효능 판별 분석에서 펩타이드 작용제의 직렬 희석에 대한 분배 자동 음향

요약

Peptide adsorption to plasticware during traditional tip-based serial dilutions can significantly impact potency determination and confound the understanding of structure-activity relationships used for lead identification and lead optimization phases of drug discovery. Here methods for automated acoustic non-contact serial dilution of peptide samples are described.

초록

소분자 약물 발견과 같이, 펩티드 작동 선별하여 농도 - 반응 곡선을 생성하는 펩티드의 일련의 희석을 필요로한다. 펩티드를 스크리닝 종래 팁 기반 시료 처리 방법을 통해 흡착 펩티드 손실 증가 된 기회를 제공 plasticware 큰 표면적에 노출 펩티드로 복잡한 계층을 제공한다. plasticware 과도한 노출을 방지하는 플라스틱에 대한 밀착성을 통해 펩티드 손실을 감소시키고, 따라서 효능 예측의 부정확성을 최소화하고, 우리는 이전 펩티드 작동 ^(1)의 시험 관내 높은 처리량 스크리닝 분배 비접촉 탄성의 장점을 설명하고있다. 여기서는 마우스 글루카곤 유사 펩타이드 -1 수용체 (GLP-1R)에 펩티드 작동 스크리닝의 예를 이용하여 마이크로 타이 터 플레이트 펩티드 계열 희석 비접촉 탄성 제조 완전히 통합 된 자동화 솔루션을 논의한다. 우리의 방법은 높은 허용-throughput 작용제에 대한 화면을 분석 세포 기반 쉽게 증가 시료 처리를 지원하기 위해, 또는 (기타 표적 세포주 패널, 예) 분석 플레이트 사본 수가 증가를 허용하도록 확장 가능하다.

서문

GLP-1R은 제 2 형 당뇨병 ^(2)의 처리에서 설정된 약물 표적이다. 이 수용체에 대한 천연 펩티드 작용제, GLP-1은 2-3 분 ^(3)의 생체 내 반감기를 갖는다. 아데 닐 레이트 사이 클라 제의 활성화에 네이티브 G 단백질의 커플 링을 통해 제 메신저는 cAMP의 하류 생산의 G 단백질 결합 수용체 표적 결과 GLP-1의 결합. 축적 된 캠프의 측정은 강력한 분석 수용체 활성화를 모니터링하고 선호하는 물리 화학적 특성을 가진 활성 GLP-1 유사체에 대한 선별을 제공합니다. 이러한 분석은 농도 - 반응 곡선을 구성하기 시험 샘플의 일련의 희석을 필요로하고, 펩티드 샘플 나눠 때 특히 복잡하다. 팁 기반 일련 희석 준비에서 잠재적 인 오류는 이전에 ^1,4,5 설명 하였다. 펩타이드는 신뢰할 수없는 힘 추정 결과, plasticware에 흡착됩니다. 펩티드 손실 t 통해 최소화 될 수있다그는 소 혈청 버퍼에서 알부민 (BSA)와 실리콘 처리 plasticware의 사용, 아직 결합 단백질의 포함은 예측할 수없는 남아 있습니다. 특히, 실험 용기에 GLP-1의 결합의 편차가 ^6을 설명 하였다. 수성 분석 완충액으로 팁, 마이크로 타이 터 플레이트에서 침출 단백질 기능 ^{(7, 8)을} 방해 할 수 실험실 plasticware에 사용 된 안정 화제의 또 다른 합병증이있다. 따라서, 방법 plasticware 노출을 감소시키기는 측정의 정확성을 증가시킬 필요가있다.

어쿠스틱 액체 디스펜서 인접 분석 플레이트 ^(9)로 정밀한 나노 리터 액적 토출의 결과, 유체 시료의 표면에 고주파 음향 신호를 집중한다. 탄성 분사의 사용은 제조 및 대형 합성 화합물 라이브러리의 스크리닝을위한 제약 산업 표준 및 기술은 잘 작은 molecul 대한 검증되었습니다에스 ^10. 우리의 지식, 우리는 재조합 및 합성 펩타이드의 제조를위한 음향 분배를 설명하는 첫 번째 그룹이며, 우리는 이전에 기존의 팁 기반의 방법 ^1에 비해 향상된 정확도를보고했다.

이 문서에서는 완전히 자동화 된 플레이트 처리 로봇 시스템에 비접촉 음향 전송에 의한 펩타이드 직렬 및 직접 희석의 준비의 통합을 설명합니다. 샘플 음향 전달을 감싸는 다수의 방법은 이전에 ¹¹ 설명되었다. 우리는 2 단계 방법의 중간 스톡 농도를 준비하고 직렬의 전체 용량 - 반응 곡선의 생성에 대한 펩타이드 유사체 희석을 이용한다. 제조 된 펩타이드는 세포를 대상 마우스 GLP-1R 발현과 함께 배양하고, 우리는 펩티드 작동 제의 액티브의 판독 이러한 세포 내에서의 cAMP 축적을 측정하기 위해, 시판 균질 시간 - 분해 형광 (HTRF) 분석을 사용하여성만. 상기 분석은 견고하고 높은 처리량 384- 웰 포맷 의무 일상적 모두 분석법 개발에 적용되는 약물 스크리닝 ^(12)을 투사한다.

프로토콜

1. 펩타이드 직렬 희석

1. 분석 완충액을 준비 : 행크스 25 mM의 HEPES, 0.1 % BSA 및 0.5 mM의 3- 이소 부틸 -1- 메틸 크 (IBMX), pH를 7.4로 보충 된 염 용액 (HBSS)에 버퍼링.
2. 체계적 다섯 384 웰 저용량 분석 플레이트의 각 웰에 분석 완충액 5 μL를 추가 벌크 시약 디스펜서를 사용한다.
   1. 제조업체의 지침에 따라 384 웰 플레이트의 각 웰에 5 μL 볼륨 추가를위한 분배 프로그램을 만들기 위해 내부 소프트웨어를 사용합니다.
   2. 분석 버퍼와 주요 유체에 카세트 튜브를 분배 빠져.
   3. 플레이트 캐리어 384도 낮은 볼륨 분석 플레이트를 놓습니다.
   4. 를 눌러 시작.
3. 100X 펩티드 스톡을 생성하는 분석 완충액에 관계없이 기억 차량의 모든 펩티드 시료를 희석.
   주 : 스크리닝을 요구하는 펩타이드는 예를 들어, DMSO w (적절한 것으로 간주 포스페이트 완충 식염수 (PBS) 또는 디메틸 설폭 사이드 (DMSO)에 제공 될 수있다병이 같은 PEG 화와 같은 보조 수정)과 펩티드에 해로운 영향을 미친다.
4. 열 음향 자격을 갖춘 384 웰 폴리 프로필렌 마이크로 1-5로 25 μL를 100 배 펩타이드 주식을 분배. 이 판은 '소스 판 A'지정됩니다. 해당 소스 판을 확인 있지만 대상 플레이트, 평면 바닥하고 어쿠스틱 악기의 제조 업체에 의해 정의 된 특정 음향 허용 오차를 준수합니다.
5. 우물 A23에 25 μL의 100 배 기준 제어를 분배 및 소스 판 A의 A24
6. 소스 A. 플레이트의 컬럼에 컬럼 21-22 11-15 30 μL의 분석 완충액으로 10 ㎕의 분석 완충액을 분배
7. 열 번째 음향 정규화 384- 웰 폴리 프로필렌 마이크로 6-10 및 16-20 칼럼에 10 μL의 분석 완충액을 분주한다. 이 판은 '소스 판 B'를 지정한다.
8. 1 분 300 XG에 원심 분리기 소스 판 A와 B. 적절한 균형 플레이트를 포함합니다.
9. 음향 flui를 사용하여소스 A에 열 1에서 100 배 펩타이드 주식 (분석 버퍼) (100) 중간 희석 : D 디스펜서는 세 연속 1을 제조 자동화 로봇 시스템에 통합
   참고 : 프로그래밍 소스 A와 소스 B (플레이트 레이아웃 그림 1 참조) 사이의 세 가지 음향 전송을 허용하는 판 포맷하고 (음향 유체 디스펜서의 제조 업체에 의해 제공) 용량 반응 소프트웨어가 필요합니다. 구체적으로는 1.9 상세 자동화 로봇 제어하에,이 실험에서 사용되는 액체 분배기의 사용 단계 (재료 표 참조) :
   1. 로봇의 판 호텔 섹션에로드 소스 접시와 분석 플레이트.
   2. 오픈 자동화 된 로봇 소프트웨어 및로드 플레이트 재 포맷 및 용량 반응 프로그램 확장 프로토콜. '실행'을 클릭합니다.
      참고 : 자동화 소스 플레이트 B의 열 6-10로 소스 플레이트 (A)의 열 1-5에서 250 NL을 전송하는 음향 유체 디스펜서를 지시하고, 두 번째 ACOUSTI섞어 15 ㎕의 분석 완충액으로 백필 더 큰 유체 볼륨을 처리 할 수있는 C 액 디스펜서. 자동화는 통합 원심 분리기 1 분 동안 300 XG에 원심 분리기 (적절한 균형 판은 모든 원심 분리 단계를 포함)에 소스 판 B를 전송합니다. 소스 플레이트 B 소스 판 A의 열 11-15로 소스 플레이트 B의 열 6-10에서 250 NL의 전송을 위해 음향 유체 분배기로 돌아 혼합 15 μl를 분석 버퍼 백필됩니다. 통합 원심 분리기 1 분 동안 300 XG에 원심 분리기에 자동화 전송 소스 플레이트를했다. 소스 플레이트 (A)는 다음 소스 판 B의 열을 16-20로 소스 플레이트 (A)의 열이 11 ~ 15에서 250 NL의 전송을 위해 음향 유체 분배기로 돌아 혼합 15 μl를 분석 버퍼 백필됩니다. 자동화는 1 분 300 XG에 통합 원심 분리기 및 원심 분리기에 소스 판 B를 전송합니다.
      주 : 마지막 투여 량 반응 프로토콜을 전송하는 탄성 분배 지시(소스 플레이트 A와 소스 플레이트 B 모두에서) 4 직렬 희석 소스 판 우물의 각에서 필요한 볼륨을 분석 플레이트에 중복으로 전체 11 점 곡선을 구성하는 (위의 단계 1.2에서 5 ㎕를 분석 버퍼로 미리 채워진 ). 자동화 통합 원심 분리기에 전송 분석 플레이트 및 원심 분리기 1 분 300 XG에.

2. 셀 준비

1. 20 mL의 분석 완충액에서 37 ºC 수욕 재현 탁하고 빠르게 목표 마우스 GLP-1 수용체를 발현 녹여 동결 보존 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포.
2. 실온에서 200 XG (RT)에서 5 분 동안 원심 분리 세포 현탁액. 적절한 균형을 포함합니다.
3. 뜨는을 취소하고 10 ml의 분석 버퍼에 세포 펠렛을 재현 탁.
4. 트리 판 블루 1 및 자동 세포 계수기를 사용하여 생존 세포 밀도를 결정 : 세포 스톡 1 희석. 아 당 8,000 세포 (동등한 ml의 1.6 × 10 ⁶ 세포에서 분석 버퍼에 재현 탁 세포분석 판 리터).
5. 실온에서 30 분 동안 (5 μL를 분석 완충액에 희석 한 펩티드를 포함)을 분석 플레이트의 각 웰에 세포 현탁액을 5 μL를 추가 배양 벌크 시약 디스펜서를 사용한다.

3. HTRF 캠프 탐지 분석

1. 사용하기 전에 30 분 동안 실온 HTRF의 cAMP 분석 키트를 준비한다.
2. (캠프 검출법의 제조자에 의해 제공된 고유의 제제) 용해 완충액에 희석 1시 20분 별도로 각 HTRF 시약 (크립 테이트 및 D2)을 준비한다.
   참고 :주의 : 용해 버퍼가 칼륨 독성 플루오 라이드 (KF)과 기형 ^{(13)를 포함한다.} 폐기, KF를 포함하는 분석 플레이트를 밀봉하고 소각 및 액체 폐기물은 이전 싱크대 아래로 폐기 물 <1 밀리몰 / L로 희석해야한다.
3. 분석 플레이트의 모든 웰에 5 μL의 크립 테이트 시약을 추가 벌크 시약 디스펜서를 사용합니다.
4. 콜럼 5 μL의 D2 시약을 추가 벌크 시약 디스펜서를 사용NS 분석 판 1-22.
5. 수작업의 비 - 특이 적 결합 (NSB) 대조군 웰과 웰 E23-P24에 D2 시약 5 μl를 제공하기 위해 분석 플레이트의 웰 A23-D24에 5 ㎕의 용해 완충액을 피펫.
6. 우물을 섞어 실온에서 200 XG에서 1 분 동안 분석 플레이트를 원심 분리기.
7. 증발 및 사진 표백을 최소화하고 1 시간 동안 실온에서 배양 분석 플레이트를 커버.
8. 620 nm에서 플레이트 리더를 사용하여 665 nm에서 320 nm의 여기 및 발광을 사용하여 형광 공명 에너지 전달 (FRET) 신호를 측정한다.

4. 데이터 분석

1. 모든 우물에서 배경을 뺄 NSB을 의미합니다.
2. 다음과 같이 665 나노 미터 / 620 nm의 비율에서 % 델타 F를 계산합니다 :
   비율 = (A _665nm / A _{620 ㎚)는} 10 ⁽⁴⁾ X
   델타 F = ((샘플 비율 - 비율 _NSB) / 비율 _NSB는)) × 100
   여기서 비율 _NSB없이 D2 시약 우물을 =.
3. %의 activat을 계산다음 자극되지 않은 세포와 세포 사이의 이온 최대 GLP-1을 리간드로 자극 :
   % 활성 = (% Fsample 델타가 - %가 DeltaFunstimulated 셀) / (%의 DeltaFGLP-1 세포 자극 - % DeltaF 자극되지 않은 세포) × 100
4. 기준 제어부 ^(1)에 의해 정의 된 바와 같은 활성 % 4- 매개 변수 병참 분석 그래프를 통해 농도 - 반응 곡선을 분석한다.

결과

우리는 일상적 탄성 송금 펩티드 희석 두 단계 방법을 사용한다. 첫 번째 단계의 경우, 자동으로 정렬 음향 디스펜서는 두 개의 소스 판에서 네 재고 펩타이드 중간 희석액을 만드는 데 사용됩니다 (그림 1A, B). 두 번째 단계에서, 우리는 상기 각 테스트 펩티드 (도 1C)에 대한 11 점의 농도 범위를 만들기 위해 소스 판 A 및 B에서 스?...

토론

이 프로토콜은 직렬 샘플의 1 μl를 필요로하는 3 × ^106의 농도 범위 펩티드 시료를 희석하는 자동 분배 탄성의 성공적인 적용을 설명한다. 이 방법의 가장 큰 장점은 일반적으로 시약 전송 및 믹싱에 필요한 실험 용기 (예 : 피펫 팁 등) plasticware에 샘플 감소 노출을 통해 plasticware에 펩타이드의 흡착을 최소화를 통해 데이터 품질을 높이는 것입니다. 탄성 분배 완전히 plasticware의 사용을 배제...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Hanks’ Balanced Salt solution	Sigma-Aldrich	H8264
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	A9418
3-Isobutyl-1-methylxanthine	Sigma-Aldrich	I7018	Prepared as a 0.5 M stock in DMSO
GLP-1 (7-36) amide	Bachem	H-6795	Prepared as a 1 mg/ml stock in PBS, referred to as '100x reference control'
Test peptides	Produced in-house at MedImmune		Supplied at various concentrations in DMSO or PBS as appropriate
100x peptide stock	Produced in-house at MedImmune		Test peptide diluted into assay buffer to 100x final required concentration
Trypan Blue Solution, 0.4%	Thermo Fisher Scientific	15250-061
Cedex XS Cell Analyzer	Innovatis
Corning 384 well plates, low volume	Sigma-Aldrich	4514
Echo Qualified 384-Well Polypropylene Microplate	Labcyte Inc.	P-05525
Echo Qualified Reservoir	Labcyte Inc.	ER-0055
Echo 550 Liquid Handler	Labcyte Inc.		Droplet transfer volumes in increments of 2.5 nl
Echo 525 Liquid Handler	Labcyte Inc.		Droplet transfer volumes in increments of 25 nl
ACell Benchtop Automation	HighRes Biosolutions	MC522
Cellario Lab Automation Scheduling software for Life Science Robotics	HighRes Biosolutions
MultidropCombi Reagent Dispenser	ThermFisher Scientific	5840300	Referred to as 'bulk reagent dispenser'
HTRF cAMP Dynamic 2 kit	Cisbio Bioassays	62AM4PEJ
EnVision Multilabel Reader	PerkinElmer