Etkili belirlenmesi tahlillerinde Peptit Agonistlerinin seri Seyreltme için Dağıtım Otomatik Akustik

Özet

Peptide adsorption to plasticware during traditional tip-based serial dilutions can significantly impact potency determination and confound the understanding of structure-activity relationships used for lead identification and lead optimization phases of drug discovery. Here methods for automated acoustic non-contact serial dilution of peptide samples are described.

Özet

küçük moleküllü ilaç keşfi olduğu gibi, peptid agonistleri için eleme konsantrasyon-tepki eğrileri elde etmek peptidlerin seri seyreltme gerektirir. peptidler Tarama geleneksel uç tabanlı numune alma yöntemleri adsorpsiyon yoluyla peptid kaybı için artan bir fırsat sağlayarak, plasticware geniş bir yüzey alanına peptidler maruz olarak karmaşıklık ek bir katman tanıyor. Plasticware aşırı maruz kalma önlenmesi plastik bağlılık yoluyla peptid kaybını azaltır ve böylece gücü tahmininde yanlışlıklar en aza indirir, ve biz daha önce peptid agonistleri ¹ in vitro yüksek verimli tarama için dağıtım temassız akustik faydalarını tarif var. Burada fare glukagon benzeri peptit-1 reseptörü (GLP-1 R) peptit agonistlerinin taranmasında örnek kullanılarak mikrotiter plakalarında peptid seri dilüsyonları temassız akustik hazırlanması için bir tam entegre bir otomasyon çözümü tartışılmıştır. Bizim yöntemler yüksek izin-throughput agonistlerinin taranmasında da tahlilleri hücre bazlı ve kolay bir şekilde yüksek bir numune test etme desteklemek için, ya da (daha fazla hedef hücre çizgilerinin bir panel için, örneğin) deney plakası kopya sayısında artış sağlamak için büyütülebilir.

Giriş

GLP-1 R tip 2 diyabet ² tedavisinde kurulu bir ilacın bir hedeftir. Bu reseptör için yerli peptit agonisti, GLP-1, 2-3 dakika ³ bir in vivo yarı-ömrü vardır. adenilil siklaz aktivasyonuna doğal G protein bağlanması yoluyla ikinci haberci cAMP'nin alt üretimindeki G protein bağlı hedef reseptör sonuçlarına GLP-1 bağlanması. biriken cAMP ölçümü sağlam bir tahlil reseptör aktivasyonunun izlemek ve tercih edilen bir fiziko-kimyasal özellikleri, aktif GLP-1 analogları taranması için içerir. Böyle bir deney, konsantrasyon-tepki eğrilerini oluşturmak için test numunelerinin seri seyreltme gerektirir ve peptid örnekleri teslim Bu, özellikle karmaşıktır. Ucu tabanlı seri seyreltme hazırlanmasından potansiyel hatalar, daha önce ^1,4,5 tarif edilmiştir. Peptidler güvenilmez potens tahminlerinde sonuçlanan plasticware yapışır. Peptit kaybı t yoluyla minimize edilebilirO sığır serum tamponlarda albümini (BSA) ve silikonlu plasticware kullanımı, ama bağlayıcı proteinin eklenmesi düzensiz kalmaktadır. Özel olarak, deney kaplarına GLP-1 bağlanması değişim ⁶ tarif edilmiştir. Sulu tahlil tampon içine ipuçları ve mikrotiter plakaları liç ve protein fonksiyonu ^{7, 8} engelleyebilir laboratuvar plasticware kullanılan bu istikrar ajanlar daha da komplikasyon var. Bu nedenle, yöntemler plasticware maruziyeti azaltmak için ölçümlerin doğruluğunu artırmak için gereklidir.

Akustik Sıvı dağıtıcıları bitişik tahlil plaka ⁹ içinde hassas nanolitre damlacıklarının ejeksiyon sonuçlanan bir sıvı numunesinin yüzeyi üzerine, yüksek frekanslı akustik sinyal odaklanır. Akustik ejeksiyon kullanımı hazırlanması ve büyük sentetik bileşik kütüphanelerinin taranması için ilaç endüstrisinde standart ve teknoloji de küçük Moleküller için valide edilmiştires ^10. Bildiğimiz kadarıyla, rekombinant ve sentetik peptidlerin hazırlanması için akustik dağıtılmasını tanımlamak için birinci grup ve daha önce bilinen ucu tabanlı yöntem ¹ ile karşılaştırıldığında geliştirilmiş doğruluk bildirmiştir.

Bu makalede, bir tam otomatik plaka taşıma robotik sistem üzerine temassız akustik transferi ile peptid seri ve direkt dilüsyonları hazırlanması entegrasyonunu anlatmaktadır. Örneklerin akustik transfer kapsayan bir dizi yöntem, daha ^{önce, 11} tarif edilmiştir. Bu, iki aşamalı bir yöntem, ara stok konsantrasyonları hazırlamak için ve seri olarak tam doz-tepki eğrisi oluşturacak şekilde peptit analoglarını seyreltmek için kullanmaktadır. hazırlanan peptidler, hedef hücreler, fare GLP-1R ifade ile inkübe edilir, ve peptid agonisti activ bir okuma olarak, bu hücreler içinde, cAMP birikiminin ölçülmesi için ticari olarak elde edilebilen homojen zaman çözümlü bir fluoresans (HTRF) deneyi kullanımıSığ. Deney sağlam ve yüksek verimli bir 384-gözlü formata müsait ve rutin olarak, her iki deney geliştirme tatbik edildi ve ilaç tarama ¹² çıkıntı olan.

Protokol

1. Peptid seri seyreltme

1. deney tamponu hazırlayın: Hanks, 25 mM HEPES,% 0.1 BSA ve 0.5 mM 3-izobutil-1-metilksantin (IBMX), pH 7.4 ile takviye edilmiş tuz çözeltisi (HBSS) tamponlu.
2. sistematik beş 384-düşük hacimli deney plakalarının her çukuruna deney tamponu 5 ul bir hacim tepkin madde dağıtıcı kullanın.
   1. üreticinin talimatlarına göre 384 oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna 5 ul hacmi ilave edilmesi için bir dağıtma programı oluşturmak için iç yazılım kullanın.
   2. deney tamponu ve prime sıvısında kaset boru dağıtım daldırın.
   3. plaka taşıyıcısı üzerindeki 384 de düşük hacimli tahlil plaka koyun.
   4. Başlata basınız.
3. 100x peptid stokunun üretilmesi için deney tamponu içine ne olursa olsun, bir depolama aracı, her peptit örnekleri seyreltilir.
   Not: tarama gerektiren peptidlerdir örneğin, DMSO (w uygun görüldüğü şekilde fosfat-tamponlu salin (PBS) veya dimetil sülfoksit (DMSO) içinde temin edilebilirHasta bu PEGilasyon gibi sekonder değişikliklerin) sahip peptidler üzerinde zararlı bir etkiye sahiptir.
4. sütunlar akustik nitelikli 384-polipropilen mikroplaka 1-5 içine 25 ul 100x peptid stokları koyun. Bu plaka 'kaynak plaka A' belirlenmiştir. bu kaynak plakaları olun, ancak hedef plakaları, düz dipli ve akustik enstrümanlar üreticisi tarafından tanımlanan belirli akustik toleranslar uygundur.
5. kuyular A23 içine 25 ul 100x referans kontrolü dağıtın ve kaynak plaka A. A24
6. Kaynak plaka A. sütun 21-22 içine sütun 11-15 ve 30 ul tahlil tamponu içine 10 ul deney tamponu dağıtın
7. sütunlar ikinci akustik nitelikli 384 polipropilen mikroplaka 6-10 ve sütunları 16-20 içine 10 ul deney tamponu koyun. Bu plaka 'kaynak plaka B' belirlenmiştir.
8. 1 dakika boyunca 300 x g'de santrifüjleyin kaynağı A ve B levhalarının. uygun bir denge levhasını içerir.
9. akustik flui kullanınKaynak A sütun 1 100x peptid stokları (deney tamponu içinde), 100, ara seyreltiler: D dağıtıcılar, sıralı üç 1 hazırlanması için bir otomatik robotlu sisteme entegre
   NOT: Programlama kaynak A ve kaynak B (plaka düzenleri için bakınız Şekil 1) arasında üç akustik transferlerine izin plaka yeniden biçimlendirme ve (akustik sıvı dağıtıcısının üreticisi tarafından sağlanan gibi) doz-yanıt yazılım gerektirir. Özellikle 1,9 ayrıntıları otomatik robot kontrolü altında bu laboratuvarda kullanılan sıvı dağıtıcıları kullanımı Adım (Malzeme Tablo bakınız):
   1. robotik plaka otel bölümünde yükleyin kaynak plakaları ve tahlil plakaları.
   2. Açık, otomatik robotlu yazılım ve yük plakası yeniden biçimlendirme ve doz-yanıt programı genişletme protokolleri. 'Çalıştır' düğmesine tıklayın.
      NOT: Otomasyon kaynak plakası B sütunları 6-10 içine kaynak plakası A sütunları 1-5 250 nl aktarmak için bir akustik sıvı dağıtıcı talimatı ve ikinci akustik birkarıştırmak için 15 ul deney tamponu ile doldurmak için büyük sıvı hacimlerini işleme yeteneğine c sıvı dağıtıcısı. Otomasyon sonra entegre santrifüj ve 1 dakika boyunca 300 xg'de santrifüj (uygun bir denge plakası tüm santrifüj adımları dahildir) kaynak plakası B aktarır. Kaynak plaka B kaynak plakası A sütunları 11-15 içine kaynak plakası B sütunları 6-10 250 nl transferi için akustik sıvı dağıtıcı döndü ve karıştırmak için 15 ul deney tamponu ile dolgu edilir. Entegre santrifüj ve 1 dakika boyunca 300 xg'de santrifüj Otomasyon transferleri kaynak plakası A. Kaynak levhası ardından kaynak plakası B sütunları 16-20 içine kaynak plakası A sütunları 11-15 250 nl transferi için akustik sıvı dağıtıcı döndü ve karıştırmak için 15 ul deney tamponu ile dolgu edilir. Otomasyon sonra 1 dakika boyunca 300 xg'de entegre santrifüj ve santrifüjler kaynak plakası B aktarır.
      NOT: Son olarak doz tepki protokolü aktarmak için akustik dağıtılmasını yönlendirir(Kaynak levhasının ve kaynak plakası B hem de) 4 seri olarak seyreltilmiş, kaynak plakası kuyularının her biri gerekli hacmi deney plakalarında iki kez tam 11 noktalı eğri oluşturmak için (yukarıda Adım 1.2'de 5 ul deney tamponu ile önceden doldurulmuş ). Otomasyon Entegre santrifüj transferler tahlil plaka ve santrifüjler 1 dakika boyunca 300 xg'de.

2. Hücre Hazırlanması

1. 20 mi tayin tamponu içinde 37 ° C bir su banyosu ve tekrar süspansiyon hızla hedef fare, GLP-1 reseptörü eksprese eden çözülme dondurulan Çin hamsteri yumurtalık (CHO) hücreleri.
2. Oda sıcaklığında 200 xg (RT), 5 dakika boyunca santrifüj hücre süspansiyonu. uygun bir denge ekleyin.
3. Süpernatant atın ve 10 ml tahlil tamponu hücre pelletini.
4. Tripan mavi 1 ve otomatik bir hücre sayacı kullanılarak, canlı hücrelerin yoğunluğunu belirler: hücre stoku: 1 seyreltin. Wel 8.000 hücrelerine (eşdeğer, ml başına 1.6 x 10 ⁶ hücre olarak tahlil tamponu içinde yeniden süspanse hücreleriDeney plakaları l).
5. 30 dakika boyunca oda sıcaklığında (5 ul deney tamponu içinde seri halinde seyreltilmiş peptid içeren) deney plakalarının her çukuruna hücre süspansiyonu 5 ul ve inkübasyona bir kütle reaktif dağıtıcı kullanın.

3. HTRF cAMP tespitinde

1. kullanımdan önce, 30 dakika boyunca oda sıcaklığına HTRF cAMP tahlili kiti getirin.
2. (CAMP tarama deneyinde üreticisi tarafından sağlanan özel formülasyon) liziz tamponu içinde 1:20 seyreltide ayrı ayrı HTRF reaktif (cryptate ve D2) hazırlayın.
   NOT: DİKKAT: Lizis tampon potasyum zehirlidir florid (KF) ve teratojen ¹³ içerir. Atıkları, KF içeren tahlil tabak mühürlü ve yakılarak ve herhangi bir sıvı atık önce lavaboya aşağı elden su ile <1 mg / L seyreltilmiş gerekmektedir edilmelidir.
3. deney plakalarının tüm oyuklara 5 ul kriptat reaktif ekleme bir kütle reaktif dağıtıcı kullanın.
4. colum 5 ul d2 reaktifi eklemek için toplu reaktif dağıtıcı kullanınns tahlil plakaları 1-22.
5. Hemen el ile spesifik olmayan bağlanma (NSB) kontrol kuyuları ve kuyu E23-P24 içinde D2 reaktif 5 ul elde deney plakaları kuyu A23-D24 içinde 5 ul lizis tamponu pipetle.
6. kuyu karıştırmak oda sıcaklığında 200 xg'de 1 dakika için deney plakaları santrifüjleyin.
7. buharlaşma ve foto-ağartma en aza indirmek ve 1 saat boyunca oda sıcaklığında inkübe tahlil plakaları örtün.
8. 620 nm'de bir plaka okuyucu kullanılarak 665 nm 'de 320 nm' de bir eksitasyon ve emisyon ile flüoresan rezonans enerji transferi (FRET) sinyali ölçer.

4. Veri Analizi

1. tüm kuyulardan arka plan çıkarmak için NSB ortalama kullanın.
2. aşağıdaki şekilde 665 nm / 620 nm oranından% Delta F hesaplanır:
   Oran = (A _665nm / A ₆₂₀₎ 10 ⁴ x
   Delta F = ((Numune Oranı - Oran _NSB) / Oran _NSB)) x 100
   nerede Oran _NSB hiçbir d2 reaktifi ile kuyu =.
3. % Activat hesaplayınaşağıda uyarılmamış hücrelerde ve hücreler arasında iyon maksimum GLP-1 ligand ile uyarılmış:
   % Aktivasyon = (% Delta Fsample -% DeltaFunstimulated hücreleri) / (% DeltaFGLP-1 uyarılan hücreler -% DeltaF uyarılmamış hücreler) x 100
4. Referans kontrol ¹ ile tanımlanan,% aktivasyonu gibi 4-parametreli lojistik analizi ve grafik ile konsantrasyon-tepki eğrileri analiz edin.

Sonuçlar

Biz rutin akustik havalesiyle peptidler sulandırmak için iki adımlı bir yöntemini kullanın. İlk adımda, otomasyon ile uyumlu bir akustik dağıtıcı iki kaynak plakalar arasındaki dört stok peptid ara dilüsyonları oluşturmak için kullanılır (Şekil 1a, b). İkinci adım olarak, biz daha fazla her test peptid (Şekil 1c) için 11 maddelik konsantrasyon aralığı oluşturmak için kaynak plakaları A ve B hisse sene...

Tartışmalar

Bu protokol, seri örnek 1 'den az ul gerektiren, 3 x 10 ⁶ bir konsantrasyon aralığı üzerinde peptid örnekleri seyreltilmesi için otomatik bir akustik dağıtma başarılı bir uygulama açıklanmaktadır. Bu yöntemin en önemli avantajı, normal reaktif ve karıştırmak için gerekli olan deney kapları (örneğin, pipet uçları gibi) plasticware örneklerin düşük maruz kalma ile plasticware peptit adsorpsiyonu en aza indirmek suretiyle veri kalitesinin artırmaktır. akustik dağıtım tamam...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Hanks’ Balanced Salt solution	Sigma-Aldrich	H8264
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	A9418
3-Isobutyl-1-methylxanthine	Sigma-Aldrich	I7018	Prepared as a 0.5 M stock in DMSO
GLP-1 (7-36) amide	Bachem	H-6795	Prepared as a 1 mg/ml stock in PBS, referred to as '100x reference control'
Test peptides	Produced in-house at MedImmune		Supplied at various concentrations in DMSO or PBS as appropriate
100x peptide stock	Produced in-house at MedImmune		Test peptide diluted into assay buffer to 100x final required concentration
Trypan Blue Solution, 0.4%	Thermo Fisher Scientific	15250-061
Cedex XS Cell Analyzer	Innovatis
Corning 384 well plates, low volume	Sigma-Aldrich	4514
Echo Qualified 384-Well Polypropylene Microplate	Labcyte Inc.	P-05525
Echo Qualified Reservoir	Labcyte Inc.	ER-0055
Echo 550 Liquid Handler	Labcyte Inc.		Droplet transfer volumes in increments of 2.5 nl
Echo 525 Liquid Handler	Labcyte Inc.		Droplet transfer volumes in increments of 25 nl
ACell Benchtop Automation	HighRes Biosolutions	MC522
Cellario Lab Automation Scheduling software for Life Science Robotics	HighRes Biosolutions
MultidropCombi Reagent Dispenser	ThermFisher Scientific	5840300	Referred to as 'bulk reagent dispenser'
HTRF cAMP Dynamic 2 kit	Cisbio Bioassays	62AM4PEJ
EnVision Multilabel Reader	PerkinElmer