自动声胶肽受体激动剂的效价测定测定的连续稀释

摘要

Peptide adsorption to plasticware during traditional tip-based serial dilutions can significantly impact potency determination and confound the understanding of structure-activity relationships used for lead identification and lead optimization phases of drug discovery. Here methods for automated acoustic non-contact serial dilution of peptide samples are described.

摘要

与小分子药物的发现，筛选肽激动剂要求的肽，以产生浓度 - 响应曲线的连续稀释。筛选的肽，得到复杂的附加层作为常规的基于针尖 - 样品处理方法暴露肽塑料制品的一个大的表面面积，提供用于通过吸附肽损失增加的机会。防止过度暴露于塑料制品通过加入塑料降低肽损失，因而在效价的预测最小误差，我们先前已经描述了非接触式的声学分配用于肽激动剂¹的体外高通量筛选的好处。这里我们讨论了在利用在小鼠胰高血糖素样肽1受体（GLP-1R）筛选肽激动剂的例子中微滴定板的肽系列稀释的非接触声学制备一个完全集成的自动化解决方案。我们的方法允许高-throughput细胞为基础的分析来筛选激动剂，很容易扩展到支持增加的样品通量，或允许检测板拷贝数量增加（ 例如 ，对于更多的靶细胞系面板）。

引言

针对GLP-1R是2型糖尿病²的治疗已建立的药物靶标。对于该受体的天然肽激动剂，GLP-1，具有2-3分钟³ 的体内半衰期。 GLP-1的其G蛋白偶联靶受体的结果在下游生产通过天然G蛋白偶联的第二信使cAMP对腺苷酸环化酶的活化的结合。累积的cAMP测量提供了可靠的测定法来监测受体激活和筛选活性GLP-1类似物与优选的物理化学性质。这样的测定需要测试样品的连续稀释来构建浓度 - 响应曲线，而这移交肽样品时，是特别复杂。从基于尖连续稀释准备的潜在错误先前已经^1,4,5描述。肽将吸附到塑料制品，造成不可靠的效力的估计。肽损失，可以通过T为最小化他纳入缓冲器牛血清白蛋白（BSA）和使用硅化塑料制品的，但蛋白质结合的仍无法预测。特别是，在实验容器GLP-1的结合的变体已经描述^6。有在实验室塑料制品中使用可从提示和微量滴定板成水测定缓冲液浸出，并与蛋白质功能^7,8干扰该稳定剂进一步复杂化。因此，方法，以减少暴露于塑料制品是必要的，以增加测量的准确度。

声学液体分配器集中的高频声信号到流体样品的表面上，从而导致在精确纳升液滴喷射到相邻测定板^9。利用声学弹射的是制药行业的准备和大量的合成化合物库的筛选标准，而且技术已经很好的验证了小moleculES ^10。据我们所知，我们是来形容声配药重组和合成肽的制备第一组和我们先前已经报道了更高的精度比传统的基于技巧的方法^1。

本文介绍了在完全自动化的处理板的机器人系统由非接触式声学传递肽序列和直接稀释配制的整合。许多围绕样本声传输方法先前已被描述^11。我们利用两步法来制备中间库存浓度和以串行稀释肽类似物为全剂量反应曲线的产生。制备的肽温育的细胞表达靶小鼠GLP-1R，并且我们使用市售均相时间分辨荧光（HTRF）测定法来测量这些细胞中的cAMP积累作为肽激动剂ACTIV的读出性。该测定是健壮和适合于高通量384孔格式和常规应用到分析开发和药物筛选项目^12。

研究方案

1.肽序列稀释

1. 制备测定缓冲液:汉克斯缓冲补充有25mM的HEPES，0.1％BSA和0.5mM 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤（IBMX），pH 7.4的盐溶液（HBSS）。
2. 使用批量试剂分配器5微升测定缓冲液系统添加到每个孔5 384孔低体积试验平板。
   1. 使用内部软件以5微升体积除一个384孔平板的每一个以及每个制造商的说明建立的分配程序。
   2. 沉浸在分析缓冲液和总理点胶盒管。
   3. 放置384孔板载体上的低体积试验板。
   4. 按开始。
3. 冲淡一切肽样品，无论存储车辆，在测定缓冲液产生100倍的股票肽。
   注意:需要筛选肽可在磷酸盐缓冲盐水（PBS）或二甲基亚砜（DMSO），为被认为适当的（如，DMSO瓦特提供病有与二级修饰如聚乙二醇化）的肽具有有害影响。
4. 免除25微升100X肽股成列的声学合格384孔微孔板聚丙烯1-5。该板指定"源板"。确保源板，而不是目的板，是平底，并符合特定声公差由电声乐器的制造商定义。
5. 免除25微升100X参考控制入井A23和源板A的A24
6. 将10微升检测缓冲液到列11-15和30微升检测缓冲液到源盘A的21-22列
7. 将10微升分析缓冲液为列6-10和16-20列第二声学合格的384孔微孔板聚丙烯的。该板指定"源板B'。
8. 离心机源板A和B在300 XG 1分钟。包括适当的平衡板。
9. 使用声fluið分配器集成到自动化机器人系统，制备三个顺序1:从第1列中的源A的100倍的肽股100中间稀释液（在测定缓冲液）
   注:编程需要重新格式化板和（由声学流体分配器的制造商提供）剂量反应软件允许源A和源B（参见图1板布局）之间的三声传输。步骤1.9特性的细节运用在受自动机械手控制这个实验室使用的液体分配器（见材料表 ）:
   1. 载源板和检测板成机器人的板酒店部分。
   2. 开放式自动化机器人的软件和负载板格式化和剂量反应程序扩展协议。点击"运行"。
      注:自动化指示声流体分配器从源头板列1-5转移250 NL到源盘B 6-10列和第二ACOUSTIç流体分配器能够处理更大的液体体积与15微升分析缓冲液混合回填。然后自动化源盘B传送到集成离心机在300 XG 1分钟离心机（一种适当的平衡板是包括所有的离心步骤）。源板B被返回到声学流体分配器250 NL的转移从源盘B的6-10列到源板A的11-15列和用15微升测定缓冲回填混合。自动化传输源板，以集成离心机在300 XG 1分钟离心机。然后源板A被返回到声学流体分配器250 NL的转移从源盘A的11-15列到源盘B的16-20列和用15微升测定缓冲回填混合。自动化然后在300 XG 1分钟源盘B传送到集成离心机和离心机。
      注:最后剂量响应协议指示声学分配传送从各4连续稀释源板孔中所需的体积（在源板A和源盘B两者）来构造在测定板一式两份的完整的11点曲线（预填充有5微升测定缓冲液在上面的步骤1.2 ）。自动化转移测定板，以集成离心机和离心机在300×g离心1分钟。

2.细胞的制备

1. 在20毫升测定缓冲液37ºC水浴悬浮迅速表达靶小鼠GLP-1受体解冻冷冻保存的中国仓鼠卵巢（CHO）细胞。
2. 离心细胞悬浮液，在室温下（RT）200 xg离心5分钟。包括适当的平衡。
3. 弃上清，重悬在10毫升分析缓冲液细胞沉淀。
4. 稀释细胞库存1:1台盼蓝和使用自动细胞计数器测定活细胞密度。悬浮细胞以每毫升1.6×10 ^6个细胞测定缓冲液（相当于每逢8000细胞测定板的1）。
5. 使用批量试剂分配器5微升细胞悬液加入到测定板（含于5μl测定缓冲液连续稀释的肽）的每个孔中，并孵育在室温30分钟。

3. HTRF cAMP的检测分析

1. 带来HTRF cAMP测定试剂盒RT下在使用前30分钟。
2. 准备每个HTRF试剂（穴和D2）分别在裂解液1:20稀释（专利配方，通过cAMP的检测化验的制造商提供）。
   注意:注意:裂解液中含有氟化钾（KF），这是有毒的致畸胎^13。有关处理，含有KF检测板应密封并焚烧，任何液体废物处置，必须顺着水槽之前，稀释<1 mmol / L的水。
3. 使用批量试剂分配器5微升穴试剂加入到测定板的所有孔中。
4. 使用批量试剂分配器5微升D2试剂加入到柱纳秒测定板1-22。
5. 立即手动移液5微升裂解缓冲液进入测定板的孔A23-D24，得到非特异性结合（NSB）对照孔，和5μld2的试剂的成孔E23-P24。
6. 离心机检测板1分钟，在室温200 XG混合井。
7. 覆盖试验板，以减少蒸发和光致漂白，并在室温孵育1小时。
8. 用在320nm处激发和发射在620nm，并使用板读数器665纳米测量荧光共振能量转移（FRET）信号。

4.数据分析

1. 使用平均NSB从所有孔减去背景。
2. 从665纳米/ 620纳米比率计算Δ％˚F如下:
   比率=（A _665nm / A _620nm处 ）×10 ⁴
   三角洲F =（（采样率-比_NSB）/比例_{NSB））×100}
   其中，比例_NSB =没有D2试剂孔。
3. 计算％ACTIVAT未刺激的细胞与细胞之间的离子与最大GLP-1的配体刺激的如下:
   ％活化=（Δ％FSAMPLE - ％DeltaFunstimulated细胞）/（％DeltaFGLP-1刺激的细胞 - ％DeltaF未刺激细胞）×100
4. 通过参考控制¹所限定分析通过4参数后勤分析;图作为％活化浓度-响应曲线。

结果

我们经常使用两步法通过声传递稀释肽。用于第一步骤中，用自动化对准的声学分配装置被用来创建四个库存肽跨两个源板中间稀释液（ 图1a，b） 中 。对于第二个步骤中，我们使用的声分配器从源板A和B，以进一步稀释库存稀释创建为每个测试肽（ 图1c）11点浓度范围。每种肽的浓度范围是在重复烧制，左跨越测定?...

讨论

这个协议描述自动声学分配的成功应用到在3×10 ^6个要求小于1微升样品的浓度范围连续稀释的肽样品。这种方法的主要优点是通过经由还原样品暴露于所通常所需的试剂转移和混合试验容器和塑料制品（如枪头）最小化的肽吸附到塑料制品，以提高数据质量。虽然声学分配不能完全排除使用塑料制品的，它确实显著酌减。此外，消除基于尖部-移液还消除了样品的交叉污染，和错误不会在?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Hanks’ Balanced Salt solution	Sigma-Aldrich	H8264
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	A9418
3-Isobutyl-1-methylxanthine	Sigma-Aldrich	I7018	Prepared as a 0.5 M stock in DMSO
GLP-1 (7-36) amide	Bachem	H-6795	Prepared as a 1 mg/ml stock in PBS, referred to as '100x reference control'
Test peptides	Produced in-house at MedImmune		Supplied at various concentrations in DMSO or PBS as appropriate
100x peptide stock	Produced in-house at MedImmune		Test peptide diluted into assay buffer to 100x final required concentration
Trypan Blue Solution, 0.4%	Thermo Fisher Scientific	15250-061
Cedex XS Cell Analyzer	Innovatis
Corning 384 well plates, low volume	Sigma-Aldrich	4514
Echo Qualified 384-Well Polypropylene Microplate	Labcyte Inc.	P-05525
Echo Qualified Reservoir	Labcyte Inc.	ER-0055
Echo 550 Liquid Handler	Labcyte Inc.		Droplet transfer volumes in increments of 2.5 nl
Echo 525 Liquid Handler	Labcyte Inc.		Droplet transfer volumes in increments of 25 nl
ACell Benchtop Automation	HighRes Biosolutions	MC522
Cellario Lab Automation Scheduling software for Life Science Robotics	HighRes Biosolutions
MultidropCombi Reagent Dispenser	ThermFisher Scientific	5840300	Referred to as 'bulk reagent dispenser'
HTRF cAMP Dynamic 2 kit	Cisbio Bioassays	62AM4PEJ
EnVision Multilabel Reader	PerkinElmer