שיטה מהירה ופשוטה עבור בידוד גבוה באמצעות-לשים של מירנה מן ליפופרוטאין בצפיפות הגבוה מאוד מטוהר

Summary

מייקרו RNA לשחק תפקיד רגולטורים חשוב והם מתעוררים כמו מטרות טיפוליות חדשניות למחלות אנושיות שונות. הוכח כי miRNAs נישאים ליפופרוטאין בצפיפות גבוהה. פיתחנו שיטה פשוטה לבודד HDL מטוהרים במהירות מתאים לניתוח מירנה מפלסמה אנושית.

Abstract

Small non-coding RNAs (miRNAs) have been implicated in a variety of human diseases including metabolic syndromes. They may be utilized as biomarkers for diagnosis and prognosis or may serve as targets for drug development, respectively. Recently it has been shown that miRNAs are carried in lipoproteins, particularly high density lipoproteins (HDL) and are delivered to recipient cells for uptake. This raises the possibility that miRNAs play a critical and pivotal role in cellular and organ function via regulation of gene expression as well as messenger for cell-cell communications and crosstalk between organs. Current methods for miRNA isolation from purified HDL are impractical when utilizing small samples on a large scale. This is largely due to the time consuming and laborious methods used for lipoprotein isolation. We have developed a simplified approach to rapidly isolate purified HDL suitable for miRNA analysis from plasma samples. This method should facilitate investigations into the role of miRNAs in health and disease and in particular provide new insights into the variety of biological functions, outside of the reverse cholesterol transport, that have been ascribed to HDL. Also, the miRNA species which are present in HDL can provide valuable information of clinical biomarkers for diagnosis of various diseases.

Introduction

MicroRNAs are endogenous non-coding tiny RNA species that are highly conserved and are considered key players in the regulation of various biological processes by degrading or repressing specific target messenger RNAs¹. Because miRNAs act intracellularly they have been explored as tissue-derived biomarkers which led to the discovery of tissue-specific functions of these miRNA. However, miRNAs are also found extracellularly either associated with proteins or in exosomes/micro vesicles that effectively can shield them from degradation by extracellular RNases². More recent studies have shown that the protective effect of HDL may not be closely linked to its capability to promote cholesterol efflux but rather to its non-cholesterol cargo, in particularly as a circulating miRNAs carrier ^{3, 4}. These miRNAs may not only modulate lipid metabolism but are also associated with anti-inflammatory, antioxidant and antithrombotic effects of the HDL-miRNA complex ^{5, 6}.

To further explore the role of miRNAs carried in HDL particles, a simple and easy protocol needs to be established for miRNA extraction from isolated highly purified HDL for use in clinical routine. Numerous methods have been described to isolate HDL. These methods are either very time consuming or require large volume of plasma that may require sample pooling, extensive dialysis for desalting isolated lipoproteins and they do not completely remove exosomes as a source of miRNAs³, respectively. Here we describe a simple and rapid method that can isolate miRNA from highly purified HDL utilizing small volume of blood samples on a larger scale. We believe that this method may serve as good reference to promote research into the role of circulating miRNAs and in particular the role of HDL in facilitating communication between various cells and organs.

Protocol

1. איסוף של דגימות דם

1. אסוף בצום דגימות דם ורידי היקפי ל -10 צינורות מ"ל פלסטיק המכילים חומצה Ethylenediaminetetraacetic קרישה (EDTA) (שבה יש מספר יתרונות על פני תרופות נגד קרישת דם אחרים) על ידי venipuncture רמת וריד בולט fossa antecubital.
2. צנטריפוגה דגימות דם 1,600 XG במשך 20 דקות ב 4 ° C בצנטריפוגה השולחן להשיג פלזמה חינם של כדוריות דם אדומות וכמויות קטנות של RNA.
3. ברצף בצנטריפוגה supernatant ב -3,000 גרם (4 ° C) ב הרוטור דלי מתנדנד במשך 10 דקות כדי להסיר WBC & טסיות ולאחר מכן עוד 15 דקות כדי להסיר פסולת התא הנותרים בהתאמה.
4. מדוד את הצפיפות של הפלזמה באמצעות densitometer ב RT לפי הוראות ייצור.
   הערה: התאמת צפיפות (ד = 1.023 גרם / מ"ל) עם תמיסת מלח 0.9% עשויה להידרש לאחר הסרת exosomes אבל לפני ultracentrifugation שיפוע צפיפות.

הסרת 2. Exosome מ פלזמה

1. הסר את exosomes במחזור כי יש צפיפות דומה HDL ולייצג מקור משמעותי כמותית של מירנה ^3.
   1. עושים זאת על ידי הוספת פתרון ממטרים 252 μl exosome עד 1 מ"ל פלזמה ואחריו הדגירה במשך 30 דקות ב 4 ° C. כדי גלול את exosomes, צנטריפוגות את התערובת במשך 30 דקות ב 1500 גרם ב 4 מעלות צלזיוס.
   2. כדי לבודד HDL, להעביר 1 מ"ל של supernatant וכתוצאה לצינור ultracentrifuge פוליקרבונט עבה חומה לעיבוד נוסף עם ultracentrifugation שיפוע צפיפות (ראה להלן).

3. צפיפות Gradient ultracentrifugation (איור 1).

1. כדי להפריד HDL משתמשים בתהליך 3 שלבים העסקת ultracentrifuge הרצפה עם רוטור קבוע זווית הפעלה ב 448,811 x G ו -8 מעלות צלזיוס, בהתאמה.
2. כן שלושה ברצף פתרונות צפיפות שונים ורענן לכל בידוד.
   1. הכן פתרון A (בידוד של VLDL, ד = 1.006 גרם / מ"ל) על ידי המסת 11.4 גרם NaCl (NaCl: 0.195 mol), EDTA2Na 0.1 גרם ו 1 מ"ל 1N NaOH ב 1,000 מ"ל מים autoclaved מזוקקים. ואז להוסיף 3 מ"ל נוספים של מים autoclaved מזוקקים.
   2. הכן פתרון B (בידוד של LDL, ד = 1.182 גרם / מ"ל) על ידי הוספת NaBr 25.2 גרם ל -100 מ"ל פתרון (NaCl 0.195 mol, NaBr 2.44 mol).
   3. הכן פתרון C (בידוד של HDL, ד = 1.470 גרם / מ"ל) על ידי ערבוב NaBr 78.8 גרם עם 100 מ"ל של פתרון (mol 0.195 NaCl, NaBr 7.7 mol). אשר את הצפיפות המתאימה ב RT באמצעות densitometer. שמור את כל הפתרונות על 4 מעלות צלזיוס עד לשימוש נוסף.

בידוד 4. של VLDL

1. מערבבים 1 מ"ל של פלזמה (הצפיפות הממוצעת = 1.023 גרם / מ"ל) ו nuclease חינם 200 μl של שומן האדום 7B בתוך שפופרת ultracentrifuge 6.5 מ"ל פוליקרבונט עבה חומה.
2. אז בזהירות שכבה 5 מ"ל של פתרון העליון של התערובת. במידת הצורך, להוסיף 7B האדום שומן נוסף על גבי t פתרוןo לאזן את המשקל של כל צינור. צנטריפוגה במשך שעה 2 (האצת - 5), (האטה - 7).
   הערה: במהלך צנטריפוגה, ליפופרוטאינים נצברים כלהקה לאזורי צפיפות שיווי המשקל שלהם.
3. בסוף בטווח להתבונן 2 שכבות. סור 1.5 מיליליטר של שבריר VLDL המייצג את השכבה ולאחסן העליון על 4 מעלות צלזיוס.
4. לבסוף, באמצעות העברת פיפטה 4 מ"ל מתחתית הצינור המכיל את ה- LDL, HDL, אלבומין שברים חומצות שומן אל צינור פוליקרבונט חדש לבידוד LDL.

בידוד 5. של LDL

1. מערבבים 2 מ"ל של B פתרון ו 100 μl nuclease חינם 7B האדום שומן לתוך שפופרת המכילה את החלק היחסי LDL ו- HDL (סעיף 4), בהתאמה.
2. ואז צנטריפוגות החוצה עבור 3 שעות (האצה 9, האטה 7). לאחר מכן, להסיר 1.5 מ"ל של שבריר LDL המייצג את השכבה העליונה ולשמור על 4 מעלות צלזיוס או לאחסן ב -80 ° C. לבסוף, להעביר 4 ​​מ"ל מתחתית הצינור המכיל את HDLחלק לצינור פוליקרבונט חדש.

בידוד 6. של HDL

1. מערבבים 2 מ"ל של C פתרון, 100 7B חינם μl nuclease שומן האדום 15 μl של 98% β-mercaptoethanol לתוך שפופרת המכילה את החלק היחסי HDL, בהתאמה.
2. צנטריפוגה במשך 3 שעות (אצה 9, האטה 7). לאחר מכן להסיר 2 מ"ל של שבריר HDL המייצג את השכבה העליונה גם לשמור על 4 מעלות צלזיוס או לאחסן ב -80 ° C.

7. Desalting וריכוז של שברי Lipoprotein

1. כדי למנוע הפרעה עם ג'ל אלקטרופורזה לאחר agarose ו- PCR, להסיר מלח מופרז הוסיף במהלך ultracentrifugation שיפוע צפיפות באמצעות התקנים מסננים צנטריפוגלי עם הפסקת המשקל המולקולרית המתאימה (שפופרת 3K עבור VLDL צינור 10K עבור LDL / HDL) כפי שתואר על ידי הוראות היצרן.
   1. בקצרה, לאחר הוספת 2.5 מ"ל קר PBS (137 mM NaCl, 2.7 מ"מ KCL, 8 מ"מ Na2HPO4, 2 מ"מ KH2PO4; pH 7.4) centrifuge השבר VLDL שנגבה-במהלך ultracentrifugation שיפוע צפיפות ב 4 מעלות צלזיוס במשך 60 דקות באמצעות הרוטור דלי מתנדנד.
   2. Desalt השבר LDL פעמיים עם 10 מ"ל קרח קר PBS במשך 30 דקות כל אחד. לאחר מכן, השתמש 13 מ"ל קרח קר PBS פעמיים עבור Desalting השבר HDL. היקף PBS הגבוה יש צורך לשפר את ניידות עם ג'ל אלקטרופורזה agarose. לאחר צנטריפוגה, להסיר את המומסים ליפופרוטאין המכילים ולשמור על 4 מעלות צלזיוס או לאחסן ב -80 מעלות צלזיוס.

8. ג'ל אלקטרופורזה agarose

1. Perfrom ג'ל אלקטרופורזה agarose ליפופרוטאין העסקה בערכה עם שינויים קלים של הוראות היצרן כדלקמן.
   הערה: שלב זה הוא רק כדי להעריך את האיכות וטוהר של דגימות ליפופרוטאין מרוכזות.
   1. בקצרה, לקבל 6 μl של שבריר ליפופרוטאין desalted עם ultracentrifugation שיפוע צפיפות ולטעון על ג'ל ליפופרוטאין מראש יצוק. השתמש lipop אדםסטנדרטי rotein עבור VLDL, LDL ו- HDL כהפנית גודל. לבצע אלקטרופורזה ב RT ב -100 V עבור 60 דקות באמצעות חיץ הכנת הנציג.
   2. יבש את הג'ל למשך 10 דקות ולאחר מכן להכתים במשך 10 דקות ב RT עם שומן האדום 7B. Destain הג'ל בתערובת של מים מתנול 75:25 (v / v) ויבש שוב במשך 5 דקות.

הפקת RNA 9. וטיהור

1. Perfrom הבידוד של מירנה ידי HDL האדם מטוהרים באמצעות ערכת בידוד מירנה בסרום / פלזמה וטיהור.
   1. בקצרה, להוסיף 1 מ"ל של ריאגנט תמוגה RNA 200 μl של HDL מטוהרים, לערבב עם vortexer ואז וטופחו במשך 5 דקות ב RT על מנת להבטיח ניתוק מוחלט של מתחמי nucleoprotein ו איון של RNases.
   2. ואז ספייק 3.5 μl של סינתטי Caenorhabditis elegans microRNA (cel-miR-39; 1.6 x 10 ⁸ עותקים / μl) לתוך התערובת. ואז לבצע מיצוי RNA על פי הוראות היצרן.
2. בצע purificatiעל של מירנה חילוץ עם עמודות ספין elute לפי הוראות היצרן. למדוד את הריכוז של מירנה מה- HDL מטוהר עם spectrophorometer.
   הערה: Elution של מירנה מטורי הספין מועסק 16 μl של RNase ללא מים.

10. הפוך תמלול (RT-PCR)

1. לבודד 100 ננוגרם של מירנה מה- HDL ומשובץ מירנה סינטטי (cel-miR-39) ו הפוך עבד בנפח תגובת 20 μl העסיק בערכת השעתוק לאחור ועל פי הוראות היצרן.
2. בצע בקרה נאותה ללא תבנית מירנה (NTC) וללא תמהיל אנזים transcriptase הפוך (NRT).

11. בזמן אמת PCR (qRT-PCR)

1. Perfrom PCR בזמן אמת בהיקף כולל של 20 μl עם 2 μl של דילול 1: 2 של cDNA, 10 μl PCR לערבב, 2 פריימר אוניברסלי μl, 2 μl של פריימרים מירנה ו -4 μl מים RNase חינם.
2. הפעל את Reactiעל ב 96-גם צלחות על 95 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות, ואחריו 45 מחזורים של 94 מעלות צלזיוס למשך 15 שניות ו 55 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות לבין שלב הארכה על 70 מעלות צלזיוס למשך 30 s.ec Perfrom כל תגובות triplicates .
3. לאחר מכן, כמויות יחסית Calcuate של מירנה באמצעות 2 שיטת Ct ^-ΔΔ לאחר נורמליזציה אל גן משק סינתטי לפי הוראות היצרן.

תוצאות

בידוד של ליפופרוטאין בצפיפות גבוהה לאחר הסרת Exosomes
כדי להשיג מירנה מה- HDL הנקי במיוחד יש צורך להסיר exosomes המייצג מקור מירנה זיהום ^7. הדבר נעשה לפני ultracentrifugation שיפוע צפיפות עם ערכה זמינה מסחרי. למטרות מעשיות פרוטוקול ultracentrifuga...

Discussion

זיהוי סמנים ביולוגיים רומן מדם יסייע לקביעת האבחנה הקלינית ופרוגנוזה של מחלות שונות. מיקרו-רנ"א הינם ידוע כבעל כל התכונות של סמנים ביולוגיים הוכחו במחקרים שונים ^14-17. במחקר זה אנו הוכחנו שיטה קלה מהירה ופשוטה לבודדים מירנה מה- HDL בפלזמה. שיטת שיפוע אולטרה צנטר?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Plastic Vacutainer Lavender K2EDTA tubes	Becton, Dickinson and Company	366643
Centrifuge	Thermo Scientific, Sorvall Legend X1R	75004261
Densito 30PX densitometer	Mettler Toledo	MT51324450
ExoQuick solution	Invitrogen	4484451
Polycarbonate thick-walled ultracentrifuge tube	Thermo Scientific	O3237
Sorvall WX100 ultracentrifuge	Thermo Scientific	46902
Fat Red 7B	Sigma-Aldrich	201618
β-mercaptoethanol	Sigma-Aldrich
Amicon Ultra-15 Centrifugal filter devices 10K	Millipore	UFC901008
Amicon Ultra-centrifugal filter devices 3K	Millipore	UFC800308
QuickGel Lipo kit	Helena Laboratories	3344,3544T
Human lipoprotein standards for VLDL, LDL and HDL	LipoTrol; Helena Laboratories	5069
Rep Prep buffer	Helena Laboratories	3100
RNeasy MinElute spin columns	Qiagen
NanoDrop 1000 analyzer	Thermo Scientific
miScript II RT Kit	Qiagen	218161
CFX96 Touch real-time PCR detection system	BioRad
miRNeasy Serum/Plasma Kit	QIAGEN	217184
miScript Primer Assays	QIAGEN	141078139
miScript SYBR Green PCR Kit	QIAGEN	218073
miRNeasy Serum/Plasma Spike-In Control	QIAGEN	219610
NaOH	SIGMA-ALDRICH	480878
0.20 µM sterile syringe filter	SIGMA-ALDRICH	Z227536