Veloce e semplificato Metodo per alta through-put Isolamento dei miRNA da altamente purificato lipoproteine ​​ad alta densità

Riepilogo

I microRNA svolgono un ruolo regolatore importante e stanno emergendo come nuovi bersagli terapeutici per varie malattie umane. E 'stato dimostrato che i miRNA sono effettuate in lipoproteine ​​ad alta densità. Abbiamo sviluppato un metodo semplificato per isolare rapidamente HDL purificata per l'analisi miRNA dal plasma umano.

Abstract

Small non-coding RNAs (miRNAs) have been implicated in a variety of human diseases including metabolic syndromes. They may be utilized as biomarkers for diagnosis and prognosis or may serve as targets for drug development, respectively. Recently it has been shown that miRNAs are carried in lipoproteins, particularly high density lipoproteins (HDL) and are delivered to recipient cells for uptake. This raises the possibility that miRNAs play a critical and pivotal role in cellular and organ function via regulation of gene expression as well as messenger for cell-cell communications and crosstalk between organs. Current methods for miRNA isolation from purified HDL are impractical when utilizing small samples on a large scale. This is largely due to the time consuming and laborious methods used for lipoprotein isolation. We have developed a simplified approach to rapidly isolate purified HDL suitable for miRNA analysis from plasma samples. This method should facilitate investigations into the role of miRNAs in health and disease and in particular provide new insights into the variety of biological functions, outside of the reverse cholesterol transport, that have been ascribed to HDL. Also, the miRNA species which are present in HDL can provide valuable information of clinical biomarkers for diagnosis of various diseases.

Introduzione

MicroRNAs are endogenous non-coding tiny RNA species that are highly conserved and are considered key players in the regulation of various biological processes by degrading or repressing specific target messenger RNAs¹. Because miRNAs act intracellularly they have been explored as tissue-derived biomarkers which led to the discovery of tissue-specific functions of these miRNA. However, miRNAs are also found extracellularly either associated with proteins or in exosomes/micro vesicles that effectively can shield them from degradation by extracellular RNases². More recent studies have shown that the protective effect of HDL may not be closely linked to its capability to promote cholesterol efflux but rather to its non-cholesterol cargo, in particularly as a circulating miRNAs carrier ^{3, 4}. These miRNAs may not only modulate lipid metabolism but are also associated with anti-inflammatory, antioxidant and antithrombotic effects of the HDL-miRNA complex ^{5, 6}.

To further explore the role of miRNAs carried in HDL particles, a simple and easy protocol needs to be established for miRNA extraction from isolated highly purified HDL for use in clinical routine. Numerous methods have been described to isolate HDL. These methods are either very time consuming or require large volume of plasma that may require sample pooling, extensive dialysis for desalting isolated lipoproteins and they do not completely remove exosomes as a source of miRNAs³, respectively. Here we describe a simple and rapid method that can isolate miRNA from highly purified HDL utilizing small volume of blood samples on a larger scale. We believe that this method may serve as good reference to promote research into the role of circulating miRNAs and in particular the role of HDL in facilitating communication between various cells and organs.

Protocollo

1. Raccolta dei campioni di sangue

1. Raccogliere digiuno periferico campioni di sangue venoso in apposite provette 10 ml di plastica contenenti acido anticoagulante etilendiamminotetraacetico (EDTA) (che ha diversi vantaggi rispetto ad altri anticoagulanti) per venopuntura standard di una vena di primo piano nella fossa antecubitale.
2. Centrifugare i campioni di sangue a 1.600 xg per 20 min a 4 ° C in una centrifuga da tavolo per ottenere plasma privo di globuli rossi e piccole quantità di RNA.
3. Sequenziale centrifugare il surnatante a 3,000 g (4 ° C) in un rotore secchio oscillante per 10 minuti per rimuovere WBC e piastrine e quindi ulteriori 15 minuti per rimuovere i detriti cellulari restante rispettivamente.
4. Misurare la densità del plasma utilizzando un densitometro a RT come da istruzioni fabbricazione.
   NOTA: la regolazione della densità (d = 1,023 g / ml) con soluzione fisiologica allo 0,9% può essere richiesto dopo la rimozione del esosomi ma prima gradiente di densità ultracentrifugazione.

2. Rimozione Exosome dal plasma

1. Rimuovere le exosomes circolanti che hanno una densità simile a HDL e rappresentano una quantitativamente rilevante fonte di miRNA ^3.
   1. Fare questo aggiungendo 252 microlitri soluzione exosome precipitazione di 1 ml di plasma seguita da incubazione per 30 minuti a 4 ° C. Per sedimentare le esosomi, centrifugare la miscela per 30 minuti a 1500 ga 4 ° C.
   2. Per isolare HDL, trasferire 1 ml del supernatante risultante a un policarbonato a pareti spesse tubo ultracentrifuga per ulteriore trattamento con gradiente di densità ultracentrifugazione (vedi sotto).

3. gradiente di densità Ultracentrifugazione (Figura 1).

1. Per separare HDL utilizzare un processo in 3 fasi che impiega un ultracentrifuga pavimento con un rotore ad angolo fisso che operano a 448.811 x G e 8 ° C, rispettivamente.
2. Preparare tre diverse soluzioni di densità in sequenza e fresco per ogni isolamento.
   1. Preparare la soluzione A (isolamento di VLDL, d = 1.006 g / ml) sciogliendo 11,4 g di NaCl (NaCl: 0,195 mol), 0,1 g EDTA2Na e 1 ml 1N NaOH in 1000 ml di acqua distillata autoclave-. Quindi aggiungere un ulteriore 3 ml di acqua distillata autoclave-.
   2. Preparare la soluzione B (isolamento di LDL, d = 1.182 g / ml), aggiungendo 25,2 g NaBr a 100 ml di soluzione A (NaCl 0,195 mol, NaBr 2,44 mol).
   3. Preparare la soluzione C (isolamento di HDL, d = 1.470 g / ml) mescolando 78,8 g NaBr con 100 ml di soluzione A (NaCl 0,195 mol, NaBr 7,7 mol). Confermare la densità appropriata a temperatura ambiente utilizzando un densitometro. Conservare tutte le soluzioni a 4 ° C fino all'utilizzo.

4. Isolamento di VLDL

1. Mescolare 1 ml di plasma (densità media = 1.023 g / ml) e nucleasi libere 200 ml di grasso Red 7B in 6,5 ml in policarbonato tubo ultracentrifuga pareti spesse.
2. Poi strato accuratamente 5 ml di soluzione A in cima alla miscela. Se necessario, aggiungere ulteriori rosso grasso 7B sulla sommità della soluzione A to bilanciare il peso di ciascun tubo. Centrifuga per 2 ore (accelerazione - 5), (decelerazione - 7).
   NOTA: Durante la centrifugazione, le lipoproteine ​​sono accumulati come una banda a loro regioni di densità di equilibrio.
3. Alla fine della corsa osservare 2 strati. Rimuovere 1,5 ml della frazione VLDL che rappresenta lo strato superiore e conservare a 4 ° C.
4. Infine, utilizzando una pipetta di trasferimento 4 ml dal fondo della provetta contenente il LDL, HDL, albumina e frazione di acido grasso in un tubo in policarbonato per l'isolamento LDL.

5. Isolamento di LDL

1. Mescolare 2 ml di soluzione B e 100 microlitri di nucleasi senza grassi Red 7B nella provetta contenente la frazione LDL e HDL (sezione 4), rispettivamente.
2. Poi centrifugare per 3 ore (accelerazione 9, decelerazione 7). Successivamente, rimuovere 1,5 ml della frazione LDL che rappresenta lo strato superiore e mantenere a 4 ° C o conservare a -80 ° C. Infine, trasferire 4 ml dal fondo della provetta contenente il HDLfrazione in un nuovo tubo in policarbonato.

6. L'isolamento di HDL

1. Mescolare 2 ml di soluzione C, 100 microlitri di nucleasi senza grassi Red 7B e 15 ml di 98% β-mercaptoetanolo nella provetta contenente la frazione HDL, rispettivamente.
2. Centrifuga per 3 ore (accelerazione 9, la decelerazione 7). rimuovere Successivamente 2 ml della frazione HDL rappresentano lo strato superiore e sia mantenere a 4 ° C o conservare a -80 ° C.

7. Dissalazione e concentrazione delle lipoproteine ​​Frazioni

1. Per evitare interferenze con la successiva elettroforesi su gel di agarosio e PCR, rimuovere eccesso di sale aggiunto durante gradiente di densità ultracentrifugazione utilizzando dispositivi di filtro centrifugo con cutoff peso molecolare appropriato (tubo 3K per VLDL e tubo 10K per LDL / HDL), come descritto nelle istruzioni del produttore.
   1. In breve, dopo aver aggiunto 2,5 ml di PBS freddo (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 8 mm Na2HPO4, 2 mM KH2PO4, pH 7,4) centrifuge l'intera frazione VLDL raccolte-in gradiente di densità ultracentrifugazione a 4 ° C per 60 minuti utilizzando un rotore oscillante.
   2. Desalt la frazione LDL due volte con 10 ml di PBS freddo ghiaccio per 30 minuti ciascuno. Successivamente, utilizzare 13 ml di ghiaccio freddo PBS due volte per la demineralizzazione della frazione HDL. Il volume PBS superiore è necessario per migliorare la mobilità con elettroforesi su gel di agarosio. Dopo la centrifugazione, rimuovere le lipoproteine ​​contenenti soluti e mantenere a 4 ° C o conservati a -80 ° C.

8. Agarosio elettroforesi su gel

1. Perfrom lipoproteina elettroforesi su gel di agarosio utilizzando il kit con modifiche minime di istruzioni del produttore come segue.
   NOTA: Questo passaggio è solo per valutare la qualità e la purezza dei campioni lipoproteine ​​concentrati.
   1. In breve, è necessario ottenere 6 ml della frazione lipoproteine ​​dissalato con gradiente di densità ultracentrifugazione e caricare su un gel di lipoproteina pre-cast. Utilizzare lipop umananorme rotein per VLDL, LDL e HDL come riferimento le dimensioni. Effettuare elettroforesi a temperatura ambiente a 100 V per 60 minuti utilizzando tampone Rep Prep.
   2. Essiccare il gel per 10 minuti e poi colorare per 10 min a temperatura ambiente con Fat Red 7B. Decolorare il gel in una miscela di metanolo-acqua 75:25 (v / v) e asciugare ancora per 5 min.

9. RNA estrazione e purificazione

1. Perfrom isolamento dei miRNA da purificata HDL umano utilizzando il kit di siero / plasma isolamento miRNA e purificazione.
   1. In breve, aggiungere 1 ml di RNA reagente di lisi a 200 ml di HDL purificata, mescolare con un vortex e poi incubate per 5 minuti a temperatura ambiente per garantire la completa dissociazione dei complessi nucleoproteici e l'inattivazione di RNasi.
   2. Poi spike 3,5 ml di sintetico Caenorhabditis elegans microRNA (miR-cel-39; 1,6 x 10 ⁸ copie / mL) nella miscela. Poi effettuare l'estrazione di RNA in base alle istruzioni del produttore.
2. eseguire purificatisu di estratto-miRNA con colonne di rotazione eluire come da istruzioni del produttore. Misurare la concentrazione di miRNA da HDL purificato con un spectrophorometer.
   NOTA: eluizione di miRNA dalle colonne di spin impiegato 16 ml di acqua RNase-free.

10. trascrizione inversa (RT-PCR)

1. Isolare 100 ng del miRNA da HDL a spillo con miRNA sintetico (cel-miR-39) e reverse-trascritte in un volume di reazione di 20 microlitri utilizzando il kit di trascrizione inversa e secondo le istruzioni del produttore.
2. Effettuare controlli adeguati senza modello miRNA (NTC) e senza mix trascrittasi inversa enzima (NRT).

11. Real-time PCR (qRT-PCR)

1. Perfrom Real-time PCR in un volume totale di 20 ml con 2 ml di una diluizione 1: 2 del cDNA, 10 microlitri PCR mix, 2 ml primer universale, 2 l di primer miRNA e acqua priva di RNasi 4 ml.
2. Eseguire i riattion in piastre da 96 pozzetti a 95 ° C per 15 minuti, seguiti da 45 cicli di 94 ° C per 15 sec e 55 ° C per 30 s ed una fase di estensione a 70 ° C per 30 s.ec perfrom tutte le reazioni in triplicato .
3. Avanti, calcuate quantità relative di miRNA utilizzando il metodo 2 ^-ΔΔ Ct dopo la normalizzazione al gene housekeeping sintetico secondo le istruzioni del produttore.

Risultati

Isolamento di lipoproteine ​​ad alta densità dopo la rimozione di Esosomi
Per ottenere miRNA da HDL altamente purificato è necessario rimuovere esosomi che rappresentano una fonte di contaminazione miRNA ^7. Ciò è stato fatto prima gradiente di densità ultracentrifugazione con un kit disponibile in commercio. Per scopi pratici standard gradiente di densità protocollo ultracentrifugazione tre fasi sviluppato dalla società comme...

Discussione

L'identificazione di nuovi biomarcatori dal sangue sarà di aiuto nella diagnosi clinica e la prognosi di varie malattie. I microRNA sono noti per possedere tutte le qualità di biomarcatori e hanno dimostrato in vari studi ^14-17. In questo studio abbiamo dimostrato metodo facile rapida e semplice per isolare miRNA da HDL plasma. Densità convenzionale gradiente metodo ultra-centrifugazione di isolamento di VLDL, LDL e HDL dipende accurata campionamento di plasma, preparazione precisa della soluzione tamp...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Plastic Vacutainer Lavender K2EDTA tubes	Becton, Dickinson and Company	366643
Centrifuge	Thermo Scientific, Sorvall Legend X1R	75004261
Densito 30PX densitometer	Mettler Toledo	MT51324450
ExoQuick solution	Invitrogen	4484451
Polycarbonate thick-walled ultracentrifuge tube	Thermo Scientific	O3237
Sorvall WX100 ultracentrifuge	Thermo Scientific	46902
Fat Red 7B	Sigma-Aldrich	201618
β-mercaptoethanol	Sigma-Aldrich
Amicon Ultra-15 Centrifugal filter devices 10K	Millipore	UFC901008
Amicon Ultra-centrifugal filter devices 3K	Millipore	UFC800308
QuickGel Lipo kit	Helena Laboratories	3344,3544T
Human lipoprotein standards for VLDL, LDL and HDL	LipoTrol; Helena Laboratories	5069
Rep Prep buffer	Helena Laboratories	3100
RNeasy MinElute spin columns	Qiagen
NanoDrop 1000 analyzer	Thermo Scientific
miScript II RT Kit	Qiagen	218161
CFX96 Touch real-time PCR detection system	BioRad
miRNeasy Serum/Plasma Kit	QIAGEN	217184
miScript Primer Assays	QIAGEN	141078139
miScript SYBR Green PCR Kit	QIAGEN	218073
miRNeasy Serum/Plasma Spike-In Control	QIAGEN	219610
NaOH	SIGMA-ALDRICH	480878
0.20 µM sterile syringe filter	SIGMA-ALDRICH	Z227536