Automated acustico di erogazione per la diluizione seriale di Peptide Agonisti in potenza Determinazione Assays

Riepilogo

Peptide adsorption to plasticware during traditional tip-based serial dilutions can significantly impact potency determination and confound the understanding of structure-activity relationships used for lead identification and lead optimization phases of drug discovery. Here methods for automated acoustic non-contact serial dilution of peptide samples are described.

Abstract

Come con la scoperta di nuovi farmaci piccola molecola, lo screening per agonisti peptidici richiede la diluizione di serie di peptidi per la produzione di curve concentrazione-risposta. Screening peptidi offre un ulteriore livello di complessità convenzionali metodi di trattamento del campione con punta a base espongono peptidi ad una grande superficie di plasticware, fornendo una maggiore possibilità di perdita peptide tramite adsorbimento. Prevenire l'eccessiva esposizione al plasticware riduce la perdita di peptide attraverso l'adesione alla plastica e, quindi, riduce al minimo le imprecisioni in potenza previsione, e abbiamo precedentemente descritto i vantaggi di non-contatto acustico erogazione in vitro high-throughput screening di agonisti peptidici ^1. Qui si discute di una soluzione di automazione completamente integrata per la preparazione senza contatto acustico di diluizioni seriali peptide in piastre microtitolazione che utilizza l'esempio di screening per agonisti peptidici al glucagone-like peptide-1 del recettore del mouse (GLP-1R). I nostri metodi consentono per altatest per lo screening per agonisti -throughput cell-based e sono facilmente scalabile per supportare un aumento di campioni, o per consentire un aumento del numero di copie targa test (ad esempio, per un gruppo di più linee cellulari di destinazione).

Introduzione

Il GLP-1R è un altro obiettivo stabilito nel trattamento del diabete di tipo 2 ^2. L'agonista peptide nativo per questo recettore, GLP-1, ha un in vivo emivita di 2-3 min ^3. Il legame di GLP-1 ai suoi accoppiati alle proteine ​​G risultati recettore bersaglio nella produzione a valle del secondo messaggero cAMP attraverso l'accoppiamento nativo proteina G per l'attivazione di adenilato ciclasi. Misura del campo accumulato fornisce un saggio robusto per monitorare l'attivazione del recettore e per lo screening attivi GLP-1 analoghi con proprietà fisico-chimiche preferite. Tale test richiede la diluizione seriale di campioni per costruire curve concentrazione-risposta, e questo è particolarmente complicato quando consegna campioni peptidici. I potenziali errori di preparazione diluizione in serie punta a base sono stati descritti in precedenza ^1,4,5. Peptidi viene fortemente assorbito dalle plasticware, con conseguente stime potenza inaffidabili. perdita di peptidi può essere minimizzato attraverso tegli inclusione di albumina sierica bovina (BSA) in buffer e l'uso di plasticware siliconato, eppure proteina legante rimane imprevedibile. In particolare, la variazione nel legame di GLP-1 per contenitori sperimentali è stato descritto ^6. C'è un ulteriore complicazione che gli agenti di stabilizzazione utilizzati in laboratorio plasticware può fuoriuscire dalle punte e piastre microtiter nel buffer dosaggio acquosi e interferire con la funzione della proteina ^{7, 8.} Pertanto, i metodi per ridurre l'esposizione al plasticware sono necessari per aumentare la precisione delle misurazioni.

Acustici dosatori concentrano un segnale acustico ad alta frequenza sulla superficie di un campione di fluido, con conseguente espulsione delle goccioline precise nanolitri in una piastra di test adiacente ^9. L'uso di eiezione acustica è standard nell'industria farmaceutica per la preparazione e lo screening di grandi librerie di composti sintetici, e la tecnologia è stata ben validata per piccole moleculES ^10. A nostra conoscenza, siamo il primo gruppo a descrivere erogazione acustico per la preparazione di peptidi ricombinanti e sintetici e abbiamo precedentemente riportato la maggiore precisione rispetto ai metodi di punta a base convenzionale ^1.

Questo articolo descrive l'integrazione della preparazione di peptidi diluizioni seriali e da trasferimento acustico senza contatto su un sistema di robotica movimentazione piatto completamente automatizzato. Un certo numero di metodi che comprendono trasferimento acustica di campioni sono stati descritti in precedenza ^11. Utilizziamo un metodo in due fasi per preparare concentrazioni archivi intermedi e diluire serialmente analoghi peptidici per la generazione della curva dose-risposta completa. I peptidi preparati vengono incubate con cellule che esprimono il mouse bersaglio GLP-1R, e usiamo un test disponibile in commercio omogenea risolta nel tempo di fluorescenza (HTRF) per misurare l'accumulo di cAMP all'interno di queste cellule come una lettura di peptide activ agonistilità. Il test è robusto e suscettibili di un high-throughput formato 384-bene e regolarmente applicata sia sviluppo test e lo screening di stupefacenti progetti ^12.

Protocollo

1. Peptide diluizione in serie

1. Preparare tampone: Hanks tamponata soluzione salina (HBSS) supplementato con 25 mM HEPES, 0,1% BSA e 0,5 mM 3-isobutil-1-metilxantina (IBMX), pH 7,4.
2. Utilizzare un distributore di reagente di massa per aggiungere sistematicamente 5 ml di tampone in ciascun pozzetto di cinque piastre da 384 pozzetti a basso dosaggio di volume.
   1. Utilizzare software interno per creare un programma di erogazione di 5 ml di volume, oltre ad ogni pozzetto di una piastra a 384 pozzetti secondo le istruzioni del produttore.
   2. Immergere l'erogazione di tubi cassetta nel tampone e liquido Prime.
   3. Mettere a 384 pozzetti basso volume piastra di test sul supporto piatto.
   4. Premi start.
3. Diluire tutti i campioni di peptidi, indipendentemente dal veicolo di stoccaggio, in tampone per produrre un peptide magazzino 100x.
   NOTA: I peptidi che richiedono lo screening possono essere fornite in PBS (PBS) o Dimetilsolfossido (DMSO) come si ritiene opportuno (per esempio, DMSO will avere un effetto deleterio sulla peptidi con modifiche secondarie come PEGylation).
4. Dispensare 25 ml scorte peptide 100x in colonne 1-5 di acusticamente qualificato in polipropilene 384 pozzetti micropiastra. Questo piatto è designato 'piastra fonte A'. Assicurarsi che i piatti di origine, ma non piatti di destinazione, sono a fondo piatto e conformarsi alle tolleranze acustiche specifiche, come definito dal costruttore di strumenti acustici.
5. Erogare controllo di riferimento 100x 25 ml in pozzi A23 e A24 della piastra fonte A.
6. Dispensare 10 microlitri tampone in colonne 11-15 e tampone 30 microlitri in colonne 21-22 di targa fonte A.
7. Dispensare 10 microlitri tampone in colonne e colonne 6-10 16-20 di secondo acusticamente qualificato 384 pozzetti in polipropilene micropiastra. Questo piatto è designato 'piastra sorgente B'.
8. Centrifuga piastre sorgente A e B a 300 xg per 1 min. Include una piastra di giusto equilibrio.
9. Utilizzare flui acusticod distributori integrati in un sistema robotico automatizzato per preparare tre sequenziali 1: 100 diluizioni intermedie (in tampone) degli stock peptidici 100x da colonna 1 in fonte A.
   NOTA: La programmazione richiede piatto riformattazione e software dose-risposta (come fornito dal produttore del distributore di fluido acustico) per consentire tre trasferimenti acustici tra Source A e Source B (vedi Figura 1 per i layout piastra). Passo 1.9 dettagli specificamente l'uso di dispensatori di fluido utilizzato in questo laboratorio sotto controllo robotico automatizzato (vedi Materiali Tavolo):
   1. piastre sorgente di caricamento e piastre di test in piastra sezione albergo della robotica.
   2. Aprire il software robot automatizzati e di carico piatto riformattazione e protocolli di espansione programma di dose-risposta. Fare clic su 'Esegui'.
      NOTA: Automazione istruisce un distributore di fluido acustica per trasferire 250 nl dalle colonne 1-5 di piatto sorgente A in colonne 6-10 su piastra sorgente B, e un secondo Acoustidispenser fluido C in grado di gestire volumi di fluido più grandi per riempire con 15 microlitri tampone per mescolare. Automazione trasferisce poi piastra sorgente B a centrifuga integrato e centrifughe a 300 xg per 1 min (una piastra equilibrio adeguato è incluso per tutte le fasi di centrifugazione). piatto di origine B viene restituito al distributore di fluido acustica per il trasferimento di 250 nl dalle colonne 6-10 di provenienza piastra B in colonne 11-15 di targa sorgente A ed il riempimento con tampone 15 microlitri per mescolare. Automazione piatto trasferimenti fonte dalla A alla centrifuga e centrifughe a 300 xg per 1 min integrato. Piastra Source A viene quindi restituito al distributore di fluido acustica per il trasferimento di 250 nl dalle colonne 11-15 di targa sorgente A in colonne 16-20 di provenienza piastra B ed il riempimento con tampone 15 microlitri per mescolare. Automazione trasferisce poi piastra sorgente B a centrifuga e centrifughe integrato a 300 xg per 1 min.
      NOTA: Infine, il protocollo di risposta alla dose dirige erogazione acustica per trasferireil volume richiesto a ciascuno dei 4 pozzetti della piastra sorgente diluite in serie (in entrambe piastra sorgente A e la piastra sorgente B) per costruire una curva di pieno 11 punti in duplicato in piastre di saggio (pre-riempito con tampone 5 microlitri al passo 1.2 ). trasferimenti di automazione piastra test a centrifuga integrato e centrifughe a 300 xg per 1 min.

2. Preparazione delle cellule

1. crioconservati ovariche di criceto cinese (CHO), le cellule che esprimono Scongelare rapidamente il recettore del mouse bersaglio GLP-1 in un bagno d'acqua 37 ° C e risospendere in 20 ml di tampone.
2. sospensione cellulare Centrifugare per 5 min a 200 xg a temperatura ambiente (RT). Includere un giusto equilibrio.
3. Gettare il surnatante e risospendere pellet cellulare in 10 ml di tampone.
4. Diluire cella stock 1: 1 in Trypan blu e determinare la densità di cellule vitali mediante un contatore di cellule automatizzato. Risospendere le cellule in tampone a 1,6 x 10 ⁶ cellule per ml (equivalenti a 8.000 cellule per well di piastre del saggio).
5. Utilizzare un dispensatore di reagente bulk aggiungere 5 ml di sospensione cellulare in ciascun pozzetto di piastre di saggio (contenenti peptidi serialmente diluiti in tampone 5 microlitri) e incubare a temperatura ambiente per 30 min.

Assay 3. HTRF cAMP Detection

1. Portare HTRF cAMP kit di analisi per RT per 30 minuti prima dell'uso.
2. Preparare ogni reagente HTRF (criptato e d2) separatamente in diluizione 1:20 in tampone di lisi (formulazione proprietaria, fornito dal produttore del test di rilevamento cAMP).
   NOTA: ATTENZIONE: Lysis buffer contiene fluoruro di potassio (KF), che è tossico e teratogeno ^13. Per lo smaltimento, piastre di test contenenti KF devono essere sigillati e inceneriti, e qualsiasi rifiuto liquido devono essere diluiti a <1 mmol / L con acqua prima dello smaltimento nel lavandino.
3. Utilizzare un distributore di reagente di massa per aggiungere 5 ml di reagente criptato a tutti i pozzetti delle piastre test.
4. Utilizzare un distributore di reagente di massa per aggiungere 5 ml di reagente D2 a Columns 1-22 delle piastre di saggio.
5. Immediatamente pipetta manualmente tampone di lisi 5 ml in pozzi A23-D24 delle piastre di analisi per dare pozzetti di controllo (NSB) legame non specifico, e 5 ml di reagente D2 nei pozzetti E23-P24.
6. Centrifugare le piastre test per 1 min a 200 xg a temperatura ambiente per mescolare i pozzetti.
7. Coprire le piastre test per ridurre al minimo l'evaporazione e la foto-candeggio e incubare a temperatura ambiente per 1 ora.
8. Misurare segnale di fluorescenza trasferimento di energia di risonanza (FRET) con eccitazione a 320 nm ed emissione a 620 nm e 665 nm usando un lettore di piastre.

Analisi 4. I dati

1. Utilizzare significare NSB per sottrarre sfondo da tutti i pozzetti.
2. Calcolare% Delta F dal / 620 rapporto di 665 nm nm come segue:
   Rapporto = (A _665nm / A _620nm) x 10 ⁴
   Delta F = ((Rapporto Campione - Rapporto _NSB) / Rapporto _NSB)) x 100
   dove Rapporto _NSB = pozzi senza reagente D2.
3. Calcola% attivata siaion tra le cellule e le cellule non stimolate stimolati con massima GLP-1 ligando come segue:
   attivazione% = (% Delta Fsample -% cellule DeltaFunstimulated) / (% di cellule DeltaFGLP-1 stimolato -% cellule non stimolate deltaF) x 100
4. Analizzare curve concentrazione-risposta via a 4 parametri di analisi logistica e grafico come attivazione% come definito dal controllo di riferimento ^1.

Risultati

Noi abitualmente uso di un metodo in due fasi per la diluizione peptidi tramite bonifico acustica. Per la prima fase, un erogatore acustica allineato con l'automazione viene usato per creare quattro diluizioni intermedie magazzino peptide attraverso due piastre sorgente (Figura 1a, b). Per la seconda fase, si usa un erogatore acustica per diluire ulteriormente archivi diluizioni dalle piastre sorgente A e B per creare un intervallo di concentra...

Discussione

Questo protocollo descrive l'applicazione di successo di dispensazione acustica automatizzato per diluire serialmente campioni peptide su un intervallo di concentrazione di 3 x 10 ⁶ richiede meno di 1 ml di campione. Il principale vantaggio di questo metodo è quello di aumentare la qualità dei dati riducendo al minimo peptide adsorbimento a plasticware via ridotta l'esposizione di campioni di contenitori sperimentali e plasticware (come ad esempio le punte delle pipette) che normalmente vengono rich...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Hanks’ Balanced Salt solution	Sigma-Aldrich	H8264
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	A9418
3-Isobutyl-1-methylxanthine	Sigma-Aldrich	I7018	Prepared as a 0.5 M stock in DMSO
GLP-1 (7-36) amide	Bachem	H-6795	Prepared as a 1 mg/ml stock in PBS, referred to as '100x reference control'
Test peptides	Produced in-house at MedImmune		Supplied at various concentrations in DMSO or PBS as appropriate
100x peptide stock	Produced in-house at MedImmune		Test peptide diluted into assay buffer to 100x final required concentration
Trypan Blue Solution, 0.4%	Thermo Fisher Scientific	15250-061
Cedex XS Cell Analyzer	Innovatis
Corning 384 well plates, low volume	Sigma-Aldrich	4514
Echo Qualified 384-Well Polypropylene Microplate	Labcyte Inc.	P-05525
Echo Qualified Reservoir	Labcyte Inc.	ER-0055
Echo 550 Liquid Handler	Labcyte Inc.		Droplet transfer volumes in increments of 2.5 nl
Echo 525 Liquid Handler	Labcyte Inc.		Droplet transfer volumes in increments of 25 nl
ACell Benchtop Automation	HighRes Biosolutions	MC522
Cellario Lab Automation Scheduling software for Life Science Robotics	HighRes Biosolutions
MultidropCombi Reagent Dispenser	ThermFisher Scientific	5840300	Referred to as 'bulk reagent dispenser'
HTRF cAMP Dynamic 2 kit	Cisbio Bioassays	62AM4PEJ
EnVision Multilabel Reader	PerkinElmer