Быстрый и упрощенный метод высокой пропускной положить Выделение микроРНК из высокоочищенной липопротеинов высокой плотности

Резюме

MicroRNAs играют важную регулирующую роль и появляются в качестве новых терапевтических мишеней для различных заболеваний человека. Было показано, что микроРНК осуществляется в липопротеинов высокой плотности. Мы разработали упрощенный метод, чтобы быстро изолирует очищенный HDL, подходящий для анализа микроРНК из плазмы крови человека.

Аннотация

Small non-coding RNAs (miRNAs) have been implicated in a variety of human diseases including metabolic syndromes. They may be utilized as biomarkers for diagnosis and prognosis or may serve as targets for drug development, respectively. Recently it has been shown that miRNAs are carried in lipoproteins, particularly high density lipoproteins (HDL) and are delivered to recipient cells for uptake. This raises the possibility that miRNAs play a critical and pivotal role in cellular and organ function via regulation of gene expression as well as messenger for cell-cell communications and crosstalk between organs. Current methods for miRNA isolation from purified HDL are impractical when utilizing small samples on a large scale. This is largely due to the time consuming and laborious methods used for lipoprotein isolation. We have developed a simplified approach to rapidly isolate purified HDL suitable for miRNA analysis from plasma samples. This method should facilitate investigations into the role of miRNAs in health and disease and in particular provide new insights into the variety of biological functions, outside of the reverse cholesterol transport, that have been ascribed to HDL. Also, the miRNA species which are present in HDL can provide valuable information of clinical biomarkers for diagnosis of various diseases.

Введение

MicroRNAs are endogenous non-coding tiny RNA species that are highly conserved and are considered key players in the regulation of various biological processes by degrading or repressing specific target messenger RNAs¹. Because miRNAs act intracellularly they have been explored as tissue-derived biomarkers which led to the discovery of tissue-specific functions of these miRNA. However, miRNAs are also found extracellularly either associated with proteins or in exosomes/micro vesicles that effectively can shield them from degradation by extracellular RNases². More recent studies have shown that the protective effect of HDL may not be closely linked to its capability to promote cholesterol efflux but rather to its non-cholesterol cargo, in particularly as a circulating miRNAs carrier ^{3, 4}. These miRNAs may not only modulate lipid metabolism but are also associated with anti-inflammatory, antioxidant and antithrombotic effects of the HDL-miRNA complex ^{5, 6}.

To further explore the role of miRNAs carried in HDL particles, a simple and easy protocol needs to be established for miRNA extraction from isolated highly purified HDL for use in clinical routine. Numerous methods have been described to isolate HDL. These methods are either very time consuming or require large volume of plasma that may require sample pooling, extensive dialysis for desalting isolated lipoproteins and they do not completely remove exosomes as a source of miRNAs³, respectively. Here we describe a simple and rapid method that can isolate miRNA from highly purified HDL utilizing small volume of blood samples on a larger scale. We believe that this method may serve as good reference to promote research into the role of circulating miRNAs and in particular the role of HDL in facilitating communication between various cells and organs.

протокол

1. Сбор проб крови

1. Сбор натощак периферической венозной пробы крови в 10 мл пластиковые пробирки, содержащие антикоагулянт этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) (который имеет несколько преимуществ по сравнению с другими антикоагулянтами) стандартными венепункции видного вены в локтевую ямку.
2. Центрифуга образцов крови при 1600 х г в течение 20 мин при 4 ° С в настольной центрифуге, чтобы получить свободный от красных кровяных клеток и небольших количеств РНК плазмы.
3. Последовательная центрифугировать супернатант при 3000 г (4 ° C) в качающемся роторе в течение 10 мин, чтобы удалить WBC & тромбоциты и затем еще 15 мин, чтобы удалить остатки клеточных остатков соответственно.
4. Измерение плотности плазмы с помощью денситометра при КТ в соответствии с инструкциями изготовления.
   Примечание: Регулировка плотности (d = 1,023 г / мл) с 0,9% солевом растворе может потребоваться после удаления экзосомы, но до градиента плотности ультрацентрифугирования.

2. экзосома Удаление из плазмы

1. Удалите циркулирующие экзосомы , которые имеют плотность , аналогичную HDL и представляют собой количественно важный источник микроРНК ^3.
   1. Это можно сделать, добавив 252 мкл раствора осаждения экзосом до 1 мл плазмы с последующей инкубацией в течение 30 мин при 4 ° C. Чтобы осадить вне экзосомы, центрифугировать смесь в течение 30 мин при 1500 г при температуре 4 ° С.
   2. Для выделения HDL, перенос 1 мл полученного супернатанта к поликарбонатным толстостенные ультрацентрифуге трубки для дальнейшей обработки с градиентом плотности ультрацентрифугирования (см ниже).

3. Плотность Градиент Ультрацентрифугирование (Рисунок 1).

1. Для того, чтобы отделить HDL использовать 3-х шаговый использующую пол ультрацентрифуге с фиксированным углом ротора работает на 448,811 х G и 8 ° C, соответственно.
2. Подготовьте три различных решения плотности последовательно и годной для каждой изоляции.
   1. Приготовьте раствор A (выделение ЛПОНП, d = 1,006 г / мл) путем растворения 11,4 г NaCl (NaCl: 0,195 моль), 0,1 г EDTA2Na и 1 мл 1 N NaOH в 1000 мл автоклавного дистиллированной воды. Затем добавляют еще 3 мл автоклавного дистиллированной воды.
   2. Приготовьте раствор B (выделение LDL, D = 1,182 г / мл), добавляя 25,2 г NaBr на 100 мл раствора A (NaCl 0,195 моль, NaBr, 2,44 моль).
   3. Готовят раствор С (выделение ЛВП, d = 1,470 г / мл) путем смешивания 78,8 г NaBr с помощью 100 мл раствора А (NaCl, 0,195 моль, NaBr, 7,7 моль). Подтвердите соответствующую плотность при комнатной температуре, используя денситометр. Держите все решения при 4 ° С до дальнейшего использования.

4. Выделение ЛПОНП

1. Смешайте 1 мл плазмы (средняя плотность = 1023 г / мл) и нуклеазные бесплатно 200 мкл жира Red 7В в 6,5 мл из поликарбоната толстостенной ультрацентрифуге трубки.
2. Затем осторожно слой 5 мл раствора А на верхней части смеси. При необходимости, добавить дополнительный жир Red 7В на вершине раствора A TO уравновесить вес каждой трубки. Центрифуга в течение 2 ч (ускорение - 5), (замедления - 7).
   Примечание: Во время центрифугирования, липопротеиды накапливаются как группа в своих регионах равновесной плотности.
3. В конце прогона наблюдать 2 слоя. Удалить 1,5 мл фракции липопротеинов очень низкой плотности, представляющего верхний слой и хранят при температуре 4 ° С.
4. И, наконец, с помощью передачи пипетки 4 мл из нижней части трубы, содержащей ЛПНП, ЛПВП, альбумин и фракции жирных кислот в новый поликарбонатной трубки для изоляции ЛНП.

5. Выделение LDL

1. Смешайте 2 мл раствора В и 100 мкл нуклеазы свободного жира Красный 7Б в пробирку, содержащую LDL и HDL фракции (раздел 4), соответственно.
2. Затем центрифуге в течение 3 ч (ускорение, замедление 9 7). После удаления 1,5 мл ЛНП фракции, представляющей верхний слой и держать при температуре 4 ° С или хранить при температуре -80 ° С. И, наконец, передача 4 мл из нижней части трубы, содержащей HDLФракцию к новому поликарбонатной трубки.

6. Выделение HDL

1. Смешайте 2 мл раствора С, 100 мкл нуклеазы свободного жира Red 7В и 15 мкл 98% бета-меркаптоэтанол в пробирку, содержащую фракцию HDL, соответственно.
2. Центрифуга в течение 3 ч (ускорение, замедление 9 7). После удаления 2 мл HDL фракции, представляющие верхний слой и либо держать при температуре 4 ° С или хранить при температуре -80 ° C.

7. обессоливания и концентрации липопротеина фракций

1. Для того, чтобы избежать помех с последующим электрофорезом в агарозном геле и ПЦР, удалите избыток соли, добавляемой при градиенте плотности ультрацентрифугирования с использованием центробежных фильтров устройств с соответствующей молекулярной массой обрезания (3K трубки для ЛОНП и 10K трубки для LDL / HDL), как описано в инструкции изготовителя.
   1. Если коротко, то после добавления 2,5 мл PBS, холодный (137 мМ NaCl, 2,7 мМ КСl, 8 мМ Na2HPO4, 2 мМ KH2PO4; рН 7,4) centrifuGE вся ЛПОНП фракция, собранная-во градиенте плотности ультрацентрифугирования при температуре 4 ° С в течение 60 мин с использованием качающийся роторе.
   2. Обессоливания фракции LDL в два раза с 10 мл охлажденного льдом PBS в течение 30 минут каждый. Затем, с помощью 13 мл охлажденного льдом PBS дважды для обессоливания HDL фракции. Чем выше объем PBS необходимо улучшить подвижность с электрофореза в агарозном геле. После центрифугирования, удаления липопротеинов, содержащих растворенные вещества и держать при температуре 4 ° C или хранили при -80 ° C.

8. Электрофорез в агарозном геле

1. Липопротеинов Выполнение проектно электрофореза в агарозном геле, использующую набор с незначительными модификациями инструкциями изготовителя следующим образом.
   Примечание: Этот шаг только для оценки качества и чистоты концентрированных образцов липопротеинов.
   1. Если коротко, то получим 6 мкл обессоленной фракции липопротеинов с градиентом плотности ультрацентрифугирования и загружают на липопротеина гель Сборный. Использование человеческого lipopСтандарты rotein для VLDL, LDL и HDL в качестве эталона размера. Проводят электрофорез при комнатной температуре при 100 V в течение 60 мин с использованием буфера Rep Prep.
   2. Сушат гель в течение 10 мин, а затем окрашивают в течение 10 мин при комнатной температуре с жиром Red 7В. Destain геля в смеси метанол-вода 75:25 (об / об) и сухой снова в течение 5 мин.

9. Экстракция РНК и очистка

1. Выполнение проектно изоляции микроРНК очищенным человеческим ЛВП с использованием набора сыворотка / плазма микроРНК выделения и очистки.
   1. Если коротко, то добавляют 1 мл реагента для лизиса РНК в 200 мкл очищенного HDL, смешать с вихревом смесителе и затем инкубировали в течение 5 мин при комнатной температуре, чтобы обеспечить полной диссоциации нуклеопротеиновых комплексов и инактивации РНКазы.
   2. Затем шип 3,5 мкл синтетического Caenorhabditis Элеганс микроРНК (Cel-MIR-39; 1,6 × 10 ⁸ копий / мкл) в смеси. Затем проводят экстракцию РНК в соответствии с инструкциями изготовителя.
2. Выполните purificatiна извлеченной-микроРНК с Элюции спиновых столбцов в соответствии с инструкциями изготовителя. Измерьте концентрацию микроРНК из очищенного HDL с spectrophorometer.
   Примечание: Вымывание микроРНК из спиновых колонн использовали 16 мкл РНКазы свободной воды.

10. с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР)

1. Изолировать 100 нг микроРНК из HDL подсыпали синтетическим микроРНК (CEL-микроРНК-39) и обратной транскрипции в объеме реакционной смеси 20 мкл с использованием набора для обратной транскрипции и в соответствии с инструкциями изготовителя.
2. Выполните соответствующие элементы управления без шаблона микроРНК (NTC) и без обратной смеси транскриптазы (НЗТ).

11. ПЦР в реальном времени (QRT-PCR)

1. Выполнение проектно-изыскательских ПЦР в реальном времени в общем объеме 20 мкл с 2 мкл 1: 2 разведения кДНК, 10 мкл ПЦР-смеси, 2 мкл универсальной грунтовки, 2 мкл микроРНК праймеров и 4 мкл РНКазы воды.
2. Запуск Reactiна в 96-луночные планшеты при 95 ° С в течение 15 мин с последующим 45 циклов при 94 ° С в течение 15 с и 55 ° С в течение 30 с и фазу удлинения при 70 ° С в течение 30 s.ec Выполнение проектно всех реакций при трехкратном повторе ,
3. Далее, Calcuate относительные количества микроРНК с помощью метода 2 ^-ΔΔ Ct после нормализации к синтетического гена домашнего хозяйства в соответствии с инструкциями изготовителя.

Результаты

Выделение липопротеинов высокой плотности после удаления экзосомы
Для получения микроРНК с высокой степенью чистоты HDL необходимо удалить экзосомы , которые представляют собой источник загрязнения микроРНК ^7. Это было сделано до градиент...

Обсуждение

Определение новых биомаркеров из крови поможет в клинической диагностике и прогнозировании различных заболеваний. MicroRNAs уже известно, обладают всеми качествами биомаркеров и было показано в различных исследованиях ^{14-17 лет.} В данном исследовании мы показали быстрый и простой пр?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Plastic Vacutainer Lavender K2EDTA tubes	Becton, Dickinson and Company	366643
Centrifuge	Thermo Scientific, Sorvall Legend X1R	75004261
Densito 30PX densitometer	Mettler Toledo	MT51324450
ExoQuick solution	Invitrogen	4484451
Polycarbonate thick-walled ultracentrifuge tube	Thermo Scientific	O3237
Sorvall WX100 ultracentrifuge	Thermo Scientific	46902
Fat Red 7B	Sigma-Aldrich	201618
β-mercaptoethanol	Sigma-Aldrich
Amicon Ultra-15 Centrifugal filter devices 10K	Millipore	UFC901008
Amicon Ultra-centrifugal filter devices 3K	Millipore	UFC800308
QuickGel Lipo kit	Helena Laboratories	3344,3544T
Human lipoprotein standards for VLDL, LDL and HDL	LipoTrol; Helena Laboratories	5069
Rep Prep buffer	Helena Laboratories	3100
RNeasy MinElute spin columns	Qiagen
NanoDrop 1000 analyzer	Thermo Scientific
miScript II RT Kit	Qiagen	218161
CFX96 Touch real-time PCR detection system	BioRad
miRNeasy Serum/Plasma Kit	QIAGEN	217184
miScript Primer Assays	QIAGEN	141078139
miScript SYBR Green PCR Kit	QIAGEN	218073
miRNeasy Serum/Plasma Spike-In Control	QIAGEN	219610
NaOH	SIGMA-ALDRICH	480878
0.20 µM sterile syringe filter	SIGMA-ALDRICH	Z227536