Rápido e simplificado método para isolamento alto Através-put de miRNA de altamente purificada lipoproteína de alta densidade

Resumo

MicroRNAs desempenhar um papel regulador importante e estão a emergir como novos alvos terapêuticos para várias doenças humanas. Tem sido demonstrado que miARNs são realizadas em lipoproteínas de alta densidade. Nós desenvolvemos um método simplificado para isolar rapidamente HDL purificada adequada para análise de miARN a partir de plasma humano.

Resumo

Small non-coding RNAs (miRNAs) have been implicated in a variety of human diseases including metabolic syndromes. They may be utilized as biomarkers for diagnosis and prognosis or may serve as targets for drug development, respectively. Recently it has been shown that miRNAs are carried in lipoproteins, particularly high density lipoproteins (HDL) and are delivered to recipient cells for uptake. This raises the possibility that miRNAs play a critical and pivotal role in cellular and organ function via regulation of gene expression as well as messenger for cell-cell communications and crosstalk between organs. Current methods for miRNA isolation from purified HDL are impractical when utilizing small samples on a large scale. This is largely due to the time consuming and laborious methods used for lipoprotein isolation. We have developed a simplified approach to rapidly isolate purified HDL suitable for miRNA analysis from plasma samples. This method should facilitate investigations into the role of miRNAs in health and disease and in particular provide new insights into the variety of biological functions, outside of the reverse cholesterol transport, that have been ascribed to HDL. Also, the miRNA species which are present in HDL can provide valuable information of clinical biomarkers for diagnosis of various diseases.

Introdução

MicroRNAs are endogenous non-coding tiny RNA species that are highly conserved and are considered key players in the regulation of various biological processes by degrading or repressing specific target messenger RNAs¹. Because miRNAs act intracellularly they have been explored as tissue-derived biomarkers which led to the discovery of tissue-specific functions of these miRNA. However, miRNAs are also found extracellularly either associated with proteins or in exosomes/micro vesicles that effectively can shield them from degradation by extracellular RNases². More recent studies have shown that the protective effect of HDL may not be closely linked to its capability to promote cholesterol efflux but rather to its non-cholesterol cargo, in particularly as a circulating miRNAs carrier ^{3, 4}. These miRNAs may not only modulate lipid metabolism but are also associated with anti-inflammatory, antioxidant and antithrombotic effects of the HDL-miRNA complex ^{5, 6}.

To further explore the role of miRNAs carried in HDL particles, a simple and easy protocol needs to be established for miRNA extraction from isolated highly purified HDL for use in clinical routine. Numerous methods have been described to isolate HDL. These methods are either very time consuming or require large volume of plasma that may require sample pooling, extensive dialysis for desalting isolated lipoproteins and they do not completely remove exosomes as a source of miRNAs³, respectively. Here we describe a simple and rapid method that can isolate miRNA from highly purified HDL utilizing small volume of blood samples on a larger scale. We believe that this method may serve as good reference to promote research into the role of circulating miRNAs and in particular the role of HDL in facilitating communication between various cells and organs.

Protocolo

1. Recolha de amostras de sangue

1. Recolha de amostras de sangue em jejum venosos periféricos em tubos de 10 ml em plástico contendo anticoagulante ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) (que tem diversas vantagens sobre os outros anticoagulantes) por punção venosa de uma veia padrão proeminente na fossa antecubital.
2. Centrifugar as amostras de sangue a 1600 xg durante 20 min a 4 ° C numa centrífuga de mesa a obter o plasma livre de células vermelhas do sangue e pequenas quantidades de ARN.
3. Sequencialmente centrifugar o sobrenadante a 3000 g (4 ° C) num rotor de balde oscilante durante 10 min para remover WBC e plaquetas e, em seguida, mais 15 min para remover as partículas remanescentes de células, respectivamente.
4. Medir a densidade do plasma, utilizando um densitómetro à TA de acordo com as instruções de fabrico.
   NOTA: O ajuste da densidade (d = 1,023 g / ml), com solução salina a 0,9% pode ser necessário após a remoção de exossomas, mas antes a uma ultracentrifugação de gradiente de densidade.

2. exossomo Remoção de Plasma

1. Retire os exossomos circulantes que têm uma densidade semelhante ao HDL e representam uma fonte quantitativamente significativo de miRNA ^3.
   1. Para fazer isso, a adição de 252 ul de solução exossomo precipitação a 1 ml de plasma, seguido por incubação durante 30 min a 4 ° C. Para peletizar os exossomas, centrifugar a mistura durante 30 min a 1500 g a 4 ° C.
   2. Para isolar o HDL, Transferir 1 ml do sobrenadante resultante para um tubo de ultracentrífuga policarbonato de parede espessa para processamento adicional com ultracentrifugação em gradiente de densidade (ver abaixo).

3. gradiente de densidade Ultracentrifugação (Figura 1).

1. Para separar HDL usar um processo de três passos empregando uma ultracentrífuga chão com um rotor de ângulo fixo operando a 448811 x G e 8 ° C, respectivamente.
2. Preparar três soluções de densidade diferentes sequencialmente e fresco para cada isolamento.
   1. Preparar a solução de A (isolamento de VLDL, d = 1,006 g / ml) por dissolução de 11,4 g de NaCl (NaCl: 0,195 mol), 0,1 g EDTA2Na e 1 ml de NaOH 1 N em 1000 mL de água destilada autoclavada-. Em seguida, adicionar um adicional de 3 ml de água esterilizada destilada.
   2. Preparar a solução de B (isolamento de LDL, d = 1,182 g / ml) por adição de 25,2 g de NaBr a 100 ml de solução A (NaCl 0,195 mol, NaBr 2,44 mol).
   3. Preparar a solução de C (isolamento de HDL, d = 1,470 g / ml) por mistura de 78,8 g de NaBr com 100 ml de solução A (NaCl 0,195 mol, NaBr 7,7 mol). Confirmar a densidade adequada à temperatura ambiente usando um densitômetro. Mantenha todas as soluções a 4 ° C até uso posterior.

4. Isolamento de VLDL

1. Misture 1 ml de plasma (densidade média = 1,023 g / ml) e nuclease livre 200 mL de Fat Red 7B em um tubo de ultracentrífuga 6,5 ​​ml de policarbonato de paredes espessas.
2. Em seguida, a camada cuidadosamente 5 ml de solução A em cima da mistura. Se necessário, adicionar gordura adicional Red 7B no topo da solução A, TO equilibrar o peso de cada tubo. Centrifugar durante 2 h (aceleração - 5), (desaceleração - 7).
   Nota: Durante a centrifugação, as lipoproteínas são acumulados como uma banda nas suas regiões de densidade de equilíbrio.
3. No final da corrida observar 2 camadas. Remover 1,5 mL da fracção VLDL representando a camada superior e armazenar a 4 ° C.
4. Finalmente, usando uma pipeta de transferência de 4 ml a partir do fundo do tubo contendo o LDL, HDL, albumina e fracção de ácido gordo para um novo tubo de policarbonato para o isolamento de LDL.

5. Isolamento de LDL

1. Misturar 2 ml de solução B e 100 ul de nuclease isenta de gordura Red 7B para dentro do tubo que contém a fracção LDL e HDL (ponto 4), respectivamente.
2. Em seguida, centrifugar para fora para 3 horas (aceleração 9, desaceleração 7). Em seguida, remover 1,5 ml da fracção de LDL que representa a camada superior e manter a 4 ° C ou armazenar a -80 ° C. Finalmente, transferir 4 ml a partir do fundo do tubo contendo a HDLfracção para um novo tubo de policarbonato.

6. Isolamento de HDL

1. Misturar 2 ml de solução C, 100 ul de nuclease isenta de gordura Red 7B e 15 ul de 98% β-mercaptoetanol para o tubo contendo a fracção HDL, respectivamente.
2. Centrifugar durante 3 h (9 aceleração, desaceleração 7). Em seguida remover 2 ml da fracção de HDL que representam a camada de topo e, ou manter a 4 ° C ou armazenar a -80 ° C.

7. A dessalinização e concentração da lipoproteína de Frações

1. Para evitar a interferência com electroforese em gel de agarose subsequente e PCR, remover excesso de sal adicionada durante a ultracentrifugação em gradiente de densidade usando dispositivos de filtro centrífugo com o corte de peso molecular apropriado (tubo 3K para VLDL e tubo de 10K para LDL / HDL) tal como descrito nas instruções do fabricante.
   1. Resumidamente, após a adição de 2,5 ml de PBS frio (NaCl 137 mM, KCl 2,7 mM, Na2HPO4 8 mM, KH2PO4 2 mM; pH 7,4) centrifuGE toda a fracção VLDL recolhidos durante densidade-gradiente ultracentrifugação a 4 ° C durante 60 min, utilizando um rotor basculante.
   2. Dessalinizar a fracção LDL duas vezes com 10 ml de PBS frio de gelo durante 30 min cada. Em seguida, use 13 ml de gelo frio PBS duas vezes para dessalgar a fração HDL. O volume PBS maior é necessário para melhorar a mobilidade com eletroforese em gel de agarose. Após centrifugação, remove as lipoproteínas contendo solutos e manter a 4 ° C, ou armazenada a -80 ° C.

8. Agarose Gel Eletroforese

1. Perfrom electroforese em gel de agarose utilizando o kit lipoproteína com pequenas modificações de instruções do fabricante, tal como se segue.
   Nota: Esta etapa é apenas para avaliar a qualidade e pureza das amostras de lipoproteína concentradas.
   1. Resumidamente, 6 ul de obter a fracção de lipoproteína dessalinizada com ultracentrifugação em gradiente de densidade e carregar num gel de lipoproteína de pré-molde. Use lipop humananormas rotein para VLDL, LDL e HDL como referência de tamanho. Realizar electroforese a RT a 100 V durante 60 min utilizando tampão de Rep Prep.
   2. Seca-se o gel durante 10 min e em seguida corar durante 10 min à TA com Fat Red 7B. Destain o gel em uma mistura de metanol-água 75:25 (v / v) e seco de novo durante 5 min.

9. Extracção e purificação de ARN

1. Perfrom isolamento de miARN pela HDL humana purificada utilizando o kit de soro / plasma de miARN isolamento e purificação.
   1. Resumidamente, adicionar 1 ml de reagente de lise de ARN de 200 ul de HDL purificada, misturar com um vortex e depois incubada durante 5 min à temperatura ambiente para garantir a completa dissociação de complexos nucleoproteicos e inactivação de RNases.
   2. Em seguida 3,5 ul de pico sintético Caenorhabditis elegans microARN (CEL-miR-39; 1,6 x 10 ⁸ cópias / ul) na mistura. Em seguida, realizar a extracção de ARN de acordo com as instruções do fabricante.
2. execute purificatina de extraiu-miARN com colunas de giro eluir conforme as instruções do fabricante. Medir a concentração de miARN de HDL purificada com um spectrophorometer.
   NOTA: eluição de miRNA das colunas de spin empregadas 16 mL de água livre de RNase.

10. Transcrição Reversa (RT-PCR)

1. Isolar 100 ng do miARN de HDL enriquecida com miARN sintético (CEL-miR-39) e sujeitos a transcrição reversa num volume de reacção de 20 ul utilizando o kit de transcrição reversa e de acordo com as instruções do fabricante.
2. Realizar os controlos adequados, sem modelo de miRNA (NTC) e sem mistura de enzima transcriptase reversa (NRT).

11. Real-time PCR (qRT-PCR)

1. Perfrom-PCR em tempo real em um volume total de 20 ul com 2 ul de uma diluição 1: 2 do ADNc, 10 ul de mistura de PCR, 2 ul de iniciador universal, 2 ul de iniciadores de miARN e 4 ul de água livre de RNase-.
2. Execute os Reactiem em placas de 96 poços a 95 ° C durante 15 min, seguido de 45 ciclos de 94 ° C durante 15 seg e 55 ° C durante 30 s e uma fase de extensão a 70 ° C durante 30 s.ec perfrom todas as reacções em triplicado .
3. Em seguida, calcuate quantidades relativas de miARN usando o método 2 ^-ΔΔ Ct após a normalização para o gene doméstico de síntese de acordo com as instruções do fabricante.

Resultados

Isolamento de lipoproteína de alta densidade após a remoção dos exossomas
Para obter a partir de miARN HDL altamente purificada é necessário remover exossomas que representam uma fonte de contaminação miARN ^7. Isto foi feito antes de ultracentrifugação em gradiente de densidade com um kit disponível comercialmente. Para fins práticos um padrão de três passos protocolo de ultracentrifugação de gradiente de densidade desen...

Discussão

A identificação de novos biomarcadores a partir de sangue irá ajudar no diagnóstico e prognóstico clínico de várias doenças. MicroRNAs têm conhecido por possuir todas as qualidades de biomarcadores e tem sido demonstrado em vários estudos ^14-17. Neste estudo demonstrámos método fácil rápida e simples para isolar miARN de HDL no plasma. Densidade convencional gradiente método ultra-centrifugação de isolamento de VLDL, LDL e HDL depende amostragem exacta de plasma, preparação precisa da solu?...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Plastic Vacutainer Lavender K2EDTA tubes	Becton, Dickinson and Company	366643
Centrifuge	Thermo Scientific, Sorvall Legend X1R	75004261
Densito 30PX densitometer	Mettler Toledo	MT51324450
ExoQuick solution	Invitrogen	4484451
Polycarbonate thick-walled ultracentrifuge tube	Thermo Scientific	O3237
Sorvall WX100 ultracentrifuge	Thermo Scientific	46902
Fat Red 7B	Sigma-Aldrich	201618
β-mercaptoethanol	Sigma-Aldrich
Amicon Ultra-15 Centrifugal filter devices 10K	Millipore	UFC901008
Amicon Ultra-centrifugal filter devices 3K	Millipore	UFC800308
QuickGel Lipo kit	Helena Laboratories	3344,3544T
Human lipoprotein standards for VLDL, LDL and HDL	LipoTrol; Helena Laboratories	5069
Rep Prep buffer	Helena Laboratories	3100
RNeasy MinElute spin columns	Qiagen
NanoDrop 1000 analyzer	Thermo Scientific
miScript II RT Kit	Qiagen	218161
CFX96 Touch real-time PCR detection system	BioRad
miRNeasy Serum/Plasma Kit	QIAGEN	217184
miScript Primer Assays	QIAGEN	141078139
miScript SYBR Green PCR Kit	QIAGEN	218073
miRNeasy Serum/Plasma Spike-In Control	QIAGEN	219610
NaOH	SIGMA-ALDRICH	480878
0.20 µM sterile syringe filter	SIGMA-ALDRICH	Z227536