고도로 정제 된 고밀도 지단백질에서의 miRNA의 높은 넣어 관통 분리에 대한 신속하고 단순화 된 방법

요약

마이크로 RNA는 중요한 조절 역할을하고 다양한 인간 질병에 대한 새로운 치료 대상으로 떠오르고있다. miRNAs의 고밀도 지단백질에 수행되는 것을 도시하고있다. 우리는 빠른 속도로 인간 혈장에서 miRNA의 분석에 적합한 정제 HDL을 분리하는 간단한 방법을 개발했다.

초록

Small non-coding RNAs (miRNAs) have been implicated in a variety of human diseases including metabolic syndromes. They may be utilized as biomarkers for diagnosis and prognosis or may serve as targets for drug development, respectively. Recently it has been shown that miRNAs are carried in lipoproteins, particularly high density lipoproteins (HDL) and are delivered to recipient cells for uptake. This raises the possibility that miRNAs play a critical and pivotal role in cellular and organ function via regulation of gene expression as well as messenger for cell-cell communications and crosstalk between organs. Current methods for miRNA isolation from purified HDL are impractical when utilizing small samples on a large scale. This is largely due to the time consuming and laborious methods used for lipoprotein isolation. We have developed a simplified approach to rapidly isolate purified HDL suitable for miRNA analysis from plasma samples. This method should facilitate investigations into the role of miRNAs in health and disease and in particular provide new insights into the variety of biological functions, outside of the reverse cholesterol transport, that have been ascribed to HDL. Also, the miRNA species which are present in HDL can provide valuable information of clinical biomarkers for diagnosis of various diseases.

서문

MicroRNAs are endogenous non-coding tiny RNA species that are highly conserved and are considered key players in the regulation of various biological processes by degrading or repressing specific target messenger RNAs¹. Because miRNAs act intracellularly they have been explored as tissue-derived biomarkers which led to the discovery of tissue-specific functions of these miRNA. However, miRNAs are also found extracellularly either associated with proteins or in exosomes/micro vesicles that effectively can shield them from degradation by extracellular RNases². More recent studies have shown that the protective effect of HDL may not be closely linked to its capability to promote cholesterol efflux but rather to its non-cholesterol cargo, in particularly as a circulating miRNAs carrier ^{3, 4}. These miRNAs may not only modulate lipid metabolism but are also associated with anti-inflammatory, antioxidant and antithrombotic effects of the HDL-miRNA complex ^{5, 6}.

To further explore the role of miRNAs carried in HDL particles, a simple and easy protocol needs to be established for miRNA extraction from isolated highly purified HDL for use in clinical routine. Numerous methods have been described to isolate HDL. These methods are either very time consuming or require large volume of plasma that may require sample pooling, extensive dialysis for desalting isolated lipoproteins and they do not completely remove exosomes as a source of miRNAs³, respectively. Here we describe a simple and rapid method that can isolate miRNA from highly purified HDL utilizing small volume of blood samples on a larger scale. We believe that this method may serve as good reference to promote research into the role of circulating miRNAs and in particular the role of HDL in facilitating communication between various cells and organs.

프로토콜

혈액 샘플 1. 컬렉션

1. 전주 포사에서 눈에 띄는 정맥의 표준 정맥 천자에 의해 (다른 항응고제에 비해 몇 가지 장점이 있습니다) 항응고제 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (EDTA)를 포함하는 10 ML의 플라스틱 튜브에 말초 정맥 혈액 샘플을 금식 수집합니다.
2. 적혈구 및 RNA 소량의 자유 혈장을 얻었다 탁상 원심 분리기로 4 ℃에서 20 분 동안 1,600 XG에서 혈액 샘플을 원심 분리기.
3. 순차적으로 각각 남아있는 세포 파편을 제거하기 위해 WBC 및 혈소판 15 분 후 추가를 제거하는 10 분 동안 스윙 버킷 로터에서 3,000g (4 °에 C)에서 상층 액을 원심 분리.
4. 제조 지시에 따라 RT에서 농도계를 이용하여 플라즈마의 밀도를 측정한다.
   주 : 농도 조정 (d = 1.023 g / ㎖) 0.9 % 식염수 용액 엑소 좀을 제거하지만, 종래 밀도 구배 초 원심 분리 후 필요하다.

플라즈마 2. 엑소 좀 제거

1. HDL 유사한 밀도가 순환 엑소 좀을 제거하고 miRNA의 ^(3)의 양적 중요한 소스를 나타냅니다.
   1. 4 ° C에서 30 분 동안 배양 한 다음 1 ml의 플라즈마에 252 ㎕의 엑소 좀 침전 솔루션을 추가하여이 작업을 수행합니다. 엑소 좀을 펠릿, 4 ℃에서 1,500g에서 30 분 동안 혼합물을 원심 분리.
   2. HDL, 밀도 구배 초 원심 분리하여 더 처리 카보네이트 두꺼운 초 원심 분리 튜브에 얻어진 상등액 전송 한 용액을 분리 (아래 참조).

3. 밀도 구배 초 원심 분리 (그림 1).

1. HDL은 고정 각 로터 448,811 X G에서 동작하는 8 ° C 각각과 바닥 초 원심 분리기를 사용하는 3 단계 프로세스를 사용하여 분리해서한다.
2. 세 가지 다른 밀도 솔루션 순차적으로 각각의 분리를위한 신선한를 준비합니다.
   1. 용액 A를 준비 (VLDL의 분리 D = 1.006 g / ㎖) 11.4 g의 NaCl (염화나트륨 : 0.195 몰)을 용해하여 멸균 증류수 1,000 ㎖에 0.1 g의 EDTA2Na 1 ml의 1N NaOH를합니다. 그런 다음 멸균 증류수의 추가 3 ㎖를 추가합니다.
   2. 100 ㎖ 용액 A (염화나트륨 0.195 몰, NaBr은 2.44 몰)을 25.2 g의 NaBr은을 추가하여 용액 B를 준비 (LDL의 격리, D = 1.182 g / ㎖).
   3. 용액 A의 100 ㎖ (염화나트륨 0.195 몰, NaBr은 7.7 몰) 78.8 g의 NaBr은을 혼합하여 (D = 1.470 g / ㎖ HDL의 분리) 솔루션 C를 준비합니다. 농도계를 사용하여 실온에서 적절한 밀도를 확인합니다. 더 사용할 때까지 4 ° C에서 모든 솔루션을 보관하십시오.

VLDL 4. 분리

1. 플라즈마 1 ㎖ (평균 밀도 = 1.023 g / ㎖) 6.5 ㎖의 폴리 카보네이트 두꺼운 벽으로 둘러싸인 초원 심 분리기 튜브에 지방 레드 7B와 뉴 클레아 무료 200 μl를 섞는다.
2. 조심스럽게 혼합 위에 A 액 5 ㎖ 계층. 필요한 경우, 용액 A의 t의 상단에 추가로 지방 레드 7B를 추가O 각 튜브의 무게 균형. - 2 시간 (5 가속도)에 대한 원심 분리기 (감속 - 7).
   주 : 원심 동안 지단백질가 평형 농도 영역에서 대역으로 축적된다.
3. 실행의 끝에서 2 층을 관찰합니다. 4 ° C에서 상단 층 및 저장소를 나타내는 VLDL 분획의 1.5 ml의를 제거합니다.
4. 마지막으로, LDL을 포함하는 튜브의 바닥으로부터 피펫 전사 4 용액을 이용하여, HDL, LDL을 분리하기위한 새로운 폴리 카보네이트 튜브 알부민 및 지방산 분획.

LDL 5. 분리

1. 각각 LDL과 HDL 비율 (4 절)를 포함하는 튜브에 용액 B 100 ㎕를 뉴 클레아 무료 지방 레드 7B 2 ㎖를 섞는다.
2. 그런 다음 3 시간 (가속 9, 감속 7)을 위해 밖으로 원심 분리기. 그 후, 상단 층을 나타내는 LDL 분획의 1.5 ml의 제거 및 -80 ° C에서 4 °의 C 또는 저장하시오. 마지막으로, HDL을 함유하는 튜브의 바닥에서 4 ml의 전송새로운 폴리 카보네이트 튜브 부분.

HDL 6. 분리

1. 이 용액 C의 용액, 100 μL 클레아없는 지방 레드 7B 및 각각 HDL 분획을 함유하는 튜브에 98 % β 메르 캅토 에탄올의 15 μl를 섞는다.
2. 3 시간 (가속 9, 감속 7)에 대한 원심 분리기. 그 후, 상부 층을 나타내는 HDL 분획이 용액을 제거하고 -80 ℃에서 4 ℃에서 보관하거나 저장하거나.

7. 탈염 및 지단백질 분획의 농도

1. 이후의 아가로 오스 겔 전기 영동 및 PCR과의 간섭을 방지하기 위해, 제조업체의 지침에 의해 설명 된 바와 같이 (LDL / HDL에 대한 VLDL 및 10K 튜브에 대한 3K 관) 적절한 분자량의 컷오프와 원심 필터 장치를 사용하여 밀도 구배 초 원심 분리 동안 추가 과도한 소금을 제거합니다.
   1. 간단히, 차가운 PBS (137 mM의 염화나트륨, 2.7 mM의 KCL, 8 밀리미터의 Na2HPO4, 2 mM의 KH2PO4, pH를 7.4) 2.5 ml에 추가 한 후 centrifuGE 전체 VLDL 분획 수집-동안 밀도 구배 초 원심 분리 4 ° C에서의 스윙 버킷 회 전자를 사용하여 60 분 동안.
   2. 30 분마다 10 ml의 빙냉 PBS로 두 번 LDL 분획을 탈염. 다음으로, HDL 분획을 탈염 두 번 13 ml의 얼음 차가운 PBS를 사용합니다. 높은 PBS 부피는 아가 로스 겔 전기 영동으로 이동도를 개선하는 것이 필요하다. 원심 분리 후, 지질 단백질 함유 용질을 제거하고 4 ° C에서 보관 또는 -80 ° C에 저장됩니다.

8. 아가 로스 젤 전기 영동

1. 다음과 같이 제조업체의 지침의 약간의 수정과 함께 키트를 사용 지단백 아가로 오스 겔 전기 영동을 Perfrom.
   참고 :이 단계는 집중 지질 단백질 샘플의 품질과 순도를 평가하기 위해 단지이다.
   1. 요약하면, 밀도 구배 초 원심 분리하여 탈염 지단백질 분획 6 μl를 구해서 미리 주조 지단백질 젤 상에 로딩. 인간의 lipop를 사용하여크기 기준으로 VLDL, LDL과 HDL에 대한 rotein 표준. 담당자 준비 버퍼를 사용하여 60 분 동안 100 V에서 RT에서 전기 영동을 수행하십시오.
   2. 10 분 동안 겔을 건조하고 지방 레드 7B와 함께 RT에서 10 분 동안 염색. 5 분 동안 다시 메탄올 - 물 75:25 (v / v)의 건조 혼합물에 겔 Destain.

9. RNA 추출 및 정제

1. 혈청 / 플라즈마 miRNA의 분리 및 정제 키트를 사용하여 정제 된 인간의 HDL에서의 miRNA의 분리를 Perfrom.
   1. 간단히하는 vortexer를 혼합 한 후 핵 단백질 복합체 및 RNases의 불 활성화의 완전한 분리를 보장하기 위해 RT에서 5 분 동안 배양, 정제 HDL 200 μL에 RNA 용해 시약 1 ㎖를 추가합니다.
   2. (1.6 × 10 ⁸ 복사 / μL CEL-은 miR-39) 혼합물에 다음 합성 Caenorhabditis 엘레 간스 마이크로 RNA의 3.5 μl를 스파이크. 그런 다음, 제조자의 지시에 따라 RNA의 추출을 실시한다.
2. purificati를 수행제조업체의 지침에 따라 용출 스핀 열 추출-miRNA의의에. spectrophorometer와 정제 HDL에서의 miRNA의 농도를 측정한다.
   참고 : 스핀 컬럼에서의 miRNA의 용출 된 RNase없는 물 16 μl를 고용했다.

10. 역전사 (RT-PCR)

1. HDL에서의 miRNA 100 NG를 분리하여 miRNA의 합성 (CEL-은 miR-39)과 역전사 키트를 이용하여 제조자의 지시에 따라 20 ㎕의 반응 부피로 역전사 타서.
2. 템플릿의 miRNA (NTC)없이 역전사 효소 믹스 (NRT)없이 적절한 제어를 수행합니다.

11. 실시간 PCR (QRT-PCR)

1. cDNA를 2 희석, 10 ㎕의 PCR 혼합물, 2 μL 유니버설 프라이머 2의 miRNA 프라이머 μL, 4 ㎕의 RNA 분해 효소가없는 물 : 1 2 ㎕를 20 ㎕의 총 부피로 리얼 타임 PCR을 Perfrom.
2. 를 Reacti을 실행15 초, 30 초 동안 55 ° C 및 30 ~ 70 ° C의 확장 단계에 94 ° C의 45주기 다음 15 분 동안 95 ° C에서 96 웰 플레이트에서의 삼중의 모든 반응을 Perfrom s.ec .
3. 다음으로, 제조업체의 지침에 따라 합성 하우스 키핑 유전자에 정상화 후 2 ^-ΔΔ 코네티컷 방법을 사용하여 miRNA의의 Calcuate 상대적인 양.

결과

엑소 좀 제거 후 고밀도 지단백의 분리
고순도 HDL에서의 miRNA를 얻으려면이 miRNA의 오염 ^(7)의 소스를 대표하는 엑소 좀을 제거 할 필요가있다. 이것은 상업적으로 이용 가능한 키트 밀도 구배 초 원심 분리에 앞서 수행 하였다. 실용적으로 상업 회사에 의해 개발 된 3 단의 ​​표준 밀도 구배 초 원심 프로토콜 (도 1)를 변...

토론

혈액에서 새로운 바이오 마커의 식별은 각종 질병의 임상 진단 및 예후에 도움이됩니다. 마이크로 RNA는 바이오 마커의 모든 자질을 가지고하는 것으로 알려져하고 다양한 연구 ^14-17에 표시되어있다. 이 연구에서 우리는 플라즈마 HDL에서의 miRNA를 분리하기 위해 신속하고 간단한 쉬운 방법을 증명하고있다. VLDL, LDL 및 HDL의 분리의 종래의 밀도 구배 초 원심 분리 방법은, 플라즈마의 정확한...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Plastic Vacutainer Lavender K2EDTA tubes	Becton, Dickinson and Company	366643
Centrifuge	Thermo Scientific, Sorvall Legend X1R	75004261
Densito 30PX densitometer	Mettler Toledo	MT51324450
ExoQuick solution	Invitrogen	4484451
Polycarbonate thick-walled ultracentrifuge tube	Thermo Scientific	O3237
Sorvall WX100 ultracentrifuge	Thermo Scientific	46902
Fat Red 7B	Sigma-Aldrich	201618
β-mercaptoethanol	Sigma-Aldrich
Amicon Ultra-15 Centrifugal filter devices 10K	Millipore	UFC901008
Amicon Ultra-centrifugal filter devices 3K	Millipore	UFC800308
QuickGel Lipo kit	Helena Laboratories	3344,3544T
Human lipoprotein standards for VLDL, LDL and HDL	LipoTrol; Helena Laboratories	5069
Rep Prep buffer	Helena Laboratories	3100
RNeasy MinElute spin columns	Qiagen
NanoDrop 1000 analyzer	Thermo Scientific
miScript II RT Kit	Qiagen	218161
CFX96 Touch real-time PCR detection system	BioRad
miRNeasy Serum/Plasma Kit	QIAGEN	217184
miScript Primer Assays	QIAGEN	141078139
miScript SYBR Green PCR Kit	QIAGEN	218073
miRNeasy Serum/Plasma Spike-In Control	QIAGEN	219610
NaOH	SIGMA-ALDRICH	480878
0.20 µM sterile syringe filter	SIGMA-ALDRICH	Z227536