Bakteriyel Spor Filizlenmesinin sırasında Cortex Fragments algılama

Özet

Herein, we describe a colorimetric assay to detect the presence of reducing sugars during bacterial spore germination.

Özet

The process of endospore germination in Clostridium difficile, and other Clostridia, increasingly is being found to differ from the model spore-forming bacterium, Bacillus subtilis. Germination is triggered by small molecule germinants and occurs without the need for macromolecular synthesis. Though differences exist between the mechanisms of spore germination in species of Bacillus and Clostridium, a common requirement is the hydrolysis of the peptidoglycan-like cortex which allows the spore core to swell and rehydrate. After rehydration, metabolism can begin and this, eventually, leads to outgrowth of a vegetative cell. The detection of hydrolyzed cortex fragments during spore germination can be difficult and the modifications to the previously described assays can be confusing or difficult to reproduce. Thus, based on our recent report using this assay, we detail a step-by-step protocol for the colorimetric detection of cortex fragments during bacterial spore germination.

Giriş

Endosporlar metabolik bakteriler olumsuz ortamlarda devam izin bakterilerin uyuyan biçimleridir. Birçok spor oluşturan Bakterilerde Spor Oluşumu besin maddesinde yoksun kalma ile indüklenen, ancak bu işlem, oksijen ve diğer streslere ¹ pH, maruz değişiklikleri ile kontrol edilebilir. Onların metabolik dormant spor formunda iken, bakteri, UV radyasyonu, kuruma, yüksek sıcaklıklarda ve ² dondurma karşı. Sporlanma sürecine bilginin çoğu model organizma çalışmalarda, Bacillus geliyor. Sporlanma süreci DNA replikasyonu ve eksenel flamanlı ^3,4 oluşumu ile başlar. Asimetrik septum daha sonra iki eşitsiz boyutlu bölmeye hücreyi böler. Daha büyük bölme, ana hücresi, küçük bölmesini, forespore engulfs. anne hücresi ve Dorman bırakmadan, sporu ve sonunda lyses anne hücreyi olgun gen ifadesini koordine forespore Hemçevreye ¹ içine t spor.

spor yapısı ve bileşimi birçok bakteri türleri boyunca muhafaza edilir. Spor çekirdek vejetatif hücrenin daha düşük bir su içeriğine sahiptir ve dipikolinik asit (DPA) ^1,2 ile zengindir. spor oluşumu sırasında, DPA su karşılığında spor iç kısım içine pompalanır. Çekirdeği çevreleyen en sporlu bakterilerin, çimlenme (germinants) uyaran küçük moleküller tanıyan reseptörleri ² bulunduğu, bir iç spor bir zardır. Sadece spor iç zarının dışında bulunan hücre duvarı peptidoglikan bir tabakadır. Bir uzman peptidoglikan tabakanın (korteks) hücre duvarı peptidoglikan çevreleyen ve [N-asetilglukosamin (NAG) ve N-asetilmuramik asit (NAM) alternatif] hücre duvarı peptidoglikan aynı bileşenlerin çoğu oluşmaktadır. Bununla birlikte, korteks NAM tortularının yaklaşık olarak% 50 muramic-δ-laktam ^5,6 dönüştürülmüş Yukarı. spor çimlenme sırasında bu muramic-δ-laktam artıkları böylece korteks değil hücre duvarı (çimlenme tamamlamak için gerekli bir süreç) bozulmuş sağlayan, spor korteks parçalayıcı enzimlerin (SCLEs) tarafından kabul edilmektedir. Korteksi çevreleyen bir dış zar ve kaplama proteinlerinin ² birkaç kat olduğunu.

çimlenme sürecini kontrol sporlu bakteriler için büyük önem taşımaktadır. Filizlenen reseptörler kendi germinants ² etkileşimde bulunduğunuzda Çimlenme başlatılır. Birçok spor oluşturan bakteri, bu germinants ² olan amino asitler, şekerler, nükleotid, iyon ya da bunların kombinasyonları bulunmaktadır. C difficile spor çimlenmesi bazı safra asitleri [örneğin, taurokolik asit (TA)] ve amino asitler (örneğin, glisin) ^7-10 kombinasyonları ile başlatılır. C arasında farklılıklar olmasına rağmen difficile çimlenme yolu ve okudu yolların diğer sporluörneğin B. bakteriler, subtilis, tüm ortak bir vejetatif hücre çimlenmiş sporun ^2,8 büyümeye izin spor korteksi düşmesine mutlak bir gerekliliktir. Ya SLEC (B. subtilis içinde bulunduğu gibi) (birçok Clostridia bulunduğu gibi) Korteks bozunma SCLEs CwlJ / SleB ile gerçekleştirilebilir. Korteks hidroliz hücre duvarı ve sporun üzerinde kısıtlama azaltır. Bu, tam çekirdek rehidrasyon, hücre metabolizması ² için gerekli olan proteinlerin birçok yeniden aktive gerekli bir adım için izin verir.

Sporların filiz olduğunda, bir faz-karanlık durumu ve bu işlem için bir faz parlak durumundan atıl spor değişiklikleri 600 optik yoğunluk (OD) bir değişiklik ile ölçülebilir nm ^11. Bir önceki raporda OD bu değişimin çok sporla ¹² DPA salınımına bağlı olduğunu göstermektedir. Bizim son çalışma sırasında, biz C. zamanlamasını karşılaştırmak için çalıştı difficile spor çimlenmesi ve izlenenDPA ve korteks parçalarının ⁹ sürümü. Onlar sporlar çimlenme tarafından piyasaya sürülecek başladı bu çalışma için korteks parçalarının serbest bırakılmasını izlemek için önemliydi.

Burada kullanılan kolorimetrik deney indirgeyici uçları olan şekerleri tespit etmek için bir yöntem dayanmaktaydı Ghuysen ve ark., ¹³ geliştirilmiştir. Diğerleri indirgen şekerlerin ¹⁴ tespiti için protokoller tarif etmişlerdir ya da bu protokolleri ¹⁵ modifiye Çünkü, bu konuda literatür kafa karıştırıcı olabilir. Burada, C çimlenme kurtuldu indirgeyici şekerlerin kolorimetrik tespiti için detay bir adım-adım yöntemi biz difficile sporlarının. Bu çalışmada C kullanır rağmen difficile sporları, diğer sporlu bakterilerden sporların çimlenmesi sırasında salınan indirgeyici şekerler bu protokol ^9,16,17 ile tespit edebiliyoruz.

Protokol

1. Yaratma Örnekleri

1. Isı C etkinleştirmek difficile buz üzerinde 30 dakika ve mağaza 65 ° C sıcaklıkta sporlar.
   Not: C Daha önce tarif edildiği gibi ^7,9,10 difficile sporlarının üretilir ve saflaştırılabilir.
2. X, numune sayısı deneyi sırasında alınması gereken x + 1 ml çimlenme çözeltisi hazırlayın.
   Not: bakteri türlerinin çalışılan spor için çimlenme çözüm özgüdür. C içlin difficile spor çimlenmesi biz, 10 mM Tris (pH 7.5), 150 mM NaCI, deiyonize su içinde 100 mM glisin, 10 mM taurokolik asidin bir çözeltisi kullanılır.
3. tahlili başlamadan önce, korteks fragmanı tespiti için bir boş olarak hizmet etmek için sporların filizlenmeyi çözeltisi bir 1.0 mi bir numune alın.
4. Bir OD hızla çimlenme çözüm ve vorteks ~ 3,0 ₆₀₀ sporlar ekleyin.
   Not: B bizim çimlenme araştırmalar için subtilis aynı OD kullanılan ₆C gibi 00 sporlar difficile.
   Not: sporların Bu miktar C sırasında izleme korteks fragmanı serbest bırakılması için çalıştı difficile spor çimlenmesi. Bu tahlilde kullanılan sporların miktarı, her bir bakteri ya da bir suş için deneysel olarak tespit edilmelidir.
5. Hemen 14,000 x g'de 1 dakika için oda sıcaklığında sporlar ve santrifüj ilave edildikten sonra 1.2 ml lik bir numuneyi çıkarın. Bu sıfır zaman noktasıdır.
6. daha sonra korteks fragmanı analizleri için yeni bir tüpe için santrifüj numuneden süpernatan 1.0 mL aktarın.
   Not:, terbium floresan ^9,18,19 dayanan bir deney kullanılarak çözelti içinde DPA tespiti için ayrı bir 100 ul numuneyi çıkar DPA izlenecek gerekirse.
7. -80 ° C'de toplanan örnek dondurun.
8. Tüm zaman noktalarında tamamlanana kadar tekrarlayın düzenli aralıklarla 1.4 ve 1.5 adımları tekrarlayın.
   Not: Zaman santrifüj ve örnekleme, zaman noktaları daha az inci için gerekli olduğundanBir 2 dk dışında bizim işlem sırasında mümkün değildi, bu yüzden bizim örnekleme aralıkları kez 14 dakika boyunca her 2 dk.
9. 0, 12.5, 25, 50, 100, 250, 500 ve 5000: Şeker saptanması ve nicelenmesi azaltmak için pozitif bir kontrol olarak, N -acetylglucosamine (nmol) aşağıdaki miktarlarda bulunur. korteks örneklerinde olduğu gibi aynı zamanda bu örnekleri hazırlamak ve standart eğri sporlarını çimlenme tarafından oluşturulan verilere uygun olacak şekilde korteks örnekleri ile birlikte çalışacak.
10. her zaman nokta örnekleri toplandıktan sonra, numune liyofilize.
    Not: 2 ml vidalı kapaklı tüplerde bizim örnekleri dondurularak.

2. Cortex Fragments Ölçme

1. % 1 fenol ve% 0.5 β-merkaptoetanol ile takviye edilmiş, 3 N HCI, 120 ul Liyofilize edilen numuneler, yeniden süspanse edin.
2. 2 ml'lik vidalı kapaklı tüplere yeniden süspanse örnekleri aktarın.
   Not: tekrarlanabilirlik için, tüm liyofilize numune yeniden süspanse ve transfer edildiğinden emin olun.
3. 4 saat 95 ° C de bir devri daim su banyosu içinde inkübe edin.
4. serin kadar inkübasyondan sonra, buz üzerinde örnekleri yerleştirin.
5. 3 M NaOH 120 ul örnekleri nötralize eder.
6. doymuş sodyum bikarbonat çözeltisi 80 ul her bir örnek ve vorteks bir% 5 asetik anhidrid çözeltisi 80 ul ekle.
7. 10 dakika oda sıcaklığında inkübe edin.
8. TAM 3 dakika boyunca geri 95 ° C su banyosunda örnekleri aktarın.
   Not: Bu adım hassas ve daha uzun süreler aşağı sinyal gelişimini etkileyebilir zamanıdır.
9. su banyosu örnekleri çıkarın ve buz üzerinde soğutun.
10. Her bir tüp ve vorteks 6.54% K ₂ B ₄ O ₇ · 4H ₂ O 400 ul ekleyin.
11. Tam olarak, 7 dakika boyunca 95 ° C de bir devri daim su banyosu içinde inkübe edin.
    Not: Bu adım hassas ve daha uzun süreler aşağı sinyal gelişimini etkileyebilir zamanıdır.
12. Kaldır5 dakika boyunca buz üzerinde örnekleri ve yer.

3. Renk reaktifi

1. Numuneler buz (Adım 2.12) üzerinde iken, renk reaktifi hazırlamak. (; Ehrlich reaktifi DMAB) buzlu asetik asit, 1.9 ml p -dimethylaminobenzaldehyde 0.320 gr eritin.
   Not: reaktif zaman, sıcaklık ve ışığa karşı hassastır ve önceden yapılmamalıdır.
2. DMAB tamamen erir sonra, 10 N HCI ve vorteks 100 ul ekleyin.
3. buzlu asetik asit ve girdap 5 ml.

4. kolorimetrik reaksiyon

1. Aktarım, her 100 ul yeni bir 1.5 ml mikrosantrifüj tüpüne korteks numunenin soğutuldu.
2. Her bir numune için taze hazırlanmış renk çözeltisi 700 ul ekleyin.
3. Derhal bir 37 ° C su banyosuna örnekleri transferi ve tam olarak 20 dakika süreyle inkübe edin.
4. berrak bir 96 oyuklu plakaya her bir numune 200 ul aktarın.
5. bir plaka üzerinde 585 nm'de numune sayısal olarakokuyucu. Numuneler bir sarı renk başlamalıdır ve pozitif bir reaksiyon mor kayacak. Daha fazla korteks mevcut, derin mor renk.

Sonuçlar

Tablo 1 NAG standartlarını kullanarak tipik sonuçları göstermektedir. Veriler, standart bir eğri oluşturmak için kullanılmaktadır. Tablo 2, 100 mM glisin, 10 mM TA (çimlenme arttıran koşullarda) ya da 100 mM glisin, sadece (non-çimlenen koşullar) ile takviye edilmiş tampon çimlenme bir çimlenme deneyinde tipik sonuçlan göstermektedir. Ta, C. yokluğunda difficile sporlar çimlenir yoktur ve çözeltide korteks parça...

Tartışmalar

stimülasyon üzerine çimlenme süreci geçiren sporları makromoleküler sentez için gerek kalmadan kendi direnç özelliklerini kaybederler. Spor çimlenmesi tetiklendiğinde, spor çekirdek su ² karşılığında DPA serbest bırakır. Nedeniyle atıl sporun yüksek DPA içeriğine, spor çekirdek genişleme ² önünde bir engel olarak, muhtemelen, hareket ederek şişme çekirdek engeller yoğun olarak ozmotik basınç ile özel bir peptidoglikan, korteks altındadır.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
2.0 ml screw cap tube	USA scientific	1420-3700
p1000 Eppendorf pipet	Eppendorf
p200 Eppendorf pipet	Eppendorf
p20 Eppendorf pipet	Eppendorf
100 - 1,250 μl pipet tips	VWR	89079-486
1 - 200 μll pipet tips	VWR	89079-458
N-acetyl-D-glucosamine	Sigma	A3286-25G
Hydrochloric Acid - 10 N	BDH-Aristar	BDH3032-3.8LP
Acetic Anhydride	Alfa Aesar	L04295
Sodium Bicarbonate	BDH	BDH0280-500G
Potassium Tetraborate tetrahydrate	Alfa Aesar	39435
Sodium Hydroxide	BDH	BDH8019-500G
4-(Dimethylamino)benzaldehyde	Sigma	156477-100G
Saturated Phenol	Fisher	BP1750-400
2-Mercaptoethanol	Aldrich	M6250-100ML
SpectraMax M3	Molecular Devices
Acetic Acid, Glacial	BDH	BDH3098-3.8LP
Heated, Circulating Water Bath	VWR Scientific	Model 1136
Microtest 96	Falcon	353072	96 well clear tissue culture plates
Culture tubes	VWR	89000-506
Lyophilizer
Heat Blocks
Vortex Machine