高度に精製された高密度リポタンパク質からのmiRNAのハイスループット分離のための高速かつ簡便法

要約

マイクロRNAは、重要な調節的役割を果たし、様々なヒト疾患のための新規治療標的として浮上しています。 miRNAが、高密度リポタンパク質に運ばれることが示されています。私たちは、急速にヒト血漿からのmiRNA解析に適した精製されたHDLを分離するために簡略化された方法を開発しました。

要約

Small non-coding RNAs (miRNAs) have been implicated in a variety of human diseases including metabolic syndromes. They may be utilized as biomarkers for diagnosis and prognosis or may serve as targets for drug development, respectively. Recently it has been shown that miRNAs are carried in lipoproteins, particularly high density lipoproteins (HDL) and are delivered to recipient cells for uptake. This raises the possibility that miRNAs play a critical and pivotal role in cellular and organ function via regulation of gene expression as well as messenger for cell-cell communications and crosstalk between organs. Current methods for miRNA isolation from purified HDL are impractical when utilizing small samples on a large scale. This is largely due to the time consuming and laborious methods used for lipoprotein isolation. We have developed a simplified approach to rapidly isolate purified HDL suitable for miRNA analysis from plasma samples. This method should facilitate investigations into the role of miRNAs in health and disease and in particular provide new insights into the variety of biological functions, outside of the reverse cholesterol transport, that have been ascribed to HDL. Also, the miRNA species which are present in HDL can provide valuable information of clinical biomarkers for diagnosis of various diseases.

概要

MicroRNAs are endogenous non-coding tiny RNA species that are highly conserved and are considered key players in the regulation of various biological processes by degrading or repressing specific target messenger RNAs¹. Because miRNAs act intracellularly they have been explored as tissue-derived biomarkers which led to the discovery of tissue-specific functions of these miRNA. However, miRNAs are also found extracellularly either associated with proteins or in exosomes/micro vesicles that effectively can shield them from degradation by extracellular RNases². More recent studies have shown that the protective effect of HDL may not be closely linked to its capability to promote cholesterol efflux but rather to its non-cholesterol cargo, in particularly as a circulating miRNAs carrier ^{3, 4}. These miRNAs may not only modulate lipid metabolism but are also associated with anti-inflammatory, antioxidant and antithrombotic effects of the HDL-miRNA complex ^{5, 6}.

To further explore the role of miRNAs carried in HDL particles, a simple and easy protocol needs to be established for miRNA extraction from isolated highly purified HDL for use in clinical routine. Numerous methods have been described to isolate HDL. These methods are either very time consuming or require large volume of plasma that may require sample pooling, extensive dialysis for desalting isolated lipoproteins and they do not completely remove exosomes as a source of miRNAs³, respectively. Here we describe a simple and rapid method that can isolate miRNA from highly purified HDL utilizing small volume of blood samples on a larger scale. We believe that this method may serve as good reference to promote research into the role of circulating miRNAs and in particular the role of HDL in facilitating communication between various cells and organs.

プロトコル

血液試料の1コレクション

1. 肘前窩の著名な静脈の標準的な静脈穿刺によって、（他の抗凝固剤に比べていくつかの利点を持っている）、抗凝固剤エチレンジアミン四酢酸（EDTA）を含有する10ミリリットルのプラスチックチューブに末梢静脈血サンプルを断食収集します。
2. 遠心卓上遠心機で4℃で20分間、1,600×gでの血液サンプルは、赤血球及びRNAの少量の遊離血漿を得ました。
3. 順次、それぞれ残りの細胞破片を除去するためにWBCおよび血小板その後さらに15分を除去するために10分間、スイングバケットローター3,000 G（4℃）、上清を集めます。
4. 製造指示に従って、室温で濃度計を用いてプラズマの密度を測定します。
   注：0.9％食塩水（D = 1.023グラム/ ml）の濃度の調整は、エキソソームの除去後で前の密度勾配超遠心分離に必要とされ得ます。

プラズマから2.エキソソームの取り外し

1. HDLと同様の密度を持つ循環エキソソームを削除し、miRNAの³の量的重要な供給源を表します。
   1. 4℃で30分間インキュベートした1ミリリットルプラズマに252μlのエキソソーム沈殿溶液を添加することによってこれを行います。エキソソームをペレット化し、4℃で1500グラムで30分間、混合物を遠心分離。
   2. HDL、密度勾配超遠心分離によるさらなる処理のためにポリカーボネート厚肉超遠心管に得られた上清の転送1 mlで単離する（下記参照）。

3.密度勾配超遠心分離（図1）。

1. HDLを区切るために、それぞれ、448811のx Gと8℃で動作し、固定角ローターで床の超遠心機を用いて3段階のプロセスを使用します。
2. 各単離するための3つの異なる密度のソリューションを順次、新鮮なを準備します。
   1. オートクレーブし、蒸留水1000mlに、0.1グラムEDTA2Naと1ミリリットルの1NのNaOH：11.4グラムのNaCl（0.195モルのNaCl）を溶解することにより溶液A（VLDLの単離、D = 1.006グラム/ミリリットル）を準備します。その後、オートクレーブし、蒸留水の追加の3ミリリットルを追加します。
   2. 100ミリリットルの溶液A（塩化ナトリウム0.195モル、NaBrを2.44モル）に25.2グラムのNaBrを追加することによって、溶液B（LDLの単離、D = 1.182グラム/ミリリットル）を準備します。
   3. A液（塩化ナトリウム0.195モル、NaBrを7.7モル）の100mlで78.8グラムのNaBrを混合して溶液C（HDLの単離、D = 1.470グラム/ミリリットル）を準備します。濃度計を用いて、室温で適切な密度を確認してください。さらに使用するまで4℃ですべてのソリューションをしてください。

VLDLの4.絶縁

1. 血漿の1ミリリットル（平均密度= 1.023グラム/ミリリットル）6.5ミリリットルポリカーボネート厚肉超遠心管で脂肪レッド7Bのヌクレアーゼフリーの200μLを混ぜます。
2. 次いで注意深く混合物の上に溶液Aを5ml層。必要に応じて、溶液AをTの上に付加的な脂肪レッド7Bを追加O各チューブの重量のバランスをとります。 、（減速 - 7） - 2時間（5加速度）のための遠心分離機。
   注：遠心分離中に、リポタンパク質は、それらの平衡密度領域でのバンドとして蓄積されます。
3. ランの終わりに2層を観察します。 4℃でのトップ層とストアを表すVLDL画分の1.5ミリリットルを削除します。
4. 最後に、LDLを含むチューブの底部からピペット転送4 mlで使用し、HDL、LDLの単離のための新たポリカーボネートチューブにアルブミンと脂肪酸画分。

LDLの5分離

1. それぞれ、LDLとHDL画分（セクション4）を含むチューブに溶液B及び100μlのヌクレアーゼ無脂肪レッド7Bの2ミリリットルを混ぜます。
2. その後、3時間（加速9、減速7）のために遠心分離。その後、最上層を表すLDL画分の1.5ミリリットルを除去し、-80℃で4°Cまたは店でおきます。最後に、HDLを含むチューブの底から4ミリリットルを転送新しいポリカーボネートチューブに分画。

HDLの6の単離

1. それぞれ、HDL画分を含むチューブにソリューションC、100μlのヌクレアーゼ無脂肪レッド7Bと98％のβメルカプトエタノール15μlのの2ミリリットルを混ぜます。
2. 3時間（加速9、減速7）のための遠心分離機。その後、最上層を表すHDL画分の2ミリリットルを除去し、-80℃で4℃で維持するか、ストアのいずれか。

7.脱塩およびリポタンパク質画分の濃縮

1. その後のアガロースゲル電気泳動およびPCRとの干渉を回避するために、製造業者の説明書によって記載されるように適切な分子量カットオフ（LDL / HDLためVLDLおよび10K管用3Kチューブ）で遠心分離フィルター装置を用いた密度勾配超遠心分離の間に加え、過剰な塩を除去します。
   1. 簡単に言えば、2.5ミリリットルを添加した後、冷PBS（137mMの塩化ナトリウム、2.7mMのKCL、8 mMののNa 2 HPO 4、2mMのKH 2 PO 4; pH7.4）にcentrifuGE全体VLDL画分を集め、中密度勾配超遠心分離に4℃でスイングバケットローターを用いて60分間。
   2. 30分ごとに10ミリリットルの氷冷PBSで2回LDL画分を脱塩。次に、HDL画分を脱塩するために二回13ミリリットルの氷冷PBSを使用してください。高いPBSの体積を、アガロースゲル電気泳動で移動度を向上させる必要があります。遠心分離後、リポタンパク質を含有する溶質を除去し、4℃で保持するか、-80℃で保存しました。

8.アガロースゲル電気泳動

1. 次のように製造業者の使用説明書の軽微な変更でキットを使用するリポタンパク質のアガロースゲル電気泳動をPerfrom。
   注：この手順はちょうど濃厚リポタンパクサンプルの品質と純度を評価することです。
   1. 簡潔には、密度勾配超遠心分離を用いて脱塩リポタンパク質画分の6μLを取得し、プレキャストリポタンパク質ゲル上にロードします。人間lipopを使用してくださいサイズ参考としてVLDL、LDLとHDLの基準をrotein。担当準備緩衝液を用いて60分間、100Vで、室温で電気泳動を行います。
   2. 10分間ゲルを乾燥した後、脂肪レッド7BでRTで10分間染色します。メタノール - 水75:25（v / v）の混合物中でゲル脱色し、5分間再度乾燥させます。

9. RNA抽出および精製

1. 血清/血漿中のmiRNAの単離及び精製キットを用いて精製したヒトHDLによりmiRNAの単離をPerfrom。
   1. 簡単に言えば、ボルテックスで混合し、次いで核タンパク質複合体とのRNaseの不活性化の完全な解離を確実にするために、室温で5分間インキュベートし、精製されたHDLの200μlに、RNA溶解試薬の1ミリリットルを追加します。
   2. （; 1.6×10 ⁸コピー/μlのCEL-のmiR-39）の混合物に続いて合成線虫Caenorhabditis elegansのマイクロRNAの3.5μLをスパイク。その後、製造者の指示に従ってRNA抽出を行います。
2. purificatiを実行します製造元の指示に従って溶出スピンカラムを用いて抽出-miRNAの上。 spectrophorometerで精製したHDLからのmiRNAの濃度を測定します。
   注：スピンカラムからのmiRNAの溶出は、RNaseフリー水を16μLを採用しました。

10.逆転写（RT-PCR）

1. HDLからmiRNAの100 ngのを分離する合成miRNA（CEL-のmiR-39）、逆転写キットを用い、製造業者の指示に従って20μlの反応容量中で逆転写でスパイク。
2. テンプレートのmiRNA（NTC）がなく、逆転写酵素ミ​​ックス（NRT）することなく、適切なコントロールを実行します。

11.リアルタイムPCR（QRT-PCR）

1. cDNAの2希釈、10μlのPCRミックス、2μlのユニバーサルプライマー、miRNAのプライマー2μlのと4μlのRNaseフリー水：1の2μlので全量20μlにリアルタイムPCRをPerfrom。
2. Reactiを実行します。15秒、55℃30秒間および30 s.ec 70℃での伸長相は三連で全ての反応をPerfrom 94℃の45サイクル、続いて15分間95℃で、96ウェルプレート中に。
3. 次に、製造者の指示に従って、合成ハウスキーピング遺伝子に対して正規化した後^、2-ΔΔCt法を用いて、miRNAのCalcuate相対量。

結果

エキソソームを除去した後に高密度リポタンパク質の単離
高度に精製されたHDLからのmiRNAを得るために、miRNA汚染⁷のソースを表すエキソソームを除去する必要があります。これは、市販のキットを用いて密度勾配超遠心分離の前に行われました。実用的な目的のために営利企業が開発した3段階の標準的な密度勾配超遠心分離プ?...

ディスカッション

血液由来の新規バイオマーカーの同定は、様々な疾患の臨床診断および予後に役立ちます。マイクロRNAは、バイオマーカーのすべての資質を有することが知られており、種々の研究^14-17で示されています。本研究では、血漿HDLからのmiRNAを分離するために迅速かつ簡単な簡単な方法を示しました。 VLDL、LDLおよびHDLの分離の従来の密度勾配超遠心分離法は、プラズマの正確なサンプリ?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Plastic Vacutainer Lavender K2EDTA tubes	Becton, Dickinson and Company	366643
Centrifuge	Thermo Scientific, Sorvall Legend X1R	75004261
Densito 30PX densitometer	Mettler Toledo	MT51324450
ExoQuick solution	Invitrogen	4484451
Polycarbonate thick-walled ultracentrifuge tube	Thermo Scientific	O3237
Sorvall WX100 ultracentrifuge	Thermo Scientific	46902
Fat Red 7B	Sigma-Aldrich	201618
β-mercaptoethanol	Sigma-Aldrich
Amicon Ultra-15 Centrifugal filter devices 10K	Millipore	UFC901008
Amicon Ultra-centrifugal filter devices 3K	Millipore	UFC800308
QuickGel Lipo kit	Helena Laboratories	3344,3544T
Human lipoprotein standards for VLDL, LDL and HDL	LipoTrol; Helena Laboratories	5069
Rep Prep buffer	Helena Laboratories	3100
RNeasy MinElute spin columns	Qiagen
NanoDrop 1000 analyzer	Thermo Scientific
miScript II RT Kit	Qiagen	218161
CFX96 Touch real-time PCR detection system	BioRad
miRNeasy Serum/Plasma Kit	QIAGEN	217184
miScript Primer Assays	QIAGEN	141078139
miScript SYBR Green PCR Kit	QIAGEN	218073
miRNeasy Serum/Plasma Spike-In Control	QIAGEN	219610
NaOH	SIGMA-ALDRICH	480878
0.20 µM sterile syringe filter	SIGMA-ALDRICH	Z227536