طريقة سريعة والمبسطة لارتفاع العزلة من خلال وضع-من ميرنا من نظافة البروتين الدهني عالي الكثافة

Summary

الرنا الميكروية تلعب الدور التنظيمي المهم والناشئة كأهداف علاجية جديدة لمختلف الأمراض التي تصيب الإنسان. وقد تبين أن تتم miRNAs في البروتينات الدهنية عالية الكثافة. لقد قمنا بتطوير طريقة مبسطة لعزل بسرعة HDL النقي مناسبة لتحليل ميرنا من البلازما البشرية.

Abstract

Small non-coding RNAs (miRNAs) have been implicated in a variety of human diseases including metabolic syndromes. They may be utilized as biomarkers for diagnosis and prognosis or may serve as targets for drug development, respectively. Recently it has been shown that miRNAs are carried in lipoproteins, particularly high density lipoproteins (HDL) and are delivered to recipient cells for uptake. This raises the possibility that miRNAs play a critical and pivotal role in cellular and organ function via regulation of gene expression as well as messenger for cell-cell communications and crosstalk between organs. Current methods for miRNA isolation from purified HDL are impractical when utilizing small samples on a large scale. This is largely due to the time consuming and laborious methods used for lipoprotein isolation. We have developed a simplified approach to rapidly isolate purified HDL suitable for miRNA analysis from plasma samples. This method should facilitate investigations into the role of miRNAs in health and disease and in particular provide new insights into the variety of biological functions, outside of the reverse cholesterol transport, that have been ascribed to HDL. Also, the miRNA species which are present in HDL can provide valuable information of clinical biomarkers for diagnosis of various diseases.

Introduction

MicroRNAs are endogenous non-coding tiny RNA species that are highly conserved and are considered key players in the regulation of various biological processes by degrading or repressing specific target messenger RNAs¹. Because miRNAs act intracellularly they have been explored as tissue-derived biomarkers which led to the discovery of tissue-specific functions of these miRNA. However, miRNAs are also found extracellularly either associated with proteins or in exosomes/micro vesicles that effectively can shield them from degradation by extracellular RNases². More recent studies have shown that the protective effect of HDL may not be closely linked to its capability to promote cholesterol efflux but rather to its non-cholesterol cargo, in particularly as a circulating miRNAs carrier ^{3, 4}. These miRNAs may not only modulate lipid metabolism but are also associated with anti-inflammatory, antioxidant and antithrombotic effects of the HDL-miRNA complex ^{5, 6}.

To further explore the role of miRNAs carried in HDL particles, a simple and easy protocol needs to be established for miRNA extraction from isolated highly purified HDL for use in clinical routine. Numerous methods have been described to isolate HDL. These methods are either very time consuming or require large volume of plasma that may require sample pooling, extensive dialysis for desalting isolated lipoproteins and they do not completely remove exosomes as a source of miRNAs³, respectively. Here we describe a simple and rapid method that can isolate miRNA from highly purified HDL utilizing small volume of blood samples on a larger scale. We believe that this method may serve as good reference to promote research into the role of circulating miRNAs and in particular the role of HDL in facilitating communication between various cells and organs.

Protocol

1. جمع عينات الدم

1. جمع الصيام عينات من الدم الوريدي المحيطية إلى 10 مل الأنابيب البلاستيكية التي تحتوي على حمض تخثر Ethylenediaminetetraacetic (EDTA) (التي لديها العديد من المزايا أكثر من مضادات التخثر الأخرى) من خلال بزل الوريد القياسية من الوريد بارز في الحفرة المرفقية.
2. أجهزة الطرد المركزي لعينات الدم في 1600 x ج لمدة 20 دقيقة على 4 درجات مئوية في جهاز للطرد المركزي الطاولة للحصول على البلازما خالية من خلايا الدم الحمراء وكميات صغيرة من الحمض النووي الريبي.
3. بالتتابع أجهزة الطرد المركزي لطاف في 3000 غ (4 درجة مئوية) في الدلو المتأرجح الدوار لمدة 10 دقيقة لإزالة WBC والصفائح الدموية ومن ثم إضافي 15 دقيقة لإزالة الحطام الخلية المتبقية على التوالي.
4. قياس كثافة البلازما باستخدام مقياس الكثافة في RT حسب تعليمات التصنيع.
   ملاحظة: تعديل كثافة (د = 1.023 جم / مل) مع 0.9٪ محلول ملحي قد تكون هناك حاجة بعد إزالة exosomes ولكن قبل تنبيذ فائق الكثافة التدرج.

2. إزالة Exosome من البلازما

1. إزالة exosomes المتداولة التي لها كثافة مماثلة لHDL، وتمثل مصدرا هاما من الناحية الكمية من ميرنا ^3.
   1. القيام بذلك عن طريق إضافة 252 ميكرولتر حل exosome هطول الأمطار إلى 1 مل البلازما تليها الحضانة لمدة 30 دقيقة على 4 درجات مئوية. لتكوير خارج exosomes، الطرد المركزي الخليط لمدة 30 دقيقة في 1500 غرام عند 4 درجات مئوية.
   2. لعزل HDL، نقل 1 مل من طاف مما أدى إلى البولي سميكة الجدران أنبوب نابذة لمزيد من المعالجة مع تنبيذ فائق التدرج الكثافة (أنظر أدناه).

3. التدرج الكثافة تنبيذ فائق (الشكل 1).

1. لفصل HDL استخدام 3 خطوة عملية توظيف نابذة أرضية مع الدوار زاوية ثابتة تعمل على 448811 س G و 8 درجة مئوية، على التوالي.
2. إعداد ثلاثة حلول مختلفة الكثافة بالتتابع وجديدة لكل العزلة.
   1. إعداد الحل ألف (عزل VLDL، د = 1.006 جم / مل) عن طريق إذابة 11.4 غرام كلوريد الصوديوم (كلوريد الصوديوم: 0.195 مول)، 0.1 غرام EDTA2Na و 1 مل 1N هيدروكسيد الصوديوم في 1000 مل من الماء المقطر تعقيمها. ثم إضافة 3 مل إضافية من المياه وتعقيمها المقطر.
   2. إعداد الحل ب (عزل LDL، د = 1.182 جم / مل) وذلك بإضافة 25.2 غرام NaBr إلى 100 مل من محلول ألف (كلوريد الصوديوم 0.195 مول، NaBr 2.44 مول).
   3. إعداد الحل C (عزل HDL، د = 1.470 جم / مل) عن طريق خلط 78.8 غرام NaBr مع 100 مل من محلول ألف (كلوريد الصوديوم 0.195 مول، NaBr 7.7 مول). تأكيد الكثافة المناسبة في RT باستخدام جهاز قياس شدة الضوء. إبقاء جميع الحلول في 4 درجات مئوية حتى استخدامها مرة أخرى.

4. عزل VLDL

1. خلط 1 مل من البلازما (متوسط ​​الكثافة = 1.023 جم / مل)، ونوكلياز حرة 200 ميكرولتر من الدهون الأحمر 7B في أنبوب نابذة 6.5 مل البولي سميكة الجدران.
2. ثم طبقة بعناية 5 مل من محلول وعلى أعلى من الخليط. إذا لزم الأمر، إضافة إضافي الدهون الأحمر 7B على رأس حل تيس موازنة وزن كل أنبوب. أجهزة الطرد المركزي لمدة 2 ساعة (التسارع - 5)، (التباطؤ - 7).
   ملاحظة: أثناء الطرد المركزي، يتم تجميع البروتينات الدهنية والفرقة في مناطق الكثافة توازنها.
3. في نهاية المدى مراقبة 2 طبقات. إزالة 1.5 مل من الكسر VLDL يمثلون الطبقة العليا وتخزينها في 4 درجات مئوية.
4. وأخيرا، وذلك باستخدام ماصة نقل 4 مل من أسفل الأنبوب الذي يحتوي على LDL، HDL، الزلال والحامض الدهني جزء من أنبوب البولي الجديد لعزل LDL.

5. عزل LDL

1. مزيج 2 مل من محلول B و 100 نوكلياز ميكرولتر خالية من الدهون الأحمر 7B إلى الأنبوب الذي يحتوي على LDL و HDL جزء (القسم 4)، على التوالي.
2. ثم الطرد المركزي من ل3 ساعات (تسارع 9، تباطؤ 7). بعد ذلك، قم بإزالة 1.5 مل من الكسر LDL يمثلون الطبقة العليا والحفاظ على 4 درجات مئوية أو مخزن في -80 درجة مئوية. وأخيرا، ونقل 4 مل من أسفل الأنبوب الذي يحتوي على HDLجزء من أنبوب البولي الجديد.

6. عزل HDL

1. مزيج 2 مل من محلول C، 100 نوكلياز ميكرولتر خالية من الدهون الأحمر 7B و 15 ميكرولتر من 98٪ β-المركابتويثانول إلى الأنبوب الذي يحتوي على نسبة HDL، على التوالي.
2. الطرد المركزي لمدة 3 ساعات (تسارع 9، تباطؤ 7). بعد ذلك إزالة 2 مل من الكسر HDL يمثلون الطبقة العليا وإما الحفاظ على 4 درجات مئوية أو مخزن في -80 درجة مئوية.

7. تحلية وتركيز البروتين الدهني الكسور

1. لتجنب التداخل مع احق الكهربائي للهلام الاغاروز وPCR، وإزالة الملح الزائد وأضاف خلال تنبيذ فائق الكثافة التدرج باستخدام أجهزة الطرد المركزي فلتر مع قطع الوزن الجزيئي المناسب (أنبوب 3K لVLDL وأنبوب 10K ل LDL / HDL) كما وصفها تعليمات الشركة الصانعة.
   1. لفترة وجيزة، بعد إضافة 2.5 مل PBS الباردة (137 ملي مول كلوريد الصوديوم، 2.7 ملي بوكل، 8 ملي Na2HPO4، 2 مم KH2PO4، ودرجة الحموضة 7.4) centrifuجنرال الكتريك VLDL جزء كامل جمعت خلال التدرج الكثافة تنبيذ فائق في 4 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة باستخدام الدوار الدلو المتأرجح.
   2. تحلية جزء LDL مرتين مع 10 مل الجليد الباردة برنامج تلفزيوني لمدة 30 دقيقة لكل منهما. بعد ذلك، استخدم 13 مل الجليد الباردة PBS مرتين لتحلية جزء HDL. حجم برنامج تلفزيوني العالي ضروري لتحسين التنقل مع الكهربائي للهلام الاغاروز. بعد الطرد المركزي، وإزالة البروتين الدهني يحتوي على الأملاح والحفاظ على 4 درجات مئوية أو تخزينها في -80 درجة مئوية.

8. الاغاروز جل الكهربائي

1. Perfrom البروتين الدهني الاغاروز الكهربائي للهلام توظيف عدة مع تعديلات طفيفة من إرشادات الشركة المصنعة على النحو التالي.
   ملاحظة: هذه الخطوة هي فقط لتقييم جودة ونقاء عينات البروتين الدهني المركزة.
   1. لفترة وجيزة، الحصول على 6 ميكرولتر من الكسر البروتين الدهني المحلاة مع تنبيذ فائق الكثافة التدرج وتحميل على جل البروتين الدهني مسبقة الصب. استخدام lipop الإنسانمعايير rotein لVLDL، LDL و HDL كمرجع الحجم. تنفيذ الكهربائي في RT على 100 فولت لمدة 60 دقيقة باستخدام عازلة النائب الإعدادية.
   2. يجف الجل لمدة 10 دقيقة وبعد ذلك وصمة عار لمدة 10 دقيقة في RT مع الدهون الأحمر 7B. يزيل اللون هلام في خليط من الميثانول في الماء 75:25 (ت / ت) والجافة مرة أخرى لمدة 5 دقائق.

9. استخراج الحمض النووي الريبي وتنقية

1. Perfrom عزل ميرنا بواسطة HDL البشري النقي باستخدام عدة المصل / البلازما ميرنا العزل والتنقية.
   1. لفترة وجيزة، إضافة 1 مل من الحمض النووي الريبي تحلل الكاشف 200 ميكرولتر من HDL النقى الاختلاط مع vortexer ثم حضنت لمدة 5 دقائق على RT لضمان التفكك الكامل للمجمعات البروتين النووي وتثبيط RNases.
   2. ثم ارتفاع 3.5 ميكرولتر من الاصطناعية انواع معينة ايليجانس الرنا الميكروي (سل-مير-39؛ 1.6 × 10 ⁸ نسخ / ميكرولتر) إلى الخليط. ثم تنفيذ استخراج الحمض النووي الريبي وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
2. أداء purificatiعلى من استخراج ميرنا مع الأعمدة تدور أزل حسب تعليمات الشركة الصانعة. قياس تركيز ميرنا من HDL النقي مع spectrophorometer.
   ملاحظة: شطف من ميرنا من الأعمدة تدور توظيف 16 ميكرولتر من ريبونوكلياز خالية من المياه.

10. النسخ العكسي (RT-PCR)

1. عزل 100 نانوغرام من ميرنا من HDL ارتفعت مع ميرنا الاصطناعية (سل-مير-39) وكتب العكسي في حجم رد الفعل 20 ميكرولتر توظيف مجموعة النسخ العكسي وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
2. أداء الضوابط المناسبة دون قالب ميرنا (NTC) ودون العكسي مزيج أنزيم الناسخ (NRT).

11. في الوقت الحقيقي PCR (QRT-PCR)

1. Perfrom في الوقت الحقيقي PCR في الحجم الكلي لل20 ميكرولتر مع 2 ميكرولتر من التخفيف 1: 2 من كدنا]، 10 ميكرولتر مزيج PCR، 2 ميكرولتر التمهيدي العالمي، 2 ميكرولتر من التمهيدي ميرنا و 4 ميكرولتر المياه خالية من ريبونوكلياز.
2. تشغيل reactiعلى في لوحات 96-جيدا في درجة حرارة 95 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة، تليها 45 دورات من 94 درجة مئوية لمدة 15 ثانية و 55 درجة مئوية لمدة 30 ثانية ومرحلة التمديد على 70 درجة مئوية لمدة 30 s.ec Perfrom جميع ردود الفعل في يثلث .
3. بعد ذلك، Calcuate الكميات النسبية من ميرنا باستخدام 2 طريقة ^-ΔΔ ط م بعد تطبيع إلى التدبير المنزلي الجينات الاصطناعية وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.

النتائج

عزل البروتين الدهني العالي الكثافة بعد إزالة Exosomes
للحصول ميرنا من HDL عالي النقاء فمن الضروري إزالة exosomes التي تمثل مصدرا للتلوث ميرنا ^7. وقد تم ذلك قبل تنبيذ فائق الكثافة التدرج مع مجموعة المتاحة تجاريا. لأغراض عملية تم تع?...

Discussion

وتحديد المؤشرات الحيوية جديدة من الدم تساعد في التشخيص السريري والتشخيص للأمراض المختلفة. لقد عرف الرنا الميكروية لامتلاك كل الصفات من المؤشرات الحيوية وثبت في دراسات مختلفة ^14-17. في هذه الدراسة أننا أظهرنا طريقة سهلة سريعة وبسيطة لعزل ميرنا من HDL البلازما. كثا?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Plastic Vacutainer Lavender K2EDTA tubes	Becton, Dickinson and Company	366643
Centrifuge	Thermo Scientific, Sorvall Legend X1R	75004261
Densito 30PX densitometer	Mettler Toledo	MT51324450
ExoQuick solution	Invitrogen	4484451
Polycarbonate thick-walled ultracentrifuge tube	Thermo Scientific	O3237
Sorvall WX100 ultracentrifuge	Thermo Scientific	46902
Fat Red 7B	Sigma-Aldrich	201618
β-mercaptoethanol	Sigma-Aldrich
Amicon Ultra-15 Centrifugal filter devices 10K	Millipore	UFC901008
Amicon Ultra-centrifugal filter devices 3K	Millipore	UFC800308
QuickGel Lipo kit	Helena Laboratories	3344,3544T
Human lipoprotein standards for VLDL, LDL and HDL	LipoTrol; Helena Laboratories	5069
Rep Prep buffer	Helena Laboratories	3100
RNeasy MinElute spin columns	Qiagen
NanoDrop 1000 analyzer	Thermo Scientific
miScript II RT Kit	Qiagen	218161
CFX96 Touch real-time PCR detection system	BioRad
miRNeasy Serum/Plasma Kit	QIAGEN	217184
miScript Primer Assays	QIAGEN	141078139
miScript SYBR Green PCR Kit	QIAGEN	218073
miRNeasy Serum/Plasma Spike-In Control	QIAGEN	219610
NaOH	SIGMA-ALDRICH	480878
0.20 µM sterile syringe filter	SIGMA-ALDRICH	Z227536