אקוסטית אוטומטית מחלק עבור דילול סדרה של אגוניסטים פפטיד ב מבחני קביעת און

Summary

Peptide adsorption to plasticware during traditional tip-based serial dilutions can significantly impact potency determination and confound the understanding of structure-activity relationships used for lead identification and lead optimization phases of drug discovery. Here methods for automated acoustic non-contact serial dilution of peptide samples are described.

Abstract

כמו גילוי תרופות מולקולה קטנה, בדיקות סקר לאיתור אגוניסטים פפטיד מחייב דילול סדרתי של פפטידים לייצר תגובה עקומות ריכוז. הקרנת פפטידים מעניקה שכבה נוספת של מורכבות כמו שיטות טיפול מדגם קונבנציונליות מבוסס קצה לחשוף פפטידים על שטח פנים גדול של plasticware, מתן הזדמנות מוגברת אובדן פפטיד באמצעות ספיחה. מניעת חשיפה מוגזמת plasticware מפחית אובדן פפטיד באמצעות דבקות פלסטיק ובכך מצמצם אי דיוקים חיזוי עוצמה, ואנו בעבר תיאר את היתרונות של אקוסטית ללא מגע מחלק להקרנה במבחנה תפוקה גבוהה של אגוניסטים פפטיד ^1. כאן אנו דנים פתרון אוטומציה משולבים במלואם להכנת אקוסטי ללא מגע של דילולים סדרתי פפטיד צלחות microtiter ניצול בדוגמה של ההקרנה עבור אגוניסטים פפטיד על קולטן גלוקגון דמוי עכבר פפטיד-1 (GLP-1R). השיטות שלנו לאפשר גבוה-throughput מבוסס תאי מבחני למסך עבור אגוניסטים והם להרחבה בקלות לתמוך תפוקת מדגם גדלה, או כדי לאפשר למספר גדול יותר של עותקי צלחת assay (למשל, עבור פנל של קווים נוספים תא המטרה).

Introduction

של GLP-1R מהווה יעד תרופה קיימת לטיפול בסוכרת מסוג 2 ^2. אגוניסט פפטיד המקורי עבור קולטן זה, GLP-1, יש in vivo זמן מחצית חיים של 2-3 דק ^'3. הכריכה של GLP-1 לתוצאות קולטן היעד מצמידים חלבון G שלה בייצור במורד הזרם של cAMP השליח השני באמצעות צימוד חלבון יליד ז 'ההפעלה של cyclase adenylyl. מדידה במחנה שנצבר מספקת assay חזק כדי לפקח הפעלת קולטן ו למסך אנלוגים GLP-1 פעילים עם מאפייני physicochemical מועדפים. כזה assay מחייב דילול סדרה של דגימות בדיקה לבנות תגובה עקומה ריכוז, וזה מסובך במיוחד בעת מסירת דגימות פפטיד. שגיאות פוטנציאליות מהכנת דילול סדרה מבוסס קצה תוארו בעבר ^1,4,5. פפטידים יהיה לספוג plasticware, וכתוצאה מכך הערכות עצמה אמינות. ניתן למזער אובדן פפטיד באמצעות tהוא הכללת אלבומין בסרום שור (BSA) מאגרים ושימוש plasticware siliconized, עדיין חלבון מחייב נשאר בלתי צפויות. בפרט, וריאציה עקדת GLP-1 למיכלי ניסיוני תוארה ^6. יש סיבוך נוסף סוכני ייצוב לזה המשמש plasticware מעבדה יכול לסנן מן טיפי צלחות microtiter לתוך מאגרי assay מימית ולהפריע חלבון פונקציה ^{7, 8.} לכן, שיטות להקטין את חשיפת plasticware נחוצה כדי לשפר את מידת הדיוק של מדידות.

מכשירי נוזלי אקוסטיות להתמקד צליל האקוסטי בתדירות גבוהה על פני השטח של מדגם נוזל, וכתוצאה מכך הוא הוצאתן של טיפות nanoliter מדויקות לתוך צלחת assay סמוכה ^9. השימוש של פליטה אקוסטית הוא סטנדרטי בתעשיית התרופות לעריכת הקרנת ספריות תרכובת סינטטיות גדולות, ואת הטכנולוגיה תאומת טוב molecul הקטןes ^10. למיטב ידיעתנו, אנחנו הקבוצה הראשונה לתאר מחלק אקוסטי לעריכת פפטידים רקומביננטי וסינטטיים ואנחנו בעבר דיווחנו על הדיוק המשופר בהשוואה לשיטות קצה מבוסס קונבנציונליות ^1.

מאמר זה מתאר את האינטגרציה של הכנת דילולים סדרתי וישיר פפטיד בהעברה אקוסטי ללא מגע על גבי מערכת רובוטיקה טיפול צלחת אוטומטי לחלוטין. מספר השיטות המקיפות העברת אקוסטי של דגימות תוארו בעבר ^11. אנו מנצלים שיטת שני שלבים להכין ריכוזי מניות ביניים לדלל אנלוגים פפטיד סדר עבור הדור של עקומת מנה-תגובה המלאה. פפטידים מוכן מודגרת עם תאים המבטאים את עכבר היעד GLP-1R, ואנו משתמשים קרינת זמן נפתר הומוגנית זמין מסחרי (HTRF) assay למדוד הצטברות cAMP בתוך התאים האלה כמו הודעה של activ אגוניסט פפטידity. Assay הוא חזק מקובל בפורמט תפוקה גבוהה 384 גם ויישמנו באופן שיגרתי הוא בפיתוח assay הקרנת סמי פרויקטים ^12.

Protocol

1. דילול סדרתי פפטיד

1. הכן חיץ assay: הנקס שנאגרו תמיסת מלח (HBSS) השלימו עם 25 HEPES מ"מ, BSA 0.1% ו -0.5 מ"מ 3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX), pH 7.4.
2. השתמש מנפק מגיב בתפזורת להוסיף באופן שיטתי 5 μl של חיץ assay היטב בכל חמש 384 גם צלחות assay בנפח נמוכות.
   1. השתמש בתוכנה פנימית ליצירת תכנית מחלק לתוספת נפח 5 μl לכל גם צלחת 384-גם לפי הוראות יצרן.
   2. לטבול מחלק צינורות קלטת חיץ assay נוזל הממשלה.
   3. מניחים צלחת assay בנפח נמוך 384 גם על נושאת צלחת.
   4. לחץ התחל.
3. לדלל כל דגימות פפטיד, ללא קשר לרכב אחסון, למאגר assay לייצר מלאי פפטיד 100x.
   הערה: פפטידים מחייב הקרנה ניתן לספק מלוח פוספט שנאגר (PBS) או sulfoxide דימתיל (DMSO) כפי שייראה לו (למשל, DMSO wחולה יש השפעה מזיקה על פפטידים עם שינויים משניים כגון PEGylation).
4. לוותר 25 μl מניות פפטיד 100x לעמודות 1-5 של microplate פוליפרופילן מוסמך אקוסטית 384 גם. צלחת זו מיועדת ל'מקור צלחת '. ודא צלחות מקור, אך לא צלחות יעד, הם תחתיים שטוחים להתאים לסיבולות אקוסטי ספציפית כפי שהוגדר על ידי היצרן של כלים אקוסטיים.
5. לוותר 25 μl 100x מלא התייחסות אל בארות A23 ו A24 של א צלחת המקור
6. לוותר חיץ assay 10 μl לעמודות 11-15 ו -30 חיץ assay μl לעמודות 21-22 א צלחת מקור
7. לוותר חיץ assay 10 μl לעמודות 6-10 ועמודות 16-20 של microplate פוליפרופילן השני מוסמך אקוסטית 384 גם. צלחת זו מיועדת ל'מקור צלחת ב '.
8. A ו- B צלחות מקור צנטריפוגה XG ב 300 דקות 1. כלול צלחת איזון ראויה.
9. השתמש flui אקוסטימכשירי ד משולב לתוך מערכת רובוטית אוטומטית להכין שלושה רציפים 1: דילולים ביניים 100 (חיץ assay) של מניות פפטיד 100x מעמודה 1 במקור א
   הערה: תכנות דורש לעצב מחדש צלחת ותוכנת מנת תגובה (כפי שנמסר על ידי היצרן של מנפק נוזל אקוסטי) כדי לאפשר שלוש העברות אקוסטי בין מקור ומקור B (ראה איור 1 עבור פריסות צלחת). שלב 1.9 פרטים במיוחד השימוש של מכשירי נוזל המשמשים במעבדה זו בשליטת רובוטיות אוטומטית (ראה לוח חומרים):
   1. צלחות מקור טען וצלחות assay לתוך קטע רובוטיקה מלון צלחת.
   2. להרחיב אוטומטי לעצב מחדש צלחת תוכנת עומס רובוטית ופרוטוקולי הרחבת תכנית מנת תגובה. לחץ על 'הפעלה'.
      הערה: אוטומציה מורה מנפק נוזל אקוסטי להעביר 250 NL מעמודות 1-5 של מקור צלחת לעמודות 6-10 של מקור צלחת B, וכן acousti השניג מנפק נוזל מסוגל להתמודד עם כמויות נוזלים גדולות להשלים רווחים עם 15 μl חיץ assay לערבב. אוטומציה ואז מעבירה מקור צלחת ב 'צנטריפוגות משולבת צנטריפוגות ב XG 300 דקות 1 (צלחת איזון ראויה כלולה עבור כל צעדי צנטריפוגה). B צלחת מקור מוחזר מנפק נוזל אקוסטי להעברת 250 NL מעמודות 6-10 המקור צלחת B לעמודות 11-15 של צלחת המקור למילוי עם חיץ assay 15 μl לערבב. אוטומצית מקור העברות צלחת א 'עד צנטריפוגות צנטריפוגות משולבות XG ב 300 דקות 1. צלחת מקור ואז מוחזר מנפק נוזל אקוסטי להעברת 250 NL מעמודות 11-15 של צלחת המקור לתוך עמודות 16-20 של B צלחת המקור למילוי עם חיץ assay 15 μl לערבב. אוטומציה ואז מעבירה מקור צלחת ב 'צנטריפוגות משולבת צנטריפוגות ב XG 300 דקות 1.
      הערה: לבסוף פרוטוקול מנת התגובה מפנה מחלק אקוסטי להעבירהנפח הנדרש מכל אחד 4 בארות צלחת המקור בדילול סדרתי (בשני צלחת המקור ומקור צלחת B) לבנות עקום 11 נקודות מלאות בשני עותקי צלחות assay (טרום מלא חיץ assay 5 μl בשלב 1.2 לעיל ). העברות אוטומציה צלחת assay כדי צנטריפוגות משולב צנטריפוגות ב XG 300 דקות 1.

2. תא הכנה

1. שחלה של אוגר סיני cryopreserved ההפשרה (CHO) התאים המבטאים את הקולטן ל- GLP-1 העכבר היעד במהירות באמבט 37 ºC מים resuspend במאגר assay 20 מ"ל.
2. ההשעיה תא צנטריפוגה במשך 5 דקות ב 200 XG בטמפרטורת החדר (RT). כלול איזון ראוי.
3. בטל supernatant ו resuspend תא גלולה במאגר assay 10 מ"ל.
4. לדלל תא מניות 1: 1 בכחול Trypan ולקבוע צפיפות תאי קיימא באמצעות דלפק תא אוטומטי. תאים Resuspend במאגר assay ב 1.6 x 10 ⁶ תאים לכל מ"ל (שווה ערך ל 8,000 תאים לכל well של צלחות assay).
5. השתמש מנפק מגיב בתפזורת להוסיף 5 μl של ההשעיה תא היטב כל צלחות assay (המכיל פפטידים בדילול סדרתי חיץ assay 5 μl) ו לדגור על RT למשך 30 דקות.

3. Assay איתור HTRF cAMP

1. תביאו ערכת assay HTRF cAMP ל RT למשך 30 דקות לפני השימוש.
2. הכן כל מגיב HTRF (cryptate ו- D2) בנפרד בשעה 1:20 דילול במאגר תמוגה (ניסוח קניינית, המסופקים על ידי היצרן של assay זיהוי cAMP).
   הערה: זהירות: תמוגה חיץ מכיל פלואוריד אשלגן (KF) שהוא רעיל וכן teratogen ^13. למידע אודות השלכה, צלחות assay המכילות KF צריכות להיות אטומות לאפר, וכל פסולת נוזלית חייבת להיות מדוללת ל <1 מילימול / ליטר עם מים לפני הסילוק לתוך הכיור.
3. השתמש מנפק מגיב בתפזורת להוסיף מגיב cryptate 5 μl לכל הבארות של צלחות assay.
4. השתמש מנפק מגיב בתפזורת להוסיף מגיב D2 5 μl כדי קולוםns 1-22 של צלחות assay.
5. מיד ידני פיפטה חיץ תמוגה 5 μl לתוך בארות A23-D24 של צלחות assay לתת ספציפיים שאינם מחייבים (NSB) בארות שליטה, ו -5 μl של מגיב D2 לתוך בארות E23-p24.
6. צנטריפוגה צלחות assay דקות 1 ב 200 XG ב RT לערבב את הבארות.
7. מכסה את צלחות assay למזער התאדות צילום הלבנה לדגור על RT במשך שעה 1.
8. מדוד תהודת העברת אנרגית פלואורסצנטי (סריג) אות באמצעות עירור ב 320 ננומטר פליטה ב 620 ננומטר ו 665 ננומטר באמצעות קורא צלחת.

ניתוח 4. נתונים

1. השתמש מתכוון NSB לחסר רקע מכל הבארות.
2. חישוב% דלתא F מיחס 665 ננומטר / 620 ננומטר כדלקמן:
   יחס = (A _665nm / A _620nm) x 10 ⁴
   דלתא F = ((יחס לדוגמה - יחס _NSB) / יחס _NSB)) x 100
   שם יחס _NSB = בארות ללא מגיב D2.
3. חישוב activat%יון בין תאים ותאי unstimulated מגורה עם ליגנד GLP-1 המרבי כדלקמן:
   הפעלת% = (% דלתא Fsample -% תאים DeltaFunstimulated) / (% מגורה DeltaFGLP-1 תאים -% תאים unstimulated DeltaF) x 100
4. לנתח עקומות ריכוז תגובה באמצעות ניתוח לוגיסטי 4-פרמטר, וגרף כפי הפעלת% כפי שהוגדר על ידי התייחסות מלאה ^1.

תוצאות

אנו משתמשים באופן שגרתי בשיטה דו-צעד כדי לדלל פפטידים באמצעות העברה אקוסטית. עבור השלב הראשון, מנפק אקוסטי מיושר עם אוטומציה משמש ליצירת ארבעה דילולים ביניים פפטיד המניות על פני שני לוחות מקור (איור 1 א, ב). עבור השלב השני, אנו מש?...

Discussion

פרוטוקול זה מתאר את היישום המוצלח של מחלק אקוסטי האוטומטי לדלל דגימות פפטיד סדרתי על פני טווח ריכוז של 3 x 10 ⁶ הדורשים פחות מ -1 μl של מדגם. היתרון העיקרי של שיטה זו הוא לשפר את איכות נתונים באמצעות מזעור ספיחת פפטיד plasticware באמצעות לחשיפה מצומצמת של דגימות למכלי ניס?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Hanks’ Balanced Salt solution	Sigma-Aldrich	H8264
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	A9418
3-Isobutyl-1-methylxanthine	Sigma-Aldrich	I7018	Prepared as a 0.5 M stock in DMSO
GLP-1 (7-36) amide	Bachem	H-6795	Prepared as a 1 mg/ml stock in PBS, referred to as '100x reference control'
Test peptides	Produced in-house at MedImmune		Supplied at various concentrations in DMSO or PBS as appropriate
100x peptide stock	Produced in-house at MedImmune		Test peptide diluted into assay buffer to 100x final required concentration
Trypan Blue Solution, 0.4%	Thermo Fisher Scientific	15250-061
Cedex XS Cell Analyzer	Innovatis
Corning 384 well plates, low volume	Sigma-Aldrich	4514
Echo Qualified 384-Well Polypropylene Microplate	Labcyte Inc.	P-05525
Echo Qualified Reservoir	Labcyte Inc.	ER-0055
Echo 550 Liquid Handler	Labcyte Inc.		Droplet transfer volumes in increments of 2.5 nl
Echo 525 Liquid Handler	Labcyte Inc.		Droplet transfer volumes in increments of 25 nl
ACell Benchtop Automation	HighRes Biosolutions	MC522
Cellario Lab Automation Scheduling software for Life Science Robotics	HighRes Biosolutions
MultidropCombi Reagent Dispenser	ThermFisher Scientific	5840300	Referred to as 'bulk reagent dispenser'
HTRF cAMP Dynamic 2 kit	Cisbio Bioassays	62AM4PEJ
EnVision Multilabel Reader	PerkinElmer