Yüksek Saf Yüksek Yoğunluklu Lipoprotein gelen miRNA Yüksek koymak Through-İzolasyon için hızlı ve basitleştirilmiş Yöntemi

Özet

MikroRNA'lar önemli bir düzenleyici rol oynar ve çeşitli insan hastalıkları için yeni bir terapötik hedef olarak ortaya çıkmaktadır. MiRNA'ların yüksek yoğunluklu lipoprotein taşınmaktadır gösterilmiştir. Hızla insan plazmasından MiRNA analizi için uygun, saflaştırılmış HDL izole edilmesi için basit bir yöntem geliştirdik.

Özet

Small non-coding RNAs (miRNAs) have been implicated in a variety of human diseases including metabolic syndromes. They may be utilized as biomarkers for diagnosis and prognosis or may serve as targets for drug development, respectively. Recently it has been shown that miRNAs are carried in lipoproteins, particularly high density lipoproteins (HDL) and are delivered to recipient cells for uptake. This raises the possibility that miRNAs play a critical and pivotal role in cellular and organ function via regulation of gene expression as well as messenger for cell-cell communications and crosstalk between organs. Current methods for miRNA isolation from purified HDL are impractical when utilizing small samples on a large scale. This is largely due to the time consuming and laborious methods used for lipoprotein isolation. We have developed a simplified approach to rapidly isolate purified HDL suitable for miRNA analysis from plasma samples. This method should facilitate investigations into the role of miRNAs in health and disease and in particular provide new insights into the variety of biological functions, outside of the reverse cholesterol transport, that have been ascribed to HDL. Also, the miRNA species which are present in HDL can provide valuable information of clinical biomarkers for diagnosis of various diseases.

Giriş

MicroRNAs are endogenous non-coding tiny RNA species that are highly conserved and are considered key players in the regulation of various biological processes by degrading or repressing specific target messenger RNAs¹. Because miRNAs act intracellularly they have been explored as tissue-derived biomarkers which led to the discovery of tissue-specific functions of these miRNA. However, miRNAs are also found extracellularly either associated with proteins or in exosomes/micro vesicles that effectively can shield them from degradation by extracellular RNases². More recent studies have shown that the protective effect of HDL may not be closely linked to its capability to promote cholesterol efflux but rather to its non-cholesterol cargo, in particularly as a circulating miRNAs carrier ^{3, 4}. These miRNAs may not only modulate lipid metabolism but are also associated with anti-inflammatory, antioxidant and antithrombotic effects of the HDL-miRNA complex ^{5, 6}.

To further explore the role of miRNAs carried in HDL particles, a simple and easy protocol needs to be established for miRNA extraction from isolated highly purified HDL for use in clinical routine. Numerous methods have been described to isolate HDL. These methods are either very time consuming or require large volume of plasma that may require sample pooling, extensive dialysis for desalting isolated lipoproteins and they do not completely remove exosomes as a source of miRNAs³, respectively. Here we describe a simple and rapid method that can isolate miRNA from highly purified HDL utilizing small volume of blood samples on a larger scale. We believe that this method may serve as good reference to promote research into the role of circulating miRNAs and in particular the role of HDL in facilitating communication between various cells and organs.

Protokol

Kan Örneklerinin 1. Koleksiyonu

1. Antekübital fossa önemli bir ven standart olarak damar delinerek (diğer pıhtılaşma önleyiciler göre birçok avantajı vardır) pıhtılaşma önleyici etilendiamintetraasetik asit (EDTA) ihtiva eden 10 ml'lik plastik tüplere periferal venöz kan örnekleri açlık toplayın.
2. kırmızı kan hücreleri ve RNA az miktarda serbest plazma elde etmek için bir masaüstü santrifüj 4 ° C'de 20 dakika boyunca 1600 x g'de, kan örnekleri santrifüj.
3. Sıralı, sırasıyla, kalan hücre debrisini uzaklaştırmak için WBC ve Trombositler ve 15 dakika daha sonra ilave çıkarmak için 10 dakika boyunca bir sallanan kepçeli rotor içinde 3.000 g (4 ° C) süpernatant santrifüj.
4. üretim talimatlarına göre oda sıcaklığında bir dansitometresi kullanılarak plazma yoğunluğunu ölçün.
   Not: yoğunluk ayarı (d = 1.023 g / ml),% 0.9 tuzlu su çözeltisi ile eksozomlann çıkarılması ancak önceden yoğunluk gradyan ultrasantrifüjü sonrası gerekebilir.

Plazma 2. Exosome Kaldırma

1. HDL benzer bir yoğunluğa sahip dolaşan eksozomlar çıkarın ve miRNA ³ sayısal olarak önemli bir kaynağını temsil etmektedir.
   1. 4 ° C'de 30 dakika boyunca kuluçkalandı ve ardından 1 mL plazmaya 252 ul eksozom çökelme çözeltisi ekleyerek bu fazlası. eksozomlar üzerinden pelet için 4 ° C sıcaklıkta 1500 g'de 30 dakika boyunca karışımın santrifüjlenir.
   2. HDL, yoğunluk gradyanlı ultrasantrifüjleme ile daha fazla işlenmek üzere bir polikarbonat kalın duvarlı bir ultra santrifüj tüpüne elde edilen süpernatan transferi 1 mi izole etmek için (aşağı bakınız).

3. Yoğunluk Gradient Ultrasantrifügasyon (Şekil 1).

1. HDL sabit açılı rotor 448.811 x G çalışan ve 8 ° C, sırasıyla bir kat ultrasantrifüjdeki kullanan bir 3 aşamalı bir süreci kullanmak ayırmak için.
2. Üç farklı yoğunluk çözeltileri, sırasıyla, her izolasyonu için taze hazırlayın.
   1. Çözelti A Hazırlama (VLDL izolasyonu, d = 1.006 g / ml) 11.4 gr NaCI (NaCI: 0.195 mol) eritilmesi ile otoklava damıtılmış su 1000 ml, 0.1 g EDTA * 2Na, 1 ml 1 N NaOH. Daha sonra otoklav damıtılmış su ilave 3 ilave edin.
   2. 100 mi A çözeltisi (NaCI 0.195 mol, NaBr 2.44 mol), 25.2 gr, NaBr ekleyerek Çözelti B hazırlanması (LDL izolasyonu, d = 1.182 g / ml).
   3. Çözelti A, 100 ml (NaCI 0.195 mol, NaBr 7.7 mol) 78.8 g, NaBr karıştırılarak (d = 1.470 g / ml HDL izolasyonunu) Çözüm C hazırlayın. Bir dansitometresi kullanılarak oda sıcaklığında uygun yoğunluğu onaylayın. sonraki kullanıma kadar 4 ° C 'de, tüm çözümler tutun.

VLDL 4. İzolasyonu

1. Plazma 1 ml (ortalama yoğunluğu = 1.023 g / ml), 6.5 mi polikarbonat kalın duvarlı bir ultra santrifüj tüpüne Yağ Kırmızı 7B ve nükleaz bilgilerini 200 ul karıştırın.
2. Sonra dikkatlice karışımın üstüne çözelti A 5 ml katman. Gerekirse, çözüm A t üstünde ek Yağ Kırmızı 7B ekleyino Her tüpün ağırlığını dengeleyecek. - 2 saat (5 hızlanma) için santrifüj (yavaşlama - 7).
   Not: Santrifüj sırasında, lipoproteinler kendi denge yoğunluk bölgelerinde bir bant olarak biriktirilir.
3. çalışma sonunda 2 kat gözlemlemek. 4 ° C 'de üst tabaka ve mağaza temsil VLDL fraksiyonunun 1.5 mL çıkarın.
4. Son olarak, LDL içeren tüpün tabanından bir pipet aktarım işlemlerinin 4 ml kullanılarak, HDL, LDL izolasyonu için yeni bir polikarbonat tüpüne albumin ve yağ asidi fraksiyonu.

LDL 5. İzolasyon

1. sırasıyla LDL ve HDL fraksiyonu (bölüm 4) ihtiva eden bir tüpe B çözeltisi ve 100 ul nükleaz serbest yağlı kırmızı 7B 2 ml karıştırın.
2. Ardından 3 saat (hızlanma 9, yavaşlama 7) için dışarı santrifüj. Daha sonra, üst tabaka temsil LDL fraksiyonu 1.5 mL çıkarın ve -80 ° C 'de 4 ° C ya da mağaza tutun. Son olarak, HDL içeren tüpün tabanından 4 ml aktarmakYeni bir polikarbonat tüp kısmı.

HDL'nin 6. İzolasyonu

1. 2 solüsyonu C ml, 100 ul nükleaz serbest yağ Kırmızı 7B sırasıyla, HDL fraksiyonu ihtiva eden bir tüpe% 98 β-merkaptoetanol 15 ul karıştırın.
2. 3 saat (hızlanma 9, yavaşlama 7) için santrifüj. Bundan sonra üst tabaka temsil HDL fraksiyonu 2 ml çıkarın ve -80 ° C 'de 4 ° C' de devam veya mağaza ya da.

7. Tuzdan arındırma ve Lipoprotein Fraksiyonlarının Konsantrasyon

1. sonraki agaroz jel elektroforezi ve PCR ile bir girişimi engellemek için, üreticinin talimatlarında belirtildiği şekilde (LDL / HDL için VLDL ve 10K tüp 3K tüp) uygun molekül ağırlığı kesme ile santrifüj filtre cihazları kullanılarak yoğunluk gradyan Ultrasantrifügasyon sırasında eklenen aşırı tuz kaldırmak.
   1. Kısaca, soğuk bir PBS (137 mM NaCI, 2.7 mM KCI, 8 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4, pH 7.4) içinde 2.5 ml eklenmesinden sonra SantrifüjGE tüm VLDL fraksiyon toplandı-sırasında yoğunluk gradyanlı ultrasantrifüjleme 4 ° C'de bir sallanma kepçe rotor kullanılarak 60 dakika boyunca.
   2. 30 dakika her biri için 10 ml buz gibi soğuk PBS ile iki kez, LDL fraksiyonu desalt. Daha sonra, HDL fraksiyonu tuzdan arındırma iki kez 13 ml buz gibi soğuk PBS kullanın. yüksek PBS hacmi agaroz jel elektroforezi ile mobiliteyi geliştirmek için gereklidir. Santrifüj işleminden sonra, lipoprotein içeren çözünmüş çıkarın ve 4 ° C'de tutun veya -80 ° C'de saklanır.

8. Agaroz Jel Elektroforez

1. şu şekilde üreticinin talimatlarına küçük değişikliklerle kiti kullanılarak lipoprotein agaroz jel elektroforezi perfrom.
   NOT: Bu adım konsantre lipoprotein örneklerinin kalite ve saflık değerlendirmek için sadece budur.
   1. Kısaca, yoğunluk gradyanlı ultrasantrifüjleme ile tuzdan arındırılmış lipoprotein fraksiyonu 6 ul elde edilir ve bir ön dökme lipoprotein jel üzerine yüklenir. İnsan lipop kullanınboyutu, referans olarak VLDL, LDL ve HDL için rotein standartları. Rep Hazırlık tampon kullanarak 60 dakika boyunca 100 V oda sıcaklığında elektroforez yürütmek.
   2. 10 dakika için jel Kuru ve yağlı kırmızı 7B ile oda sıcaklığında 10 dakika süre ile boyanır. 5 dakika boyunca tekrar metanol-su 75:25 (v / v) ve kuru bir karışımı içinde jel destain.

9. RNA Ekstraksiyonu ve Saflaştırılması

1. Serum / plazma MiRNA izolasyon ve saflaştırma kiti kullanılarak saflaştırılmış insan HDL ile miRNA'nın izole perfrom.
   1. Kısaca, bir vortexer ile karıştırın ve daha sonra nükleoprotein kompleksleri ve RNases inaktivasyonu tam ayrılmasını sağlamak üzere, oda sıcaklığında 5 dakika boyunca kuluçkaya yatırılır, saflaştırılmış HDL 200 ul RNA liziz reaktifi 1 ml.
   2. (1.6 x 10 ⁸ kopya / ml cel-miR-39) karışım içine daha sonra sentetik Caenorhabditis elegans microRNA 3.5 ul başak. Daha sonra, üreticinin talimatlarına uygun olarak bir RNA özütleme gerçekleştirmek.
2. cevap verecek gerçekleştirinüreticinin talimatlarına göre uzaklaştırma spin kolonların ile ekstre-miRNA üzerinde. Bir spectrophorometer ile saflaştırılmış HDL gelen miRNA konsantrasyonu ölçün.
   NOT: Spin sütunlarından miRNA sıyrılması RNaz içermeyen su 16 ul kullandı.

10. Ters Transkripsiyon (RT-PCR)

1. HDL'den miRNA'nın 100 ng izole sentetik miRNA (Cel-miR-39) ve ters transkripsiyon kiti kullanılarak ve imalatçının talimatlarına göre bir 20 ul reaksiyon hacmi içinde, ters kopyalanmış ile arttı.
2. Şablon miRNA (NTC) olmadan ve ters transkriptaz enzim karışımı (NRT) olmadan uygun kontroller gerçekleştirin.

11. Real-time PCR (QRT-PCR)

1. cDNA 2 seyreltme, 10 ul PCR karışımı, 2 ul genel primer 2 MiRNA primerler ul 4 ul RNaz içermeyen su bir 1: 2 ul 20 ul bir toplam hacim içinde gerçek-zamanlı PCR perfrom.
2. Reacti çalıştırın15 saniye ve 30 saniye boyunca 55 ° C ve 30, 70 ° C de uzatma aşaması 94 ° C'de 45 döngü, 15 dakika boyunca 95 ° C'de 96 oyuklu plakalar, içeri üç kez tüm reaksiyonlar perfrom s.ec .
3. Sonraki üreticinin talimatlarına göre sentetik temizlik gene normale döndükten sonra 2 ^-ΔΔ Ct yöntemini kullanarak miRNA calcuate göreceli miktarları.

Sonuçlar

Eksozomlann Cerrahisi Sonrası Yüksek Yoğunluklu Lipoprotein İzolasyonu
Yüksek derecede saflaştırılmış HDL gelen miRNA edinmek için miRNA kontaminasyon ⁷ kaynağı temsil eksozomlar kaldırmak için gereklidir. Bu ticari olarak temin edilebilir kit ile yoğunluk gradyan ultrasantrifüjü önce yapıldı. Pratik amaçlar için ticari şirket tarafından geliştirilen bir üç adım standart yoğunluk degrade Ultrasantrifügasyo...

Tartışmalar

kandan yeni biyomarkerlerin tanımlanması çeşitli hastalıkların klinik tanı ve prognoz yardımcı olacaktır. MikroRNA'lar biyomarkerların tüm niteliklere sahip olduğu bilinen ve çeşitli çalışmalarla ^14-17 de gösterilmiştir. Bu çalışmada, plazma HDL Mirna izole etmek için hızlı ve basit bir kolay bir yöntem gösterilmiştir. VLDL, LDL ve HDL izolasyonu geleneksel yoğunluk gradyanı, ultra-santrifüj yöntemi plazma doğru örnekleme, tampon çözeltisi tam bir şekilde hazırlanmas...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Plastic Vacutainer Lavender K2EDTA tubes	Becton, Dickinson and Company	366643
Centrifuge	Thermo Scientific, Sorvall Legend X1R	75004261
Densito 30PX densitometer	Mettler Toledo	MT51324450
ExoQuick solution	Invitrogen	4484451
Polycarbonate thick-walled ultracentrifuge tube	Thermo Scientific	O3237
Sorvall WX100 ultracentrifuge	Thermo Scientific	46902
Fat Red 7B	Sigma-Aldrich	201618
β-mercaptoethanol	Sigma-Aldrich
Amicon Ultra-15 Centrifugal filter devices 10K	Millipore	UFC901008
Amicon Ultra-centrifugal filter devices 3K	Millipore	UFC800308
QuickGel Lipo kit	Helena Laboratories	3344,3544T
Human lipoprotein standards for VLDL, LDL and HDL	LipoTrol; Helena Laboratories	5069
Rep Prep buffer	Helena Laboratories	3100
RNeasy MinElute spin columns	Qiagen
NanoDrop 1000 analyzer	Thermo Scientific
miScript II RT Kit	Qiagen	218161
CFX96 Touch real-time PCR detection system	BioRad
miRNeasy Serum/Plasma Kit	QIAGEN	217184
miScript Primer Assays	QIAGEN	141078139
miScript SYBR Green PCR Kit	QIAGEN	218073
miRNeasy Serum/Plasma Spike-In Control	QIAGEN	219610
NaOH	SIGMA-ALDRICH	480878
0.20 µM sterile syringe filter	SIGMA-ALDRICH	Z227536