الآلي الصوتية الاستغناء عن التخفيف المسلسل من الببتيد ناهضات في الفعالية تحديد فحوصات

Summary

Peptide adsorption to plasticware during traditional tip-based serial dilutions can significantly impact potency determination and confound the understanding of structure-activity relationships used for lead identification and lead optimization phases of drug discovery. Here methods for automated acoustic non-contact serial dilution of peptide samples are described.

Abstract

كما هو الحال مع اكتشاف المخدرات جزيء صغير، وفحص لمستقبلات الببتيد يتطلب التخفيف المتسلسل من الببتيدات لإنتاج منحنيات التركيز على الاستجابة. فحص الببتيدات يتيح طبقة إضافية من التعقيد وسائل التعامل مع عينة القائم على طرف التقليدية تعرض الببتيدات إلى مساحة كبيرة من بلستيكور، وتوفير فرصة زيادة عن فقدان الببتيد عن طريق الامتصاص. منع التعرض المفرط للبلستيكور يقلل من فقدان الببتيد عبر التمسك البلاستيك وبالتالي يقلل من عدم الدقة في التنبؤ رجولية، والتي وصفناها سابقا فوائد الصوتية عدم الاتصال الاستغناء عنه في المختبر فحص عالية الإنتاجية من مستقبلات الببتيد ^1. نحن هنا مناقشة حل أتمتة متكاملة لعدم الاتصال إعداد الصوتية من التخفيفات المسلسل الببتيد في صفيحة معايرة دقيقة باستخدام المثال من فحص مستقبلات الببتيد في الماوس مثل الجلوكاجون الببتيد 1 مستقبلات (GLP-1R). طرقنا تسمح للارتفاعفحوصات للكشف عن منبهات -throughput خلية المستندة وهي قابلة للتطوير لدعم زيادة الإنتاجية عينة، أو السماح لأعداد متزايدة من نسخ لوحة فحص (على سبيل المثال، لوحة من أكثر خطوط الخلايا المستهدفة) بسهولة.

Introduction

وGLP-1R هو هدف المخدرات التي أنشئت في علاج السكري من النوع 2 ^2. ناهض الببتيد الأصلي لهذا المستقبل، GLP-1، لديه في الجسم الحي نصف عمر من 2-3 دقيقة ^3. الربط من GLP-1 إلى البروتين إلى جانب النتائج مستقبلات هدفه G في إنتاج المصب من الثاني مخيم رسول من خلال الأصلي اقتران بروتين G لتفعيل محلقة أدينيليل. قياس المخيم المتراكمة يوفر فحص قوي لمراقبة تنشيط مستقبلات وللكشف عن النشطة GLP-1 نظائرها مع الخصائص الفيزيائية المفضلة. مثل هذا الفحص يتطلب التخفيف المتسلسل للعينات اختبار لبناء منحنيات التركيز على الاستجابة، وهذا أمر معقد ولا سيما عند تسليم عينات الببتيد. وقد وصفت الأخطاء المحتملة من إعداد التخفيف المتسلسل القائم على طرف سابقا ^1،4،5. والببتيدات كثف لبلستيكور، مما أدى إلى تقديرات قوة لا يمكن الاعتماد عليها. فقدان الببتيد يمكن التقليل من خلال رانه إدراج زلال المصل البقري (BSA) في مخازن واستخدام بلستيكور siliconized و، ولكن بروتين ملزمة لا يزال لا يمكن التنبؤ بها. على وجه الخصوص، وقد وصفت الاختلاف في ربط GLP-1 إلى حاويات التجريبية ^6. وهناك مضاعفات أخرى في هذا كلاء الاستقرار المستخدمة في بلستيكور المختبر يمكن أن تتسرب من النصائح وصفيحة معايرة دقيقة إلى مخازن فحص المائية وتتدخل في وظيفة البروتين ^{7 و 8.} لذلك، أساليب للحد من التعرض لبلستيكور ضرورية لزيادة دقة القياسات.

الصوتية موزعات السائلة تركز إشارة الصوتية عالية التردد على سطح عينة السائل، مما أدى إلى طرد قطرات نانولتر دقيقة إلى لوحة فحص المجاورة ^9. استخدام اللفظ الصوتي القياسي في صناعة الأدوية لإعداد وفحص مكتبات كبيرة مجمع الاصطناعية، ولقد تم التحقق من صحة هذه التكنولوجيا بشكل جيد لmolecul صغيروفاق ^10. على حد علمنا، نحن المجموعة الأولى لوصف الاستغناء الصوتية لإعداد الببتيدات المؤتلف والاصطناعية ولقد ذكرت سابقا تحسين دقة بالمقارنة مع الطرق التقليدية القائمة على طرف ^1.

توضح هذه المقالة دمج إعداد الببتيد التخفيفات المسلسل ومباشرا من عدم الاتصال نقل الصوتية الصعود إلى التعامل مع لوحة نظام الروبوت الآلي بالكامل. وقد وصف عدد من الأساليب التي تشمل نقل الصوتية عينات سابقا ^11. نحن نستخدم طريقة من خطوتين لإعداد تركيزات الأسهم المتوسطة ولتمييع متسلسل نظائرها الببتيد لتوليد منحنى الاستجابة للجرعة كاملة. يتم تحضين الببتيدات مستعدة مع الخلايا معربا عن الماوس الهدف GLP-1R، ونحن نستخدم فحص المتاحة تجاريا متجانسة مضان وقت حل (HTRF) لقياس تراكم مخيم داخل هذه الخلايا كما قراءات من أكتيف ناهض الببتيدإيتي. فحص قوي وقابلة لالإنتاجية العالية شكل 384 بشكل جيد وتطبيقها بشكل روتيني إلى كل من التنمية فحص وفحص المخدرات المشاريع ^12.

Protocol

1. الببتيد التخفيف المسلسل

1. إعداد عازلة فحص: هانكس مخزنة محلول ملحي (HBSS) تستكمل مع 25 ملي HEPES، 0.1٪ BSA و 0.5 ملم 3-إيسوبوتيل-1-الميثيل (IBMX)، ودرجة الحموضة 7.4.
2. استخدام موزع كاشف المجمع لإضافة منهجي 5 ميكرولتر من العازلة الفحص إلى كل بئر من خمس لوحات حجم فحص منخفضة 384 أيضا.
   1. استخدام البرامج الداخلية لإنشاء برنامج الاستغناء عن 5 ميكرولتر حجم بالإضافة إلى كل بئر من لوحة 384 جيدا وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
   2. تزج الاستغناء أنابيب الكاسيت في المخزن فحص وسائل الوزراء.
   3. وضع 384 كذلك انخفاض حجم لوحة فحص على الناقل لوحة.
   4. اضغط على زر البداية.
3. تمييع جميع العينات الببتيد، بغض النظر عن مركبة التخزين، إلى عازلة فحص لإنتاج الأوراق المالية الببتيد 100X.
   ويمكن الحصول على الببتيدات التي تتطلب الفحص في المياه المالحة الفوسفات مخزنة (PBS) أو ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) كما يراه مناسبا (على سبيل المثال، DMSO ث ملاحظة:لديهم سوء تأثير ضار على الببتيدات مع تعديلات ثانوية مثل من مضاد).
4. الاستغناء عن 25 ميكرولتر الأسهم الببتيد 100X إلى أعمدة 1-5 من صفيحة المؤهلين سمعيا البولي بروبلين 384 بئر. وسميت هذه لوحة "مصدر لوحة A '. تأكد من أن لوحات مصدر، ولكن ليس لوحات جهة، ومسطحة القاع وتتفق على التحمل الصوتية المحددة كما هو محدد من قبل الشركة المصنعة للأدوات السمعية.
5. الاستغناء عن 25 ميكرولتر سيطرة إشارة 100X في الآبار A23 و A24 لوحة مصدر A.
6. الاستغناء عازلة فحص 10 ميكرولتر في أعمدة 11-15 وعازلة فحص 30 ميكرولتر في أعمدة 21-22 لوحة مصدر A.
7. الاستغناء عازلة فحص 10 ميكرولتر في أعمدة 6-10 والأعمدة 16-20 من الثانية المؤهلين سمعيا 384 جيدا صفيحة البولي بروبلين. وسميت هذه لوحة "لوحة مصدر B '.
8. أجهزة الطرد المركزي لوحات مصدر A و B في 300 x ج لمدة 1 دقيقة. تتضمن لوحة التوازن المناسب.
9. استخدام flui الصوتيةد موزعات دمجها في نظام روبوتي الآلي لإعداد ثلاثة متتابعة 1: 100 التخفيفات المتوسطة (العازلة في الفحص) من أسهم الببتيد 100X من العمود 1 في مصدر A.
   ملاحظة: البرمجة يتطلب إعادة صياغة لوحة وبرامج الاستجابة للجرعة (على النحو المنصوص عليه من قبل الشركة المصنعة للموزع السائل الصوتية) للسماح ثلاث تحويلات الصوتية بين مصدر A و B مصدر (انظر الشكل 1 لتخطيطات لوحة). الخطوة 1.9 من التفاصيل على وجه التحديد استخدام موزعات السوائل المستخدمة في هذا المختبر تحت السيطرة الروبوتية الآلي (انظر المواد الجدول):
   1. لوحات مصدر تحميل ولوحات الفحص إلى لوحة الباب فندق الروبوتات.
   2. فتح الآلي البرمجيات الروبوتية وتحميل لوحة إعادة صياغة والاستجابة للجرعة بروتوكولات توسيع البرنامج. انقر على "تشغيل".
      ملاحظة: أتمتة يرشد إلى موزع السائل الصوتية لنقل 250 نيكولا لانغ من أعمدة 1-5 من مصدر لوحة وفي أعمدة 10/6 من لوحة مصدر B، وacousti الثانيج السائل موزع قادر على التعامل مع كميات السوائل أكبر لالردم مع العازلة مقايسة 15 ميكرولتر إلى المزيج. الأتمتة ثم ينقل لوحة مصدر B لأجهزة الطرد المركزي المتكاملة وأجهزة الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 1 دقيقة (يتم تضمين لوحة التوازن مناسبة لجميع الخطوات الطرد المركزي). يتم إرجاع لوحة مصدر باء لموزع السائل الصوتية لنقل 250 نيكولا لانغ من الأعمدة 6-10 من مصدر لوحة B إلى أعمدة 11-15 من مصدر لوحة (أ) وإعادة ملء مع العازلة مقايسة 15 ميكرولتر إلى المزيج. أتمتة عمليات نقل مصدر لوحة من ألف إلى الطرد المركزي المتكاملة وأجهزة الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 1 دقيقة. لوحة مصدر وبعد ذلك عاد إلى موزع السائل الصوتية لنقل 250 نيكولا لانغ من الأعمدة 11-15 من مصدر لوحة وفي أعمدة 16-20 من مصدر لوحة باء وإعادة ملء مع العازلة مقايسة 15 ميكرولتر إلى المزيج. الأتمتة ثم ينقل لوحة مصدر B لأجهزة الطرد المركزي المتكاملة وأجهزة الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 1 دقيقة.
      ملاحظة: وأخيرا بروتوكول الاستجابة للجرعة يوجه صرفها الصوتية لنقلحجم المطلوب من كل واحد من 4 آبار لوحة مصدر تخفيفه بشكل متسلسل (في كل لوحة مصدر ألف ولوحة مصدر B) لبناء منحنى 11 نقطة كاملة من نسختين في لوحات الفحص (معبأة سلفا مع العازلة مقايسة 5 ميكرولتر في الخطوة 1.2 أعلاه ). نقل أتمتة لوحة الفحص لأجهزة الطرد المركزي المتكاملة وأجهزة الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 1 دقيقة.

2. خلية التحضير

1. cryopreserved الصيني الهامستر المبيض (CHO) خلايا ذوبان التعبير عن مستقبلات الماوس الهدف GLP-1 بسرعة في حمام 37 درجة مئوية المياه و resuspend العازلة في فحص 20 مل.
2. تعليق خلية أجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 200 x ج في درجة حرارة الغرفة (RT). تشمل التوازن المناسب.
3. تجاهل طاف و resuspend بيليه خلية في المخزن فحص 10 مل.
4. تمييع الأسهم الخلية 1: 1 في التريبان الأزرق وتحديد كثافة الخلايا قابلة للحياة باستخدام عداد الخلية الآلي. Resuspend الخلايا في المخزن فحص عند 1.6 × 10 ⁶ خلايا لكل مل (أي ما يعادل 8000 خلية لكل أهلا وسهلالتر من وحات الفحص).
5. استخدام موزع كاشف المجمع لإضافة 5 ميكرولتر من خلية إلى تعليق كل بئر من لوحات الفحص (التي تحتوي على الببتيدات تخفيفه بشكل متسلسل في المخزن فحص 5 ميكرولتر) واحتضان على RT لمدة 30 دقيقة.

3. HTRF كشف مخيم الفحص

1. جلب HTRF المخيم عدة الاختبار لRT لمدة 30 دقيقة قبل الاستخدام.
2. إعداد كل كاشف HTRF (cryptate و D2) بشكل منفصل في 1:20 التخفيف في تحلل العازلة (صياغة الملكية، وتوفرها الشركة المصنعة من مخيم كشف الفحص).
   ملاحظة: تنبيه: تحلل عازلة يحتوي على الفلورايد البوتاسيوم (KF) التي هي سامة ومشوه ^13. للتخلص منها، لوحات فحص تحتوي على KF يجب أن تكون مختومة وحرقها، ويجب أن تضعف أي النفايات السائلة إلى <1 مليمول / لتر مع الماء قبل التخلص منها في الحوض.
3. استخدام موزع كاشف المجمع لإضافة 5 ميكرولتر cryptate كاشف لجميع الآبار لوحات الفحص.
4. استخدام موزع كاشف المجمع لإضافة 5 ميكرولتر D2 كاشف لكولومNS 1-22 من لوحات الفحص.
5. على الفور يدويا ماصة العازلة تحلل 5 ميكرولتر في الآبار A23-D24 لوحات الفحص لإعطاء غير محددة ملزمة (جهاز الأمن القومي) آبار المراقبة، و 5 ميكرولتر من كاشف D2 في الآبار E23-P24.
6. أجهزة الطرد المركزي لوحات فحص لمدة 1 دقيقة في 200 x ج في RT لخلط الآبار.
7. تغطية لوحات فحص لتقليل التبخر والصور وتبييض واحتضانها في RT لمدة 1 ساعة.
8. قياس مضان نقل الطاقة الرنين (الحنق) إشارة باستخدام الإثارة في 320 نانومتر، والانبعاثات في 620 نانومتر و 665 نانومتر باستخدام قارئ لوحة.

تحليل 4. البيانات

1. استخدام يعني جهاز الأمن القومي لطرح خلفية من جميع الآبار.
2. احسب٪ دلتا F من 665 نانومتر 620 / نسبة نانومتر على النحو التالي:
   نسبة = (A _665nm / _620nm و) × 10 ⁴
   دلتا F = ((نسبة العينة - نسبة _{جهاز الأمن القومي)} / نسبة _{جهاز الأمن القومي))} × 100
   حيث نسبة _{جهاز الأمن القومي} = الآبار مع عدم وجود كاشف D2.
3. احسب٪ activatأيون بين الخلايا unstimulated والخلايا حفز مع الحد الأقصى GLP-1 يجند على النحو التالي:
   ٪ تفعيل = (٪ دلتا Fsample -٪ خلايا DeltaFunstimulated) / (٪ خلايا DeltaFGLP-1 حفز -٪ DeltaF الخلايا unstimulated) × 100
4. تحليل منحنيات تركيز الاستجابة عن طريق التحليل اللوجستي 4-المعلمة، والرسم البياني كما تفعيل٪ كما هو محدد من قبل السيطرة إشارة ^1.

النتائج

نحن نستخدم بشكل روتيني طريقة من خطوتين لتخفيف الببتيدات عبر نقل الصوتية. للخطوة الأولى، يتم استخدام موزع الصوتية تتماشى مع أتمتة لإنشاء أربعة التخفيفات وسيطة الأسهم الببتيد عبر اثنين من لوحات المصدر (الشكل 1A، ب). للخطوة الثاني...

Discussion

يصف هذا البروتوكول التطبيق الناجح لصرف الصوتية المؤتمتة لتمييع متسلسل عينات الببتيد على نطاق تركيز 3 × 10 ⁶ تتطلب أقل من 1 ميكرولتر من العينة. والميزة الرئيسية لهذه الطريقة لزيادة جودة البيانات من خلال التقليل من الببتيد الامتزاز إلى بلستيكور عبر خفض التعرض للعي...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Hanks’ Balanced Salt solution	Sigma-Aldrich	H8264
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	A9418
3-Isobutyl-1-methylxanthine	Sigma-Aldrich	I7018	Prepared as a 0.5 M stock in DMSO
GLP-1 (7-36) amide	Bachem	H-6795	Prepared as a 1 mg/ml stock in PBS, referred to as '100x reference control'
Test peptides	Produced in-house at MedImmune		Supplied at various concentrations in DMSO or PBS as appropriate
100x peptide stock	Produced in-house at MedImmune		Test peptide diluted into assay buffer to 100x final required concentration
Trypan Blue Solution, 0.4%	Thermo Fisher Scientific	15250-061
Cedex XS Cell Analyzer	Innovatis
Corning 384 well plates, low volume	Sigma-Aldrich	4514
Echo Qualified 384-Well Polypropylene Microplate	Labcyte Inc.	P-05525
Echo Qualified Reservoir	Labcyte Inc.	ER-0055
Echo 550 Liquid Handler	Labcyte Inc.		Droplet transfer volumes in increments of 2.5 nl
Echo 525 Liquid Handler	Labcyte Inc.		Droplet transfer volumes in increments of 25 nl
ACell Benchtop Automation	HighRes Biosolutions	MC522
Cellario Lab Automation Scheduling software for Life Science Robotics	HighRes Biosolutions
MultidropCombi Reagent Dispenser	ThermFisher Scientific	5840300	Referred to as 'bulk reagent dispenser'
HTRF cAMP Dynamic 2 kit	Cisbio Bioassays	62AM4PEJ
EnVision Multilabel Reader	PerkinElmer