Détecter Cortex Fragments Pendant bactérienne Spore Germination

Résumé

Herein, we describe a colorimetric assay to detect the presence of reducing sugars during bacterial spore germination.

Résumé

The process of endospore germination in Clostridium difficile, and other Clostridia, increasingly is being found to differ from the model spore-forming bacterium, Bacillus subtilis. Germination is triggered by small molecule germinants and occurs without the need for macromolecular synthesis. Though differences exist between the mechanisms of spore germination in species of Bacillus and Clostridium, a common requirement is the hydrolysis of the peptidoglycan-like cortex which allows the spore core to swell and rehydrate. After rehydration, metabolism can begin and this, eventually, leads to outgrowth of a vegetative cell. The detection of hydrolyzed cortex fragments during spore germination can be difficult and the modifications to the previously described assays can be confusing or difficult to reproduce. Thus, based on our recent report using this assay, we detail a step-by-step protocol for the colorimetric detection of cortex fragments during bacterial spore germination.

Introduction

Endospores sont métaboliquement formes dormantes de bactéries qui permettent aux bactéries de persister dans des environnements défavorables. Dans de nombreuses bactéries formant des spores, la formation de spores est induite par une carence en nutriments , mais ce processus peut être contrôlé par des changements à pH, l' exposition à l' oxygène ou d' autres contraintes ^1. Alors que dans leur forme de spores métaboliquement dormance, les bactéries résistent rayonnement UV, la dessiccation, des températures plus élevées, et le gel ^2. La plupart des connaissances sur le processus de sporulation provient d'études dans l'organisme modèle, Bacillus subtilis. Le processus de sporulation commence avec la réplication de l' ADN et la formation d'un filament de ^3,4 axiale. Un septum asymétrique divise ensuite la cellule en deux compartiments de taille inégale. Le grand compartiment, la cellule mère, engloutit plus petit compartiment, préspore. Tant la cellule mère et préspore coordonner l'expression des gènes à mûrir la spore et la cellule mère lyses finalement, libérant le dormant spores dans le milieu environnant ^1.

La structure des spores et la composition est conservée dans de nombreuses espèces bactériennes. Le noyau de spores a une teneur en eau inférieure à la cellule végétative et est riche en acide dipicolinique (DPA) ^1,2. Au cours de la formation de spores, le DPA est pompée dans le noyau de spores en échange de l'eau. Entourant le noyau est une membrane de spores intérieure où, dans la plupart des bactéries sporulantes, les récepteurs qui reconnaissent les petites molécules qui stimulent la germination germinants ⁽²⁾ sont situés. Situé juste en dehors de la membrane interne de la spore est une couche de peptidoglycane de la paroi cellulaire. Une couche de peptidoglycane spécialisée (cortex) entoure le peptidoglycane de la paroi cellulaire et se compose d'un grand nombre des mêmes composants que le peptidoglycane de la paroi cellulaire [alternance N-acétylglucosamine (NAG) et de l'acide N-acétylmuramique (NAM)]. Toutefois, environ 50% des résidus non alignés dans le cortex ont été convertis en muramique-δ-lactame ^5,6 . Au cours de la germination des spores, ces résidus muramique-δ-lactame sont reconnus par les spores cortex enzymes lytiques (les SCLEs), permettant ainsi le cortex à dégrader (un processus essentiel pour achever la germination), mais pas de la paroi cellulaire. Autour du cortex est une membrane externe et plusieurs couches de protéines d'enveloppe ^2.

Contrôle du processus de germination est d'une importance cruciale pour les bactéries formant des spores. Germination est déclenchée lorsque les récepteurs de germination interagissent avec leurs germinants respectifs ^2. Dans de nombreuses bactéries formant des spores, ces plantules sont des acides aminés, des sucres, des nucléotides, des ions ou des combinaisons de ces ^deux. C. difficile la germination des spores est initiée par des combinaisons de certains acides biliaires, [par exemple, l' acide taurocholique (TA)] et des acides aminés (par exemple la glycine) , ^7-10. Bien qu'il existe des différences entre le C. voie de germination difficile et les voies étudiées dans d' autres sporuléedes bactéries telles que B. subtilis, commun à tous est l'exigence absolue de dégrader le cortex de spores pour permettre à une cellule végétative de croître à partir de la spore germée ^2,8. La dégradation de Cortex peut être accompli par le SCLEs CWLj / SLEB (que l'on trouve dans B. subtilis) ou SLEC (que l'on trouve dans de nombreux Clostridia). Cortex hydrolyse réduit la contrainte sur la paroi cellulaire et de la spore. Cela permet noyau pleine réhydratation, une étape nécessaire dans réactivant la plupart des protéines nécessaires pour le métabolisme cellulaire ^2.

Lorsque les spores germent, les spores dormantes passe d'un état de phase lumineuse à un état de phase sombre et ce processus peut être mesurée par un changement de densité optique (DO) à 600 ¹¹ nm. Un précédent rapport suggère qu'une grande partie de ce changement de OD est due à la libération de DPA de la spore ^12. Au cours de notre étude récente, nous avons cherché à comparer le moment de C. difficile la germination des spores et la surveillancelibération de DPA et cortex fragments ^9. Pour cette étude, il était essentiel de surveiller la libération de fragments de cortex comme ils ont commencé à être libéré par la germination des spores.

Le dosage colorimétrique utilisé ici a été basé sur une méthode de détection des sucres avec des extrémités réductrices développé Ghuysen et al. ^13. Parce que d' autres ont décrit des protocoles pour la détection des sucres réducteurs ¹⁴ ou ont modifié les protocoles ^15, la littérature sur ce sujet peut être déroutant. Ici, nous détaillons une méthode étape par étape pour la détection colorimétrique de sucres réducteurs libérés de germant C. Les spores difficile. Bien que cette étude utilise C. Les spores difficile, les sucres réducteurs libérés au cours de la germination des spores provenant d' autres bactéries formant des spores puissent être détectées avec ce protocole ^9,16,17.

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Protocole

1. Échantillons Génération

1. Heat activer C. difficile spores à 65 ° C pendant 30 min et magasin sur la glace.
   Remarque: C. Les spores difficile peuvent être produits et purifiés comme décrit précédemment ^7,9,10.
2. Préparer la solution de germination à X + 1 ml où X est le nombre d'échantillons à prélever au cours de l'essai.
   Remarque: La solution de germination est spécifique aux espèces de bactéries SPORE à l'étude. Pour doser C. difficile la germination des spores, on a utilisé une solution de Tris 10 mM (pH 7,5), NaCl 150 mM, glycine 100 mM , et 10 mM d' acide taurocholique dans de l' eau déminéralisée.
3. Avant de commencer l'essai, prélever un échantillon de la solution de germination 1,0 ml sans spores pour servir de blanc pour la détection de fragments de cortex.
4. Ajouter des spores à une DO ₆₀₀ de 3,0 ~ à la solution de germination et vortexer rapidement.
   Remarque: Pour nos études de germination en B. subtilis, nous avons utilisé le même OD ₆00 spores en tant que de C. difficile.
   Note: Cette quantité de spores a bien fonctionné pour la surveillance du cortex fragment de presse au cours de C. difficile la germination des spores. La quantité de spores utilisée dans cet essai doit être déterminée expérimentalement pour chaque bactérie ou souche.
5. Prélever un échantillon de 1,2 ml immédiatement après l'addition des spores et centrifuger à la température ambiante pendant 1 min à 14 000 x g. Ceci est le point de temps zéro.
6. Transférer 1,0 ml du surnageant de l'échantillon centrifugé à un nouveau tube pour analyse subséquente des fragments de cortex.
   Remarque: Si DPA doivent être surveillés, prélever un échantillon de 100 pi séparé pour la détection de la DPA dans la solution en utilisant un test basé sur la fluorescence de terbium ^9,18,19.
7. Congeler l'échantillon prélevé à -80 ° C.
8. Répétez les étapes 1.4 et 1.5 à intervalles réguliers jusqu'à ce que tous les points de temps terminés.
   Remarque: En raison du temps nécessaire pour la centrifugation et de l'échantillonnage, des points de temps moins th2 min étaient en dehors pas possible lors de notre procédure, de sorte que nos intervalles d'échantillonnage ont été une fois toutes les 2 min pour 14 min.
9. En tant que contrôle positif pour la réduction de la détection du sucre et la quantification, comprennent les montants suivants de N - acétylglucosamine (nmol): 0, 12,5, 25, 50, 100, 250, 500 et 5000. Préparer ces échantillons en même temps que des échantillons de cortex et exécuter en même temps que les échantillons de cortex de telle sorte que la courbe d'étalonnage est pertinente pour les données générées par la germination des spores.
10. Une fois que tous les échantillons de points de temps sont collectées, lyophiliser les échantillons.
    Note: Nous lyophilisée nos échantillons dans 2 ml tubes à bouchon à vis.

2. La mesure Cortex Fragments

1. Remettre en suspension les échantillons lyophilisés dans 120 ul de HCl 3N additionné de 1% de phénol et 0,5% de β-mercaptoéthanol.
2. Transférer les échantillons remis en suspension à 2 ml tubes à bouchon à vis.
   Remarque: Pour la reproductibilité, d'assurer toute l'échantillon lyophilisé est remis en suspension et transféré.
3. Incuber les échantillons dans un bain d'eau de remise en circulation à 95 ° C pendant 4 heures.
4. Après incubation, placer les échantillons sur la glace jusqu'à ce qu'ils sont cool.
5. Neutraliser les échantillons avec 120 pi de NaOH 3 M.
6. Ajouter 80 ul d'une solution de bicarbonate de sodium saturée et de 80 ul d'une solution à 5% d'anhydride acétique à chaque échantillon et vortexer.
7. Incuber les échantillons à température ambiante pendant 10 min.
8. Transférer les échantillons vers le bain C de l'eau à 95 ° C pendant EXACTEMENT 3 min.
   Remarque: Cette étape est temps fois plus sensibles et peuvent affecter le développement du signal en aval.
9. Retirer les échantillons du bain d'eau et refroidir sur glace.
10. Ajouter 400 pi de 6,54% de K ₂ B ₄ O ₇ · 4H ₂ O dans chaque tube et vortexer.
11. Incuber les échantillons dans un bain d'eau de remise en circulation à 95 ° C pendant exactement 7 minutes.
    Remarque: Cette étape est temps fois plus sensibles et peuvent affecter le développement du signal en aval.
12. Retirerles échantillons et les placer sur la glace pendant 5 min.

3. Couleur Réactif

1. Alors que les échantillons sont sur la glace (étape 2.12), préparer le réactif coloré. Dissoudre 0,320 g de p -dimethylaminobenzaldehyde (DMAB, le réactif d'Ehrlich) dans 1,9 ml d'acide acétique glacial.
   Remarque: Le réactif est temps, la température et sensible à la lumière et ne doit pas être fait à l'avance.
2. Après la DMAB se dissout complètement, ajouter 100 pi de N HCl et vortex 10.
3. Ajouter 5 ml d'acide acétique glacial et vortex.

4. Réaction Colorimétrie

1. Transfert 100 ul de chaque échantillon refroidi cortex dans un nouveau tube de 1,5 ml.
2. Ajouter 700 ul de la solution de couleur fraîchement préparé pour chaque échantillon.
3. transférer immédiatement les échantillons dans un bain d'eau C 37 ° et incuber pendant EXACTEMENT 20 min.
4. Transfert 200 ul de chaque échantillon à une plaque de 96 puits clair.
5. Quantifier les échantillons à 585 nm sur une plaquelecteur. Les échantillons doivent commencer à une couleur jaune et une réaction positive se déplacera au violet. Plus cortex présente, plus la couleur pourpre.

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Résultats

Le tableau 1 présente des résultats typiques en utilisant des normes NAG. Les données sont utilisées pour générer une courbe standard. Le tableau 2 montre des résultats typiques d'un essai de germination dans un tampon de germination supplémenté avec de la glycine 100 mM et TA 10 (conditions de germination favorisant) ou mM de glycine 100 uniquement (conditions de non-germination). En l'absence de TA, C. spores Difficile

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Discussion

Lors de la stimulation, les spores subissant le processus de germination perdent leurs propriétés de résistance, sans la nécessité de la synthèse macromoléculaire. Lorsque la germination des spores est déclenchée, le noyau de spores libère DPA en échange d'eau ^2. En raison de la forte teneur en DPA de la spore dormante, le noyau de spores est sous pression osmotique intense et le peptidoglycane spécialisé, cortex, aide à prévenir le noyau de l' enflure en agissant, sans doute, comme un ...

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
2.0 ml screw cap tube	USA scientific	1420-3700
p1000 Eppendorf pipet	Eppendorf
p200 Eppendorf pipet	Eppendorf
p20 Eppendorf pipet	Eppendorf
100 - 1,250 μl pipet tips	VWR	89079-486
1 - 200 μll pipet tips	VWR	89079-458
N-acetyl-D-glucosamine	Sigma	A3286-25G
Hydrochloric Acid - 10 N	BDH-Aristar	BDH3032-3.8LP
Acetic Anhydride	Alfa Aesar	L04295
Sodium Bicarbonate	BDH	BDH0280-500G
Potassium Tetraborate tetrahydrate	Alfa Aesar	39435
Sodium Hydroxide	BDH	BDH8019-500G
4-(Dimethylamino)benzaldehyde	Sigma	156477-100G
Saturated Phenol	Fisher	BP1750-400
2-Mercaptoethanol	Aldrich	M6250-100ML
SpectraMax M3	Molecular Devices
Acetic Acid, Glacial	BDH	BDH3098-3.8LP
Heated, Circulating Water Bath	VWR Scientific	Model 1136
Microtest 96	Falcon	353072	96 well clear tissue culture plates
Culture tubes	VWR	89000-506
Lyophilizer
Heat Blocks
Vortex Machine