Automatische Acoustic Verzicht für die serielle Verdünnung von Peptid-Agonisten im Potency Bestimmung Assays

Zusammenfassung

Peptide adsorption to plasticware during traditional tip-based serial dilutions can significantly impact potency determination and confound the understanding of structure-activity relationships used for lead identification and lead optimization phases of drug discovery. Here methods for automated acoustic non-contact serial dilution of peptide samples are described.

Zusammenfassung

Wie bei Entdeckung kleines Molekül als Wirkstoff, erfordert das Screening für Peptid-Agonisten die serielle Verdünnung von Peptiden Konzentrations-Wirkungs-Kurven zu erzeugen. Screening Peptide bietet eine zusätzliche Ebene der Komplexität als herkömmliche Spitzenbasis Probenhandhabungsverfahren Peptide zu einer großen Oberfläche von Plastikmaterialien belichten, eine erhöhte Chance für Peptidverlust durch Adsorption bereitstellt. Verhindern übermäßigen Exposition gegenüber Kunststoffgeschirr reduziert Peptidverlust durch Festhalten an Kunststoffen und minimiert somit Ungenauigkeiten in Potenz Vorhersage, und wir haben zuvor beschrieben die Vorteile von akustischen berührungslosen Abgabe für in vitro High-Throughput - Screening von Peptidagonisten ^1. Hier diskutieren wir eine vollständig integrierte Automatisierungslösung zur berührungslosen akustischen Herstellung von Peptid-Reihenverdünnungen in Mikrotiterplatten unter Verwendung der beispielsweise zum Screenen von Peptidagonisten an der Maus Glucagon-like Peptid-1-Rezeptor (GLP-1R). Unsere Methoden ermöglichen hohe-throughput zellbasierten Assays zum Screenen auf Agonisten und sind leicht skalierbar erhöhten Probendurchsatz zu unterstützen, oder für eine erhöhte Anzahl von Kopien Testplatte (beispielsweise für eine Gruppe von mehreren Zielzelllinien) zu ermöglichen.

Einleitung

Die GLP-1R ist ein etabliertes Medikament Ziel bei der Behandlung von Typ - 2 - Diabetes ^2. Das native Peptid - Agonisten für diesen Rezeptor, GLP-1, hat eine in vivo Halbwertszeit von 2-3 min ^3. Die Bindung von GLP-1 an seinen G-Protein-gekoppelten Rezeptorziel Ergebnisse in der stromabwärtigen Herstellung des second messenger cAMP durch native G-Protein-Kopplung an die Aktivierung von Adenylatcyclase. Die Messung des akkumulierten cAMP stellt eine robuste Test-Rezeptoraktivierung zu überwachen und für die aktive GLP-1-Analoga mit bevorzugten physikalisch-chemischen Eigenschaften zu screenen. Ein solcher Assay erfordert die serielle Verdünnung der Testproben Konzentrations-Reaktions-Kurven zu konstruieren, und dies ist besonders kompliziert, wenn Peptidproben reichte. Mögliche Fehler von der Spitze-basierten seriellen Verdünnung Vorbereitung wurden zuvor ^1,4,5 beschrieben. Peptide werden auf Kunststoffgeschirr, was zu unzuverlässigen Potenz Schätzungen adsorbieren. Peptidverlust kann durch t minimiert werdener die Aufnahme von Rinderserumalbumin (BSA) in Puffer und die Verwendung von silikonisierten Kunststoffgeschirr, noch Proteinbindungs ​​bleibt unvorhersehbar. Insbesondere wurde die Änderung der Bindung von GLP-1 an Versuchsbehältern wurde ⁶ beschrieben. Es gibt eine weitere Komplikation bei , dass die Stabilisierungsmittel in Laborkunststoffprodukte verwendet wird, kann von den Spitzen und Mikrotiterplatten in wßriges Assaypuffer auslaugen und stören Proteinfunktion ^{7, 8.} Daher Methoden Exposition gegenKunstStoffGeschirr zu reduzieren , sind notwendig , um die Genauigkeit der Messungen zu erhöhen.

Akustische Flüssigkeitsspender konzentriert eines hochfrequenten akustischen Signals auf der Oberfläche einer Flüssigkeitsprobe, wodurch der Ausstoß von Tröpfchen präzise Nanoliter- in eine benachbarte Testplatte ^9. Die Verwendung von akustischen Ausstoß ist in der pharmazeutischen Industrie für die Herstellung und das Screening von großen synthetischen Substanzbibliotheken Standard, und die Technologie für kleine molecul gut validiert wurdees ^10. Unseres Wissens sind wir die erste Gruppe akustische Abgabe zur Herstellung von rekombinanten und synthetischen Peptide zu beschreiben , und wir haben bereits berichtet , die eine verbesserte Genauigkeit im Vergleich zu herkömmlichen Tipp-basierten Methoden ^1.

Dieser Artikel beschreibt die Integration der Herstellung von Peptid serielle und direkte Verdünnungen von berührungslosen akustischen Übertragung auf eine vollautomatische Plattenrobotersystem Handhabung. Eine Anzahl von Verfahren umfasst Akustisches von Proben wurden zuvor ¹¹ beschrieben. Wir verwenden ein zweistufiges Verfahren zur Zwischenstammkonzentrationen herzustellen und zu seriell Peptidanaloga für die Erzeugung der vollen Dosis-Wirkungskurve verdünnen. Die hergestellten Peptide werden inkubiert mit den Zellen des Ziel Maus GLP-1R exprimieren, und wir verwenden eine im Handel erhältliche homogene zeitaufgelöste Fluoreszenz (HTRF) -Assay cAMP-Akkumulation in diesen Zellen als eine Auslesung von Peptid-Agonist aktiv zu messen,keit. Der Assay ist robust und zugänglich für ein Hochdurchsatz - 384-Well - Format und routinemäßig sowohl Assay - Entwicklung angewendet und Wirkstoff - Screening - Projekte ^12.

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Protokoll

1. Peptidserienverdünnung

1. Bereiten Assaypuffer: Hanks gepufferter Salzlösung (HBSS), supplementiert mit 25 mM HEPES, 0,1% BSA und 0,5 mM 3-Isobutyl-1-methylxanthin (IBMX), pH 7,4.
2. Verwenden Sie einen Bulk-Reagenzspender systematisch 5 ul Testpuffer hinzufügen zu jeder Vertiefung von fünf 384-Well-Low-Volume-Testplatten.
   1. Verwenden Sie den internen Software ein Abgabeprogramm für 5 ul Volumen zusätzlich zu jeder Vertiefung einer 384-Well-Platte zu erstellen, wie Anweisungen des Herstellers.
   2. Tauchen Abgabe Kassettenschläuche in Testpuffer und Prime Flüssigkeit.
   3. Legen Sie 384-well geringem Volumen Assayplatte auf Plattenträger.
   4. Drücke Start.
3. Verdünnen Sie alle Peptidproben, unabhängig von Speicher Fahrzeug, in Testpuffer ein 100x Peptid Lager herzustellen.
   HINWEIS: Peptides Screening erfordern , können in phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) oder Dimethylsulfoxid (DMSO) bereitgestellt werden , wie als angemessen erachtet wird (beispielsweise DMSO wkrank haben eine schädliche Wirkung auf Peptide mit sekundären Modifikationen wie PEGylierung).
4. Dispense 25 ul 100x Peptid Bestände in Spalten 1-5 von einem akustisch qualifizierten 384-Mikrotiterplatte aus Polypropylen. Diese Platte ist 'bezeichnet Source-Platte A'. Stellen Sie sicher, dass die Quellplatten, aber nicht Zielplatten sind mit flachem Boden und entsprechen den spezifischen akustischen Toleranzen, wie vom Hersteller von akustischen Instrumenten definiert.
5. Dispense 25 ul 100x Referenzkontrolle in die Vertiefungen A23 und A24 von Quellenplatte A.
6. Dispense 10 & mgr; l Testpuffer in Spalten 11 bis 15 und 30 & mgr; l Testpuffer in Spalten 21-22 von Quellenplatte A.
7. Dispense 10 & mgr; l Testpuffer in Spalten 6-10 und Spalten 16-20 eines zweiten akustisch qualifiziert 384-Mikrotiterplatte aus Polypropylen. Diese Platte wird "Quellenplatte B 'bezeichnet.
8. Zentrifuge Quellenplatten A und B bei 300 × g für 1 min. Fügen Sie eine entsprechende Ausgleichsplatte.
9. Verwenden Sie akustische fluid Spender in ein automatisiertes Robotersystem integriert drei aufeinanderfolgenden 1 vorzubereiten: aus der Kolonne 100 Zwischenverdünnungen (in Testpuffer) der 100x-Peptid-Aktien 1 in Quelle A.
   HINWEIS: Die Programmierung erfordert Platte neu formatiert und Dosis - Wirkungs - Software (wie vom Hersteller des akustischen Flüssigkeitsspender zur Verfügung gestellt) drei akustische Übertragungen zwischen Quelle A und Quelle B zu ermöglichen (Abbildung 1 für Plattenlayouts sehen). Schritt 1.9 Details insbesondere die Verwendung von Fluidspender in diesem Labor unter automatisierten Robotersteuerung verwendet wird (siehe Materialien Table):
   1. Ladequellenplatten und Testplatten in Plattenhotelteil der Robotik.
   2. Offene automatisierten Roboter-Software und Lastplatte neu formatiert und Dosis-Wirkungs-Programmerweiterung Protokolle. Klicken Sie auf "Ausführen".
      HINWEIS: Automation weist einen akustischen Flüssigkeitsspender 250 nl von Spalten A 1-5 von Quellenplatte in Spalten zu übertragen 6-10 von Quellenplatte B und eine zweite Acoustic Flüssigkeitsspender der Lage, größere Flüssigkeitsvolumina Umgang mit 15 & mgr; l Testpuffer zu verfüllen zu mischen. Automation überträgt dann Source-Platte B zu integrierten Zentrifuge und Zentrifugen bei 300 g für 1 min (eine entsprechende Ausgleichsplatte ist für alle Zentrifugationsschritte enthalten). Source Platte B ist mit dem akustischen Fluidspender für die Übertragung von 250 nl zurück von Spalten 6-10 der Quellenplatte B in Spalten 11-15 der Quellenplatte A und Verfüllung mit 15 ul Assaypuffer zu mischen. Automation überträgt Quellenplatte A integrierte Zentrifuge und Zentrifugen bei 300 g für 1 min. Quelle Platte A wird dann zu dem akustischen Flüssigkeitsspender für den Transfer von 250 nl von Spalten 11-15 der Quellplatte A in Spalten 16-20 der Quellplatte B und Verfüllung mit 15 & mgr; l Testpuffer zu mischen. Automation überträgt dann Source-Platte B zu integrierten Zentrifuge und Zentrifugen bei 300 g für 1 min.
      HINWEIS: Schließlich wird die Dosis-Wirkungs-Protokoll leitet akustische Ausgabe zu übertragendas erforderliche Volumen von jedem der vier seriell Source-Platte Brunnen verdünnt (sowohl in der Source-Platte A und Source-Platte B) 1.2 eine vollständige 11-Punkt-Kurve in zweifacher Ausfertigung in Assayplatten (gefüllt mit 5 & mgr; l Testpuffer in Schritt zu konstruieren oben ). Automation Transfers Assayplatte integrierte Zentrifuge und Zentrifugen bei 300 g für 1 min.

2. Zellpräparation

1. Auftau kryokonservierten Chinese hamster ovary (CHO) Zellen, die das Ziel Maus GLP-1-Rezeptor rasch in einem 37 ºC Wasserbad und Resuspendieren in 20 ml Assaypuffer exprimieren.
2. Zentrifuge Zellsuspension für 5 min bei 200 xg bei Raumtemperatur (RT). Fügen Sie ein angemessenes Gleichgewicht.
3. Überstand verwerfen und resuspendieren Zellpellet in 10 ml Assaypuffer.
4. Verdünnen Zelle Lager 1: 1 in Trypanblau und bestimmen Lebendzelldichte eine automatische Zellzähler verwendet wird. Die Zellen in Assaypuffer bei 1,6 x 10 ⁶ Zellen pro ml (äquivalent zu 8000 Zellen pro well Assayplatten).
5. Verwenden einer Schütt Reagenzspender 5 & mgr; l der Zellsuspension hinzugefügt zu jeder Vertiefung der Testplatten (mit seriell verdünnten Peptide in 5 & mgr; l Assay-Puffer) und Inkubation für 30 min bei RT.

3. HTRF cAMP-Detection-Assay

1. Bringen HTRF cAMP-Assay-Kit für 30 min auf RT vor der Verwendung.
2. Bereiten Sie jede HTRF-Reagenz (Kryptat und d2) getrennt bei einer Verdünnung von 1:20 in Lysispuffer (eigene Formulierung, durch Hersteller von cAMP-Nachweistest zur Verfügung gestellt).
   HINWEIS: ACHTUNG: Lysepuffer enthält Kaliumfluorid (KF) , die toxisch ist und einen teratogen ^13. Zur Entsorgung Assay-Platten, die KF sollte versiegelt und verbrannt werden, und jede flüssige Abfälle müssen mit Wasser vor der Entsorgung in den Ausguss auf <1 mmol / l verdünnt werden.
3. Verwenden Sie einen Bulk-Reagenzspender 5 ul Kryptat- Reagenz in alle Vertiefungen der Testplatten hinzuzufügen.
4. Verwenden Sie einen Bulk-Reagenzspender 5 ul d2 Reagenz colum hinzufügenns 1-22 der Testplatten.
5. Unmittelbar Pipette manuell 5 & mgr; l Lyse-Puffer in Vertiefungen A23-D24 der Testplatten nicht-spezifische Bindung (NSB) Kontrollvertiefungen zu geben, und 5 ul d2 Reagenz in die Vertiefungen E23-P24.
6. Zentrifugieren Sie die Testplatten für 1 min bei 200 × g bei RT die Brunnen zu mischen.
7. Decken Sie die Testplatten Verdunstung und Photobleaching zu minimieren und Inkubation bei RT für 1 Stunde.
8. Messen Sie Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer (FRET) Signal mit einer Anregung bei 320 nm und Emission bei 620 nm und 665 nm einen Plattenleser.

4. Datenanalyse

1. Verwenden Sie NSB bedeuten Hintergrund aus allen Wells abzuziehen.
2. Berechnen% Delta F aus dem 665 nm / 620 nm-Verhältnis wie folgt:
   Ratio = (A _{665 nm} / A _620nm) x 10 ⁴
   Delta F = ((Sample Ratio - Verhältnis _NSB) / Ratio - _NSB)) x 100
   wo Verhältnis _NSB = Vertiefungen ohne d2 Reagenz.
3. Berechnen% betätigendesIonen zwischen unstimulierten Zellen und Zellen mit maximaler GLP-1-Liganden stimuliert, wie folgt:
   % Aktivierung = (% Delta fSAMPLE -% DeltaFunstimulated Zellen) / (% DeltaFGLP-1 stimulierten Zellen -% DeltaF unstimulierten Zellen) x 100
4. Analysieren Sie Konzentrations-Wirkungs - Kurven über 4-Parameter logistische Analyse und grafische Darstellung in% Aktivierung , wie durch Bezugssteuerung ¹ definiert.

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Ergebnisse

Wir verwenden routinemäßig einen zweistufigen Verfahren Peptide über akustische Übertragung zu verdünnen. Für den ersten Schritt wird ein akustisches Spender mit Automatisierungs fluchtet verwendet vier Stammpeptidzwischenverdünnungen über zwei Quellenplatten (1a, b) zu erzeugen. Für den zweiten Schritt, verwenden wir einen akustischen Spender zur weiteren Stammverdünnungen von der Quelle Platten A verdünnen und B eine 11-Punkt - Konzent...

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Diskussion

Dieses Protokoll beschreibt die erfolgreiche Anwendung von automatisierten akustischen Ausgabe zu seriell Peptidproben über einen Konzentrationsbereich von 3 x 10 ⁶ , die weniger als 1 ul Probe verdünnen. Der große Vorteil dieser Methode ist, über reduzierte Exposition von Proben zu experimentellen Behälter und Kunststoffgeschirr (wie Pipettenspitzen) Datenqualität durch Minimierung Peptid Adsorption an Kunststoffprodukte zu erhöhen, die für Reagenztransfer und Mischen normalerweise erforderlich sind....

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Hanks’ Balanced Salt solution	Sigma-Aldrich	H8264
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	A9418
3-Isobutyl-1-methylxanthine	Sigma-Aldrich	I7018	Prepared as a 0.5 M stock in DMSO
GLP-1 (7-36) amide	Bachem	H-6795	Prepared as a 1 mg/ml stock in PBS, referred to as '100x reference control'
Test peptides	Produced in-house at MedImmune		Supplied at various concentrations in DMSO or PBS as appropriate
100x peptide stock	Produced in-house at MedImmune		Test peptide diluted into assay buffer to 100x final required concentration
Trypan Blue Solution, 0.4%	Thermo Fisher Scientific	15250-061
Cedex XS Cell Analyzer	Innovatis
Corning 384 well plates, low volume	Sigma-Aldrich	4514
Echo Qualified 384-Well Polypropylene Microplate	Labcyte Inc.	P-05525
Echo Qualified Reservoir	Labcyte Inc.	ER-0055
Echo 550 Liquid Handler	Labcyte Inc.		Droplet transfer volumes in increments of 2.5 nl
Echo 525 Liquid Handler	Labcyte Inc.		Droplet transfer volumes in increments of 25 nl
ACell Benchtop Automation	HighRes Biosolutions	MC522
Cellario Lab Automation Scheduling software for Life Science Robotics	HighRes Biosolutions
MultidropCombi Reagent Dispenser	ThermFisher Scientific	5840300	Referred to as 'bulk reagent dispenser'
HTRF cAMP Dynamic 2 kit	Cisbio Bioassays	62AM4PEJ
EnVision Multilabel Reader	PerkinElmer