Schnelle und vereinfachte Verfahren für Hochdurchsatz-Isolierung von miRNA aus Highly Purified High Density Lipoprotein

Zusammenfassung

MicroRNAs spielen eine wichtige regulatorische Rolle und werden als neue therapeutische Targets für verschiedene menschliche Krankheiten entstehen. Es hat sich gezeigt, dass miRNAs in Lipoproteinen hoher Dichte durchgeführt werden. Wir haben ein vereinfachtes Verfahren entwickelt, um schnell gereinigter HDL für miRNA-Analyse von Humanplasma geeignet isolieren.

Zusammenfassung

Small non-coding RNAs (miRNAs) have been implicated in a variety of human diseases including metabolic syndromes. They may be utilized as biomarkers for diagnosis and prognosis or may serve as targets for drug development, respectively. Recently it has been shown that miRNAs are carried in lipoproteins, particularly high density lipoproteins (HDL) and are delivered to recipient cells for uptake. This raises the possibility that miRNAs play a critical and pivotal role in cellular and organ function via regulation of gene expression as well as messenger for cell-cell communications and crosstalk between organs. Current methods for miRNA isolation from purified HDL are impractical when utilizing small samples on a large scale. This is largely due to the time consuming and laborious methods used for lipoprotein isolation. We have developed a simplified approach to rapidly isolate purified HDL suitable for miRNA analysis from plasma samples. This method should facilitate investigations into the role of miRNAs in health and disease and in particular provide new insights into the variety of biological functions, outside of the reverse cholesterol transport, that have been ascribed to HDL. Also, the miRNA species which are present in HDL can provide valuable information of clinical biomarkers for diagnosis of various diseases.

Einleitung

MicroRNAs are endogenous non-coding tiny RNA species that are highly conserved and are considered key players in the regulation of various biological processes by degrading or repressing specific target messenger RNAs¹. Because miRNAs act intracellularly they have been explored as tissue-derived biomarkers which led to the discovery of tissue-specific functions of these miRNA. However, miRNAs are also found extracellularly either associated with proteins or in exosomes/micro vesicles that effectively can shield them from degradation by extracellular RNases². More recent studies have shown that the protective effect of HDL may not be closely linked to its capability to promote cholesterol efflux but rather to its non-cholesterol cargo, in particularly as a circulating miRNAs carrier ^{3, 4}. These miRNAs may not only modulate lipid metabolism but are also associated with anti-inflammatory, antioxidant and antithrombotic effects of the HDL-miRNA complex ^{5, 6}.

To further explore the role of miRNAs carried in HDL particles, a simple and easy protocol needs to be established for miRNA extraction from isolated highly purified HDL for use in clinical routine. Numerous methods have been described to isolate HDL. These methods are either very time consuming or require large volume of plasma that may require sample pooling, extensive dialysis for desalting isolated lipoproteins and they do not completely remove exosomes as a source of miRNAs³, respectively. Here we describe a simple and rapid method that can isolate miRNA from highly purified HDL utilizing small volume of blood samples on a larger scale. We believe that this method may serve as good reference to promote research into the role of circulating miRNAs and in particular the role of HDL in facilitating communication between various cells and organs.

Protokoll

1. Entnahme von Blutproben

1. Sammeln peripheren Fasten Blutproben in einem 10 ml-Plastikröhrchen mit Antikoagulans (EDTA) durch Standard venipuncture einer prominenten Vene in der Ellenbeuge (die mehrere Vorteile gegenüber anderen Antikoagulantien hat).
2. Zentrifugieren der Blutproben bei 1.600 xg für 20 min bei 4 ° C in einer Tischzentrifuge Plasma frei von roten Blutkörperchen und geringe Mengen an RNA zu erhalten.
3. zentrifugieren sequentielles der Überstand bei 3.000 g (4 ° C) in einem Schwingbecher-Rotor für 10 min zu entfernen WBC & Platelets und dann weitere 15 min jeweils verbleibenden Zelltrümmer zu entfernen.
4. Messen der Dichte des Plasmas mit einem Densitometer bei RT unter Verwendung gemäss Herstellungsanweisungen.
   HINWEIS: Die Einstellung der Dichte (d = 1,023 g / ml) mit 0,9% Kochsalzlösung kann nach der Entfernung von Exosomen erforderlich sein, jedoch vor der Dichtegradient Ultrazentrifugation.

2. exosome Entfernen von Plasma

1. Entfernen Sie die zirkulierenden Exosomen , die eine ähnliche Dichte wie HDL und eine quantitativ signifikante Quelle von miRNA ³ darstellen.
   1. Dies geschieht durch Zugabe von 252 & mgr; l exosome Fällungslösung zu 1 ml Plasma, gefolgt von Inkubation für 30 min bei 4 ° C. Um die Exosomen Pellet aus Zentrifugation der Mischung für 30 min bei 1500 g bei 4 ° C.
   2. Zur Isolierung HDL, je 1 ml des resultierenden Überstand auf eine Polycarbonat-dickwandigen Ultrazentrifugenröhrchen für die weitere Verarbeitung mit Dichte-Ultrazentrifugation (siehe unten).

3. Dichte-Ultrazentrifugation (Abbildung 1).

1. Separater HDL verwenden, um ein 3-Stufen-Prozess einen Boden mit einem Ultrafestwinkelrotor, der bei 448.811 x G und 8 ° C, jeweils eingesetzt wird.
2. Bereiten Sie drei unterschiedliche Dichte Lösungen nacheinander und frisch für jede Isolation.
   1. Bereiten Lösung A (Isolation von VLDL, d = 1,006 g / ml) durch Auflösen von 11,4 g NaCl (NaCl: 0,195 mol), 0,1 g EDTA2Na und 1 ml 1N NaOH in 1000 ml autoklaviertem destilliertem Wasser. Dann fügen Sie eine zusätzliche 3 ml autoklaviert-destilliertes Wasser.
   2. Vorbereitung der Lösung B (Isolierung von LDL, d = 1,182 g / ml) durch Zugabe von 25,2 g NaBr 100 ml Lösung A (NaCl 0,195 mol, NaBr 2,44 mol).
   3. Bereiten Lösung C (Isolierung von HDL, d = 1,470 g / ml) durch Mischen von 78,8 g NaBr mit 100 ml Lösung A (NaCl 0,195 mol, NaBr 7,7 mol). Bestätigen Sie die entsprechende Dichte bei RT unter Verwendung eines Densitometers. Halten Sie alle Lösungen bei 4 ° C bis zur weiteren Verwendung.

4. Isolierung von VLDL

1. Mischen Sie 1 ml Plasma (durchschnittliche Dichte = 1,023 g / ml) und nukleasefreiem 200 ul Fat Red 7B in einem 6,5 ml Polycarbonat dickwandigen Ultrazentrifugenröhrchen.
2. Dann Schicht vorsichtig 5 ml der Lösung A auf die Oberseite des Gemisches. Falls erforderlich, fügen Sie zusätzliche Fat Red 7B auf der Lösung A to das Gewicht jedes Rohr balancieren. Zentrifuge für 2 h (Beschleunigung - 5), (Verzögerung - 7).
   HINWEIS: Während der Zentrifugation werden die Lipoproteine ​​als Band auf ihre Gleichgewichtsdichte Regionen akkumuliert.
3. Am Ende der Lauf beobachten 2 Schichten. Entfernen Sie 1,5 ml der VLDL-Fraktion, die die obere Schicht und lagern bei 4 ° C.
4. Schließlich mit einer Pipette Übertragungs 4 ml vom Boden des Röhrchens das LDL enthält, HDL, Albumin und Fettsäure-Fraktion zu einem neuen Polycarbonatrohr für LDL Isolation.

5. Isolierung von LDL

1. Mix 2 ml Lösung B und 100 ul nukleasefreiem Fat Red 7B in das Röhrchen mit dem LDL und HDL-Fraktion (Abschnitt 4) sind.
2. Zentrifuge Dann aus 3 h (Beschleunigung 9, Verzögerung 7). Danach entfernen 1,5 ml der LDL-Fraktion die oberste Schicht darstellt und halten bei 4 ° C oder bei -80 ° C. Schließlich übertragen 4 ml vom Boden des Röhrchens das HDL enthaltendeFraktion auf eine neue Polycarbonatrohr.

6. Isolierung von HDL

1. Mix 2 ml Lösung C, 100 & mgr; l Nuklease frei Fat Red 7B und 15 ul 98% β-Mercaptoethanol in das Rohr die HDL-Fraktion enthält, respectively.
2. Zentrifuge für 3 h (Beschleunigung 9, Verzögerung 7). Danach 2 ml der HDL-Fraktion zu entfernen die oberste Schicht darstellt und entweder halten bei 4 ° C oder bei -80 ° C.

7. Die Entsalzung und Konzentration von Lipoprotein-Fraktionen

1. Um Interferenzen mit anschließender Agarose-Gelelektrophorese und PCR zu vermeiden, entfernen übermäßige Salz während Dichtegradient Ultrazentrifugation hinzugefügt unter Verwendung von Zentrifugal-Filtervorrichtungen mit dem geeigneten Molekulargewichtsgrenze (3K Rohr für VLDL und 10K Rohr für LDL / HDL), wie durch die Anweisungen des Herstellers beschrieben ist.
   1. Kurz gesagt, nach 2,5 ml kaltem PBS (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 8 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4, pH 7,4) Zugabe centrifuge der gesamte VLDL-Fraktion gesammelt während Dichtegradient Ultrazentrifugation bei 4 ° C für 60 min eine Schwingbecherrotor verwendet wird.
   2. Desalt die LDL-Fraktion zweimal mit 10 ml eiskaltem PBS für jeweils 30 min. Verwenden Weiter wurden 13 ml eiskaltem PBS zweimal für Entsalzen der HDL-Fraktion. Je höher PBS Volumen ist notwendig, die Mobilität mit Agarose-Gelelektrophorese zu verbessern. Nach der Zentrifugation entfernen bei 4 ° C oder bei -80 ° C gelagert, die Lipoprotein enthält, gelöste Stoffe und zu halten.

8. Agarose-Gelelektrophorese

1. Perfrom Lipoprotein Agarosegelelektrophorese das Kit mit kleineren Modifikationen von den Anweisungen des Herstellers verwendet wird, wie folgt.
   HINWEIS: Dieser Schritt ist nur die Qualität und Reinheit der konzentrierten Lipoprotein Proben zu bewerten ist.
   1. Kurz gesagt, erhalten 6 ul des entsalzten Lipoprotein-Fraktion mit Ultrazentrifugation Dichte und laden auf einen vorgegossenen Lipoprotein-Gel. Verwenden menschlichen lipoprotein Standards für VLDL, LDL und HDL als Größenreferenz. Führen Sie die Elektrophorese bei RT bei 100 V für 60 min unter Verwendung von Rep Prep-Puffer.
   2. Trocknen des Gels für 10 min und dann Färbung für 10 min bei RT mit Fat Red 7B. Entfärben des Gels in einem Gemisch aus Methanol-Wasser 75:25 (v / v) und trockenem erneut 5 min.

9. RNA Extraktion und Reinigung

1. Perfrom Isolierung von miRNA durch gereinigtes humanes HDL mit dem Serum / Plasma-miRNA Isolierung und Reinigung Kit.
   1. Kurz gesagt, 1 ml RNA Lysereagenz bis 200 & mgr; l gereinigtem HDL, mit einem Vortexer mischen und dann für 5 min bei RT inkubiert, um die vollständige Dissoziation der Nucleoprotein-Komplexe und Inaktivierung von RNasen gewährleisten.
   2. Dann Spike 3,5 ul synthetischer Caenorhabditis elegans microRNA (cel-miR-39, 1,6 x 10 ⁸ Kopien / ul) in die Mischung. Führen Sie dann nach RNA-Extraktion aus den Anweisungen des Herstellers.
2. Führen Sie purificatiauf der extrahierten-miRNA mit elute Spin-Säulen gemäß den Anweisungen des Herstellers. Messen Sie die Konzentration von miRNA aus gereinigtem HDL mit einem spectrophorometer.
   HINWEIS: Die Elution von miRNA aus den Spin-Säulen verwendet 16 & mgr; l RNase-freiem Wasser.

10. Reverse Transkription (RT-PCR)

1. Isolieren 100 ng des miRNA aus HDL gespikt mit synthetischen miRNA (cel-miR-39) und revers transkribiert in einem 20 ul Reaktionsvolumen der reversen Transkription unter Verwendung von Kits und gemäß den Anweisungen des Herstellers.
2. Führen Sie entsprechende Kontrollen ohne Vorlage miRNA (NTC) und ohne reverse Transkriptase-Enzym-Mix (NRT).

11. Real-time PCR (qRT-PCR)

1. Perfrom PCR in Echtzeit in einem Gesamtvolumen von 20 & mgr; l mit 2 & mgr; l einer 1: 2 Verdünnung der cDNA, 10 & mgr; l PCR-Mix, 2 & mgr; l Universal-Primer, 2 & mgr; l miRNA Primern und 4 & mgr; l RNase-freiem Wasser.
2. Führen Sie die Reaction in 96-Well-Platten bei 95 ° C für 15 min, von 45 Zyklen von 94 ° C für 15 sec und 55 ° C für 30 s und eine Verlängerungsphase bei 70 ° C für 30 s.ec alle Reaktionen in Triplikaten perfrom .
3. Als nächstes calcuate relativen Mengen von miRNA durch die 2 ^-ΔΔ Ct Methode nach der Normalisierung auf das synthetische Housekeeping - Gen unter Verwendung gemäß den Anweisungen des Herstellers.

Ergebnisse

Isolierung von High Density Lipoprotein Nach Entfernen von Exosomen
MiRNA aus hochgereinigtem HDL zu erhalten , ist es notwendig , Exosomen zu entfernen , die eine Quelle der Verschmutzung miRNA ⁷ darstellen. Dies wurde vor der Dichtegradient Ultrazentrifugation mit einem im Handel erhältlichen Kits durchgeführt. Für praktische Zwecke ein Drei - Stufen - Standarddichte - Ultrazentrifugation Protokoll , das von kommerziellen Unternehm...

Diskussion

Identifizierung neuer Biomarker aus Blut werden in der klinischen Diagnose und Prognose von verschiedenen Krankheiten unterstützen. MicroRNAs sind bekannt , alle Qualitäten von Biomarkern zu besitzen und haben in verschiedenen Studien ^14-17 gezeigt. In dieser Studie haben wir eine schnelle und einfache einfache Methode zur Isolierung miRNA aus Plasma-HDL demonstriert. Herkömmliche Dichtegradient Ultrazentrifugation Verfahren zur Isolierung von VLDL, LDL und HDL , hängt von genauen Abtastung von Plasma, pr...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Plastic Vacutainer Lavender K2EDTA tubes	Becton, Dickinson and Company	366643
Centrifuge	Thermo Scientific, Sorvall Legend X1R	75004261
Densito 30PX densitometer	Mettler Toledo	MT51324450
ExoQuick solution	Invitrogen	4484451
Polycarbonate thick-walled ultracentrifuge tube	Thermo Scientific	O3237
Sorvall WX100 ultracentrifuge	Thermo Scientific	46902
Fat Red 7B	Sigma-Aldrich	201618
β-mercaptoethanol	Sigma-Aldrich
Amicon Ultra-15 Centrifugal filter devices 10K	Millipore	UFC901008
Amicon Ultra-centrifugal filter devices 3K	Millipore	UFC800308
QuickGel Lipo kit	Helena Laboratories	3344,3544T
Human lipoprotein standards for VLDL, LDL and HDL	LipoTrol; Helena Laboratories	5069
Rep Prep buffer	Helena Laboratories	3100
RNeasy MinElute spin columns	Qiagen
NanoDrop 1000 analyzer	Thermo Scientific
miScript II RT Kit	Qiagen	218161
CFX96 Touch real-time PCR detection system	BioRad
miRNeasy Serum/Plasma Kit	QIAGEN	217184
miScript Primer Assays	QIAGEN	141078139
miScript SYBR Green PCR Kit	QIAGEN	218073
miRNeasy Serum/Plasma Spike-In Control	QIAGEN	219610
NaOH	SIGMA-ALDRICH	480878
0.20 µM sterile syringe filter	SIGMA-ALDRICH	Z227536