检测皮质片段在细菌孢子萌发

摘要

Herein, we describe a colorimetric assay to detect the presence of reducing sugars during bacterial spore germination.

摘要

The process of endospore germination in Clostridium difficile, and other Clostridia, increasingly is being found to differ from the model spore-forming bacterium, Bacillus subtilis. Germination is triggered by small molecule germinants and occurs without the need for macromolecular synthesis. Though differences exist between the mechanisms of spore germination in species of Bacillus and Clostridium, a common requirement is the hydrolysis of the peptidoglycan-like cortex which allows the spore core to swell and rehydrate. After rehydration, metabolism can begin and this, eventually, leads to outgrowth of a vegetative cell. The detection of hydrolyzed cortex fragments during spore germination can be difficult and the modifications to the previously described assays can be confusing or difficult to reproduce. Thus, based on our recent report using this assay, we detail a step-by-step protocol for the colorimetric detection of cortex fragments during bacterial spore germination.

引言

芽孢是细菌代谢，使细菌在不利的环境中坚持的休眠形式。在许多孢子形成细菌，孢子形成是通过营养剥夺诱导但此过程可通过改变pH值，暴露于氧或其它应力¹进行控制。而在其代谢休眠孢子形式，细菌抵抗紫外线辐射，干燥，更高的温度，和冷冻^2。最上的孢子形成过程的知识来自在模式生物的研究， 枯草芽孢杆菌 。在孢子形成过程开始于DNA复制和轴向灯丝^3,4的形成。非对称隔膜然后把细胞分成两个大小不等车厢。较大的隔间里，母细胞，吞噬较小的隔间里，forespore。无论是母细胞和forespore协调基因表达成熟的孢子母细胞裂解最终，释放多尔曼吨孢子到周围环境中^1。

孢子的结构和组合物在许多细菌物种保守的。孢子芯具有比营养细胞低水含量和有丰富的吡啶二羧酸^{（DPA）1,2。}期间形成孢子，DPA被泵入孢子芯换取水。围绕核心的是一种内在的孢子膜的地方，在多数孢子形成的细菌，其中认识到刺激发芽（germinants）的小分子的受体位于^2。刚好位于孢子的内膜外是细胞壁肽聚糖的层。一个专门的肽聚糖层（皮层）围绕细胞壁肽聚糖，并且由许多相同的部件，细胞壁肽聚糖[交替的N-乙酰葡糖胺酶（NAG）和N-乙酰胞壁酸（NAM）]的。但是，在皮质的NAM残基的约50％已被转化为胞壁-δ内酰胺^5,6- 。期间孢子萌发，这些胞壁-δ内酰胺残基被孢子皮质裂解酶（SCLEs）的认可，因此允许皮质被降解但不细胞壁（必需完成发芽过程）。周围皮质的外膜和外壳蛋白²几层。

控制发芽的方法对于形成孢子的细菌至关重要。当开端受体各自germinants ²交互萌发开始。在许多孢子形成的细菌，这些germinants是氨基酸，糖，核苷酸，离子或它们的²组合。C.难辨孢子萌发是由某些胆汁酸，[ 例如 ，牛磺胆酸（TA）]和氨基酸（ 例如 ，甘氨酸^）7-10的组合引发。虽然有在C之间的差异难辨发芽途径和在所研究的途径其他孢子形成细菌，如B.枯草芽孢杆菌，共同所有的降解孢子皮质以允许营养细胞以从发芽孢子^2,8成长的绝对要求。皮质降解可由SCLEs CwlJ / SleB来实现或SLEC（如在枯草芽孢杆菌中发现）（如在许多梭菌找到）。皮质水解降低了细胞壁和孢子的约束。这允许充分芯补液，在重新激活许多必需的细胞代谢²蛋白质的一个必要步骤。

当孢子发芽，从相亮状态到相暗状态，这个过程的休眠孢子的变化可以通过在600光密度（OD）的变化来测量 纳米^11。先前的一份报告表明，在很多OD这一变化是由于DPA从¹²孢子释放。在我们最近的研究中，我们试图比较C的定时难辨孢子萌发和监测DPA和皮质碎片⁹的释放。在这项研究中是至关重要的监测皮质片段的释放，他们开始由萌芽孢子被释放。

此处所使用的比色测 ​​定法是基于与还原末端检测糖的方法开发Ghuysen 等 ^13。因为其他人描述协议检测还原糖¹⁴或修改这些协议^15，关于这一问题的文献可能会造成混淆。在这里，我们详细地一步一步方法还原糖的比色检测从发芽C.解放艰难梭菌芽孢。虽然本研究采用C.艰难梭菌芽孢，从其他孢子形成的细菌孢子的发芽过程中释放的还原糖能够与该协议^9,16,17进行检测。

研究方案

1.生成样本

1. 热激活C.难辨孢子在65℃下30分钟，并存储在冰上。
   注:C.如先前^7,9,10所述艰难梭菌芽孢可以产生并纯化。
2. 准备在X + 1毫升，其中X是在测定期间要采取的样本数萌发溶液。
   注意:萌发溶液是特定细菌的物种孢子正在研究中。用于测定C.难辨孢子萌发，我们使用的10mM Tris（pH值7.5），150毫摩尔NaCl，在去离子水中的100mM甘氨酸和10mM牛磺胆酸的溶液。
3. 在开始测定前，画出萌发溶液中的1.0 ml样品无孢子作为皮质片段检测空白。
4. 加入孢子的外径〜3.0发芽解决方案，并迅速涡旋_600。
   注意:如果您在B.萌发研究枯草芽孢杆菌 ，我们使用相同的外径₆00孢子为C.难辨 。
   注:孢子这一数额C.期间行之有效的监测皮质片段发布难辨孢子萌发。孢子在该试验中所使用的量应通过实验为每个细菌或应变来确定。
5. 在14000×g下加入孢子和离心机在室温下1分钟后，立即删除在1.2 ml样品。这是在零时间点。
6. 传送将1.0ml上清液从离心样品到新管用于随后皮质片段分析。
   注意:如果DPA需要监控，取出一个单独的100微升样品在使用基于铽荧光^9,18,19的测定溶液中的检测DPA的。
7. 冷冻在-80℃下收集的样品。
8. 定期重复步骤1.4和1.5，直到所有的时间点完成。
   注:由于时间的关系所需的离心和取样时间点少次我们的过程期间的2分钟分开是不可能的，所以我们的采样间隔是一次14分钟每2分钟。
9. 至于还原糖的检测和定量阳性对照，包括以下少量的正 -acetylglucosamine（纳摩尔）的:0，12.5，25，50，100，250，500，5000。同时作为皮质样品制备这些样品，并与皮质样品，使得标准曲线是有关由萌芽孢子产生的数据一起运行。
10. 所有时间点样品的采集后，冻干样品。
    注意:我们冻干我们的样品在2ml螺旋盖试管中。

2.测量皮质碎片

1. 在3当量盐酸的120微升补充有1％的苯酚和0.5％β巯基乙醇悬浮冻干样品。
2. 传送再悬浮样本以2毫升螺旋盖试管中。
   注意:对于重复性，确保所有的冻干样品重悬于和转让。
<利>孵育再循环水浴将样品在95℃下4小时。
3. 孵育后，将样品置于冰上，直到他们都很酷。
4. 用120微升3 M氢氧化钠的中和样品。
5. 添加80μl的饱和碳酸氢钠溶液和80μl的5％的乙酸酐溶液于每个样品和旋涡。
6. 在室温下孵育样品10分钟。
7. 转移样本回95℃水浴正好3分钟。
   注意:此步骤是时间敏感的和更长的时间能影响下游信号的发展。
8. 从水浴中取出样品，并在冰上冷却。
9. 添加6.54％K ₂ B ₄ O _{7·4H 2} O 400微升，每管和旋涡。
10. 孵育在再循环水浴将样品在95℃EXACTLY 7分钟。
    注意:此步骤是时间敏感的和更长的时间能影响下游信号的发展。
11. 去掉样品，并在冰上地方5分钟。

3.显色剂

1. 虽然样本上冰（步骤2.12），备显色剂。溶解0.320克对 -dimethylaminobenzaldehyde的; 1.9毫升冰醋酸的（DMAB埃利希氏试剂）。
   注:试剂是时间，温度和光敏感，并且不应提前进行。
2. 在DMAB完全溶解后，加入100微升10 N HCl和旋涡。
3. 加入5毫升冰醋酸和旋涡。

4.显色反应

1. 转移100μl的每个冷却皮质样品到一个新的1.5 ml离心管。
2. 添加新鲜制备的色溶液至各样品的700微升。
3. 立即将样品转移到37℃水浴中孵育整整20分钟。
4. 转移200μl的各样品，以清晰的96孔板中。
5. 在量化波长585样本一盘读者。样本应开始以黄色和阳性反应将转向紫色。越皮质目前，较深的紫色。

结果

表1示出了使用NAG标准的典型结果。数据被用于产生标准曲线。 表2示出从发芽缓冲器萌发测定补充有100mM的甘氨酸和10mM TA（发芽促进条件）或100mM的甘氨酸只（非发芽条件）的典型结果。在不存在TA，C的艰难梭菌芽孢不发芽并且在皮质片段在溶液中存在的小的变化。然而，在这两个TA和甘氨酸，C的存在艰难梭菌芽孢发芽...

讨论

在刺激时，进行发芽的过程孢子丧失其抗损伤性，而无需大分子合成。当孢子萌发被触发时，孢子释放核心DPA，以换取水^2。由于休眠孢子的高DPA含量，孢子核心是在强烈渗透压和专门肽，皮质，有助于防止芯从通过作用，据推测，作为屏障，以扩张²肿胀。

上述的方法使用艾氏试剂（黄色溶液），以检测还原糖作为可测量的移位到紫色色调的存在。期间皮质?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
2.0 ml screw cap tube	USA scientific	1420-3700
p1000 Eppendorf pipet	Eppendorf
p200 Eppendorf pipet	Eppendorf
p20 Eppendorf pipet	Eppendorf
100 - 1,250 μl pipet tips	VWR	89079-486
1 - 200 μll pipet tips	VWR	89079-458
N-acetyl-D-glucosamine	Sigma	A3286-25G
Hydrochloric Acid - 10 N	BDH-Aristar	BDH3032-3.8LP
Acetic Anhydride	Alfa Aesar	L04295
Sodium Bicarbonate	BDH	BDH0280-500G
Potassium Tetraborate tetrahydrate	Alfa Aesar	39435
Sodium Hydroxide	BDH	BDH8019-500G
4-(Dimethylamino)benzaldehyde	Sigma	156477-100G
Saturated Phenol	Fisher	BP1750-400
2-Mercaptoethanol	Aldrich	M6250-100ML
SpectraMax M3	Molecular Devices
Acetic Acid, Glacial	BDH	BDH3098-3.8LP
Heated, Circulating Water Bath	VWR Scientific	Model 1136
Microtest 96	Falcon	353072	96 well clear tissue culture plates
Culture tubes	VWR	89000-506
Lyophilizer
Heat Blocks
Vortex Machine