Automated acoustique de distribution pour la Dilution série de Peptide Agonistes dans Potency Détermination Assays

Résumé

Peptide adsorption to plasticware during traditional tip-based serial dilutions can significantly impact potency determination and confound the understanding of structure-activity relationships used for lead identification and lead optimization phases of drug discovery. Here methods for automated acoustic non-contact serial dilution of peptide samples are described.

Résumé

Comme pour la découverte de médicaments petite molécule, le criblage pour des agonistes de peptides nécessite une dilution en série de peptides pour produire des courbes de concentration-réponse. Le criblage des peptides donne une couche supplémentaire de complexité des procédés de manipulation des échantillons à base basculantes conventionnelles exposent des peptides à une grande surface de plasticware, offrant une opportunité accrue pour la perte de peptide par adsorption. Prévenir une exposition excessive à plasticware réduit la perte de peptide via l' adhésion aux plastiques et donc minimise les inexactitudes dans la prédiction de la puissance, et nous avons décrit précédemment les avantages de la non-contact acoustique de distribution pour in vitro criblage à haut débit d'agonistes peptidiques ^1. Ici, nous discutons une solution d'automatisation totalement intégré sans contact acoustique de préparation des dilutions en série de peptides dans des plaques de microtitrage en utilisant l'exemple de criblage pour des agonistes peptidiques du glucagon-like peptide-1 du récepteur de la souris (GLP-1R). Nos méthodes permettent de haute-throughput cellulaire à base d'essais à l' écran pour les agonistes et sont facilement modulables pour soutenir l' augmentation du débit de l' échantillon, ou pour permettre l' augmentation du nombre de copies de la plaque d'essai (par exemple, pour un panel de plusieurs lignes de cellules cibles).

Introduction

GLP-1R est une cible médicamenteuse établie dans le traitement du diabète de type 2 ^2. L'agoniste de peptide natif pour ce récepteur, le GLP-1, a un in vivo demi-vie de 2 à 3 min ^3. La liaison de GLP-1 à ses couplés à la protéine récepteur conduit cible G dans la production en aval de la deuxième cAMP messager par le couplage de la protéine G native à l'activation de l'adénylcyclase. La mesure de l'AMPc accumulé fournit un dosage solide pour contrôler l'activation du récepteur et pour cribler des actifs analogues de GLP-1 ayant des propriétés physico-chimiques préférés. Un tel essai nécessite la dilution en série d'échantillons d'essai pour construire des courbes de concentration-réponse, ce qui est particulièrement compliquée lors de la remise des échantillons peptidiques. Les erreurs potentielles de la préparation de dilution en série à base de pointe ont été décrits précédemment ^1,4,5. Peptides adsorberont à plasticware, entraînant des estimations de virilité peu fiables. perte de Peptide peut être minimisé en til inclusion d'albumine de sérum bovin (BSA) dans les tampons et l'utilisation de matériel en plastique siliconée, mais la liaison protéique reste imprévisible. En particulier, la variation dans la liaison de GLP-1 à des récipients expérimentaux a été décrit ^6. Il y a une autre complication en ce que des agents de stabilisation utilisés dans le laboratoire plasticware peut lixivier à partir des conseils et des plaques de microtitrage dans des tampons d'essai aqueux et interférer avec la fonction de la protéine ^{7, 8.} Par conséquent, des méthodes pour réduire l' exposition à plasticware sont nécessaires pour augmenter la précision des mesures.

Distributeurs de liquides acoustiques concentrent un signal acoustique à haute fréquence sur la surface d'un échantillon de fluide, ce qui entraîne l'éjection de gouttelettes d'nanolitre précises dans une plaque d'essai adjacente ^9. L'utilisation d'éjection acoustique est la norme dans l'industrie pharmaceutique pour la préparation et le criblage de grandes bibliothèques de composés synthétiques, et la technologie a été bien validé pour les petites molecul¹⁰ s. À notre connaissance, nous sommes le premier groupe pour décrire la distribution acoustique pour la préparation de peptides recombinants et synthétiques et nous avons précédemment rapporté la précision améliorée par rapport aux méthodes basées sur la pointe conventionnelles ^1.

Cet article décrit l'intégration de la préparation des peptides dilutions en série et directes par transfert acoustique sans contact sur une manipulation plaque système robotique entièrement automatisé. Un certain nombre de méthodes englobant transfert acoustique d'échantillons ont été décrits précédemment ^11. Nous utilisons un procédé en deux étapes pour préparer des concentrations de stock intermédiaire et de diluer en série analogues peptidiques pour la génération de la pleine courbe dose-réponse. Les peptides ainsi préparés sont mis en incubation avec des cellules exprimant la cible souris GLP-1R, et nous utilisons un dosage disponible dans le commerce par fluorescence à résolution temporelle homogène (HTRF) afin de mesurer l'accumulation d'AMPc à l'intérieur de ces cellules en lecture des peptides agonistes activlité. Le test est robuste et prête à un format de 384 puits à haut débit et systématiquement appliqué à la fois le développement de tests et de dépistage de drogue projets ^12.

Protocole

1. Peptide Dilution série

1. Préparer un tampon de dosage: Hanks, une solution saline tamponnée (HBSS) complétée avec HEPES 25 mM, 0,1% de BSA et mM de 3-isobutyl-1-méthylxanthine 0,5 (IBMX), pH 7,4.
2. Utiliser un distributeur de réactifs en vrac pour ajouter systématiquement 5 pi de tampon de dosage à chaque puits de cinq plaques de 384 puits à faible dosage de volume.
   1. Utilisez un logiciel interne pour créer un programme de distribution pour plus de volume de 5 pi à chaque puits d'une plaque à 384 puits selon les instructions du fabricant.
   2. Immerger distribuer un tube de la cassette dans le tampon d'essai et de liquide principal.
   3. Placer 384 puits faible volume plaque d'essai sur le support de plaque.
   4. Appuyez sur Start.
3. Diluer tous les échantillons de peptides, indépendamment du véhicule de stockage, dans un tampon d'essai pour produire un peptide bouillon 100x.
   NOTE: Peptides exigeant le dépistage peuvent être fournis dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) ou le diméthylsulfoxyde (DMSO) comme cela est jugé approprié (par exemple, le DMSO wmalades ont un effet délétère sur des peptides avec des modifications secondaires telles que la PEGylation).
4. Distribuer 25 ul stocks de peptides 100x en colonnes 1-5 d'un 384 puits microplaques en polypropylène acoustiquement qualifié. Cette plaque est désignée «source plaque A '. Veiller à ce que les plaques de source, mais pas les plaques de destination, sont à fond plat et sont conformes aux tolérances acoustiques spécifiques telles que définies par le fabricant d'instruments acoustiques.
5. Distribuer 25 ul de contrôle de référence 100x dans les puits A23 et A24 de la plaque source A.
6. Distribuer 10 pi de tampon de dosage dans les colonnes 11-15 et du tampon d'essai de 30 ul dans les colonnes 21-22 de plaque source A.
7. Distribuer 10 pi de tampon de dosage dans les colonnes 6-10 et 16-20 colonnes d'un second de 384 puits en polypropylène microplaque acoustiquement qualifié. Cette plaque est désignée «plaque source B '.
8. Centrifugeuse plaques de source A et B à 300 xg pendant 1 min. Inclure une plaque d'équilibre.
9. Utilisez flui acoustiqued distributeurs intégrés dans un système robotique automatisé pour préparer trois séquentiels de 1: 100 des dilutions intermédiaires (dans un tampon de dosage) des stocks de peptides 100x de la colonne 1 dans la source A.
   NOTE: La programmation nécessite le reformatage de la plaque et le logiciel de dose - réponse (telle que fournie par le fabricant du distributeur de fluide acoustique) pour permettre trois transferts acoustiques entre la source A et la source B (voir la figure 1 pour des plans de plaque). Etape 1.9 détails spécifiquement l'utilisation de distributeurs de fluide utilisés dans ce laboratoire sous contrôle robotique automatisé (voir tableau Matériaux):
   1. Charger des plaques de source et des plaques d'essai dans la section de l'hôtel de la plaque de la robotique.
   2. Ouvrez le logiciel robotique automatisé et la charge reformatage de la plaque et les protocoles d'expansion du programme de réponse à la dose. Cliquez sur "Exécuter".
      REMARQUE: Automatisation indique un distributeur de fluide acoustique pour transférer 250 nl de colonnes 1-5 de la plaque source A dans les colonnes 6-10 de la plaque source B, et un second acoustic distributeur de fluide capable de traiter des volumes de fluide plus importants pour remblayer avec 15 ul du tampon d'essai pour mélanger. Automatisation transfère ensuite la plaque source B à la centrifugeuse et des centrifugeuses à 300 g pendant 1 min intégré (une plaque d'équilibre est compris pour toutes les étapes de centrifugation). plaque de Source B est retourné au distributeur de fluide acoustique pour le transfert de 250 nl de colonnes 6-10 de la source plaque B dans les colonnes 11-15 de la plaque source A et remblayer avec du tampon d'essai de 15 pi pour mélanger. Automatisation des transferts source de plaque A à la centrifugeuse et des centrifugeuses à 300 g pendant 1 min intégré. plaque de source A est ensuite retourné au distributeur de fluide acoustique pour le transfert de 250 nl de colonnes 11-15 de la plaque source A dans les colonnes 16-20 de la source plaque B et remblayer avec du tampon d'essai de 15 pi pour mélanger. Automatisation transfère ensuite la plaque source B pour centrifugeuse et centrifugeuses intégrée à 300 xg pendant 1 min.
      REMARQUE: Enfin, le protocole de réponse à la dose réalise une distribution acoustique pour transférerle volume requis de chacun des 4 dilués en série des puits de plaque de source (à la fois dans la plaque de la source A et la plaque de la source B) pour construire une courbe en 11 points complète en double exemplaire dans des plaques d'essai (pré-rempli avec le tampon de dosage 5 ul à l'étape 1.2 ci-dessus ). transferts d'automatisation de la plaque d'essai à la centrifugeuse intégrée et centrifugeuses à 300 g pendant 1 min.

2. Préparation des cellules

1. des cellules cryoconservées décongélation ovaire de hamster chinois (CHO) exprimant le récepteur de souris rapidement cible de GLP-1 dans un bain à 37 ° C de l'eau et remise en suspension dans 20 ml de tampon d'essai.
2. centrifuger la suspension cellulaire pendant 5 min à 200 x g à température ambiante (TA). Inclure un équilibre approprié.
3. Rejeter le surnageant et remettre le culot cellulaire dans 10 ml de tampon d'essai.
4. Diluer cellulaire stock 1: 1 en bleu Trypan et déterminer la densité de cellules viables en utilisant un compteur de cellules automatisé. Resuspendre les cellules dans un tampon d'essai à 1,6 x 10 ⁶ cellules par ml (équivalent à 8000 cellules par well de plaques d'essai).
5. Utiliser un distributeur de réactifs en vrac pour ajouter 5 pl de suspension cellulaire dans chaque puits des plaques d'essai (contenant les peptides dilués en série dans du tampon de dosage 5 pi) et on incube à température ambiante pendant 30 min.

Essai 3. HTRF AMPc Détection

1. AMPc HTRF apporter kit d'essai à la température ambiante pendant 30 minutes avant utilisation.
2. Préparer chaque réactif HTRF (cryptate et d2) séparément à la dilution 1:20 dans du tampon de lyse (formulation exclusive, fournie par le fabricant du test de détection de l'AMPc).
   NB: ATTENTION: Le tampon de lyse contient du fluorure de potassium (KF) qui est toxique et tératogène ^13. Pour l'élimination, des plaques d'essai contenant KF doivent être scellés et incinérés, les déchets liquides doivent être dilués à <1 mmol / L avec de l'eau avant d'être éliminés dans l'évier.
3. Utiliser un distributeur de réactifs en vrac pour ajouter 5 ul de réactif de cryptate à tous les puits des plaques de dosage.
4. Utilisez un distributeur de réactifs en vrac pour ajouter 5 ul réactif d2 à columns 22/01 des plaques d'essai.
5. Immédiatement la pipette manuelle du tampon de lyse 5 ul dans les puits A23-D24 des plaques d'essai pour obtenir la liaison non spécifique (NSB) des puits témoins, et 5 ul de réactif dans les puits D2 E23-P24.
6. Centrifuger les plaques de dosage pendant 1 min à 200 x g à température ambiante pour mélanger les puits.
7. Couvrir les plaques d'essai afin de minimiser l'évaporation et la photo-blanchiment et incubation à température ambiante pendant 1 heure.
8. Mesurer la fluorescence de transfert d'énergie par résonance signal (FRET) en utilisant une excitation à 320 nm et émission à 620 nm et 665 nm en utilisant un lecteur de plaque.

Analyse 4. Données

1. Utilisez signifie NSB pour soustraire de fond de tous les puits.
2. Calculer% Delta F de la 665 nm / 620 nm rapport comme suit:
   Ratio = (A _{665 nm} / A _620nm) x 10 ⁴
   Delta F = ((Rapport de l' échantillon - Ratio _NSB) / Ratio _NSB)) x 100
   où _NSB = Ratio puits sans réactif d2.
3. Calculer% de activéions entre les cellules et les cellules non stimulées stimulées avec du GLP-1 au maximum de ligand comme suit:
   % = Activation (% Delta fLa -% cellules DeltaFunstimulated) / (cellules DeltaFGLP-1 stimulée% -% des cellules non stimulées deltaF) x 100
4. Analyser les courbes concentration-réponse via l' analyse logistique à 4 paramètres, et le graphique en% activation telle que définie par le contrôle de référence ^1.

Résultats

Nous utilisons régulièrement une méthode en deux étapes pour diluer les peptides par transfert acoustique. Pour la première étape, un distributeur acoustique aligné avec l' automatisation est utilisé pour créer quatre actions peptidiques dilutions intermédiaires à travers deux plaques de source (figure 1a, b). Pour la deuxième étape, nous utilisons un distributeur acoustique pour diluer encore disponible dilutions à partir de plaq...

Discussion

Ce protocole décrit l'application réussie de distribution acoustique automatisé pour diluer en série des échantillons de peptides sur une plage de concentration de 3 x 10 ⁶ nécessitant moins de 1 ul de l' échantillon. Le principal avantage de cette méthode est d'augmenter la qualité des données en minimisant peptide adsorption à plasticware via une exposition réduite des échantillons à des récipients expérimentaux et plasticware (tels que des pointes de pipette) qui sont normalemen...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Hanks’ Balanced Salt solution	Sigma-Aldrich	H8264
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	A9418
3-Isobutyl-1-methylxanthine	Sigma-Aldrich	I7018	Prepared as a 0.5 M stock in DMSO
GLP-1 (7-36) amide	Bachem	H-6795	Prepared as a 1 mg/ml stock in PBS, referred to as '100x reference control'
Test peptides	Produced in-house at MedImmune		Supplied at various concentrations in DMSO or PBS as appropriate
100x peptide stock	Produced in-house at MedImmune		Test peptide diluted into assay buffer to 100x final required concentration
Trypan Blue Solution, 0.4%	Thermo Fisher Scientific	15250-061
Cedex XS Cell Analyzer	Innovatis
Corning 384 well plates, low volume	Sigma-Aldrich	4514
Echo Qualified 384-Well Polypropylene Microplate	Labcyte Inc.	P-05525
Echo Qualified Reservoir	Labcyte Inc.	ER-0055
Echo 550 Liquid Handler	Labcyte Inc.		Droplet transfer volumes in increments of 2.5 nl
Echo 525 Liquid Handler	Labcyte Inc.		Droplet transfer volumes in increments of 25 nl
ACell Benchtop Automation	HighRes Biosolutions	MC522
Cellario Lab Automation Scheduling software for Life Science Robotics	HighRes Biosolutions
MultidropCombi Reagent Dispenser	ThermFisher Scientific	5840300	Referred to as 'bulk reagent dispenser'
HTRF cAMP Dynamic 2 kit	Cisbio Bioassays	62AM4PEJ
EnVision Multilabel Reader	PerkinElmer