	USA scientific	1420-3700
p1000 Eppendorf pipet	Eppendorf
p200 Eppendorf pipet	Eppendorf
p20 Eppendorf pipet	Eppendorf
100 - 1,250 μl pipet tips	VWR	89079-486
1 - 200 μll pipet tips	VWR	89079-458
N-acetyl-D-glucosamine	Sigma	A3286-25G
Hydrochloric Acid - 10 N	BDH-Aristar	BDH3032-3.8LP
Acetic Anhydride	Alfa Aesar	L04295
Sodium Bicarbonate	BDH	BDH0280-500G
Potassium Tetraborate tetrahydrate	Alfa Aesar	39435
Sodium Hydroxide	BDH	BDH8019-500G
4-(Dimethylamino)benzaldehyde	Sigma	156477-100G
Saturated Phenol	Fisher	BP1750-400
2-Mercaptoethanol	Aldrich	M6250-100ML
SpectraMax M3	Molecular Devices
Acetic Acid, Glacial	BDH	BDH3098-3.8LP
Heated, Circulating Water Bath	VWR Scientific	Model 1136
Microtest 96	Falcon	353072	96 well clear tissue culture plates
Culture tubes	VWR	89000-506
Lyophilizer
Heat Blocks
Vortex Machine