JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

وغالبا ما يسبب عدم انتظام ضربات القلب ورثت من الطفرات التي تغير تسليم سطح القنوات الأيونية واحد أو أكثر. هنا، علينا أن نكيف التدفق الخلوي المقايسات لتوفير الكمي من إجمالي وسطح الخلية بروتين تعبير نسبي من القنوات الأيونية المؤتلف وأعرب في TSA-201 الخلايا.

Abstract

Inherited or de novo mutations in cation-selective channels may lead to sudden cardiac death. Alteration in the plasma membrane trafficking of these multi-spanning transmembrane proteins, with or without change in channel gating, is often postulated to contribute significantly in this process. It has thus become critical to develop a method to quantify the change of the relative cell surface expression of cardiac ion channels on a large scale. Herein, a detailed protocol is provided to determine the relative total and cell surface expression of cardiac L-type calcium channels CaV1.2 and membrane-associated subunits in tsA-201 cells using two-color fluorescent cytometry assays. Compared with other microscopy-based or immunoblotting-based qualitative methods, flow cytometry experiments are fast, reproducible, and large-volume assays that deliver quantifiable end-points on large samples of live cells (ranging from 104 to 106 cells) with similar cellular characteristics in a single flow. Constructs were designed to constitutively express mCherry at the intracellular C-terminus (thus allowing a rapid assessment of the total protein expression) and express an extracellular-facing hemagglutinin (HA) epitope to estimate the cell surface expression of membrane proteins using an anti-HA fluorescence conjugated antibody. To avoid false negative, experiments were also conducted in permeabilized cells to confirm the accessibility and proper expression of the HA epitope. The detailed procedure provides: (1) design of tagged DNA (deoxyribonucleic acid) constructs, (2) lipid-mediated transfection of constructs in tsA-201 cells, (3) culture, harvest, and staining of non-permeabilized and permeabilized cells, and (4) acquisition and analysis of fluorescent signals. Additionally, the basic principles of flow cytometry are explained and the experimental design, including the choice of fluorophores, titration of the HA antibody and control experiments, is thoroughly discussed. This specific approach offers objective relative quantification of the total and cell surface expression of ion channels that can be extended to study ion pumps and plasma membrane transporters.

Introduction

وتقدم هذه الورقة فحص موثوق للإبلاغ عن التعبير سطح الخلية النسبي للبروتينات غشاء مثل القنوات الأيونية التي أعرب عنها في خلايا المؤتلف باستخدام تقنية التدفق الخلوي القائمة. القنوات الأيونية هي تشكيل المسام بروتينات غشاء التي هي المسؤولة عن السيطرة على الإشارات الكهربائية عن طريق النابضة تدفق الأيونات عبر غشاء الخلية. يتم تصنيفها من قبل آلية تفعيل، والطبيعة، والانتقائية الأنواع أيون تمر عبر المسام حيث يتم ترجمة ما. في مستويات الخلايا والأنسجة، وتدفقات أيون العيانية من خلال القنوات الأيونية هي نتاج الخصائص الفيزيائية الحيوية 1 (النابضة وتخلل)، والكيمياء الحيوية (الفسفرة)، ونشوء حيوي (التوليف، بالغليكوزيل، والاتجار، وتدهور). كل من هذه العمليات هي فريدة من نوعها لكل نوع من القنوات الأيونية وهو الأمثل لأداء الدور الفسيولوجي للقناة أيون. ونتيجة لذلك، وتعديلات في أي من هذه العمليات ضبطها غرامة من خلالالموروثة أو التعديل الوراثي، وغالبا ما يشار إليها باسم "اعتلال القنوات"، يمكن أن يؤثر سلبا على التوازن الخلية. ومن المهم التأكيد على أن توفير "الحق" كمية من القنوات الأيونية على سطح الخلية أمر بالغ الأهمية لتوازن الخلايا. حتى زيادات صغيرة (ربح من وظيفة) وانخفاض صغيرة (الخسارة من وظيفة) في نشاط القناة الايونية لديها القدرة على التسبب في أمراض خطيرة على مدى العمر. عيوب في تسليم سطح الخلية من القنوات الأيونية الناضجة هي من العوامل الهامة في العديد من channelopathies، مثل التليف الكيسي (القناة الايونية CFTR) (2) وعدم انتظام ضربات القلب من شكل طويل كيو تي متلازمة (قنوات البوتاسيوم في القلب) 3.

ترتبط Channelopathies مع الموت المفاجئ القلب 4. ويعتقد أن انتشار في جميع أنحاء العالم الحالي لجميع channelopathies القلب أن يكون على الأقل 1: 2،000-1: 3000 في الفردي 5، ومسؤولة عن حوالي نصف المفاجئ عدم اتساق نبضات القلب كاليفورنيا موت القلبإس إي إس 6. ومن المعروف أن الخلل في القلب الجهد بوابات sodium-، البوتاسيوم، والكالسيوم القنوات الأيونية الانتقائية للعب دورا رئيسيا في هذه العملية. مطلوب L من نوع كا V 1.2 قناة الكالسيوم الجهد بوابات لبدء متزامنة القلب تقلص العضلات. وقلبية L من نوع كا V 1.2 قناة هو بروتين معقد متعدد فرعية مؤلفة من تشكيل المسام الرئيسية الكالسيوم فرعية الخامس α1 والكالسيوم الخامس ß والكالسيوم الخامس α2δ1 مفارز المساعدة 7-12. لاحظ أنه مطلوب مجموعة كاملة من وحدات فرعية إضافية للإنتاج وظيفية الكالسيوم V 1.2 قنوات في غشاء البلازما والتفاعلات الدينامية بين هذه الوحدات الفرعية ضرورية لدعم وظيفة الكهربائية العادية للقلب 13. كاليفورنيا الخامس ß يشجع على التعبير سطح الخلية كا V 1.2 القنوات غير التساهمية nanomolar التفاعل مسعور 14. شارك في التعبير عن كا الخامس α2δ1 فرعية وايملزمة SS-تشرين الكالسيوم الخامس الكالسيوم الخامس α1 يحفز التعبير الذروة الحالية (5-10 أضعاف) ويعزز تفعيل القناة في الفولتية أكثر سلبية. الحصول على وظيفة من الطفرات من الوحيدات تشكيل المسام وقد ارتبط الكالسيوم V 1.2 مع شكل من أشكال عدم انتظام ضربات القلب البطيني تسمى متلازمة كيو تي الطويلة 15 في حين أن مجموعة من الطفرات نقطة في مفارز الرئيسية الثلاثة التي تشكل L من نوع كا V 1.2 قناة تم تحديدها في موضوعات يعانون من عدم انتظام ضربات القلب من شكل متلازمة قصيرة QT 16،17. القنوات الأيونية هي بروتينات الغشاء الذي يمكن التحقيق من وجهة نظر الكيمياء الحيوية (كيمياء البروتين) أو باستخدام أدوات الكهربية (آلات توليد الحالي) وغالبا ما تستخدم هذه المناهج التكميلية. الكهربية، ولا سيما خلية كاملة التصحيح، لقط، هو نهج مناسب لتوضيح وظيفة القنوات الأيونية 15 ولكن لا يمكن حل التعديلات في الاتجار البروتين من التغييرات في فيزيائية لهاالخصائص. الكيمياء البروتين و، ومع ذلك، وغالبا ما يقتصر استخدام بسبب التعبير منخفضة نسبيا من بروتينات الغشاء كبيرة النسبية للبروتينات قابلة للذوبان أصغر. تحتاج إلى تطوير لتعالج على وجه التحديد عيوب في نشوء حيوي البروتين يسبب تغييرات في التعبير سطح الخلية من القنوات الأيونية قوية الأساليب الإنتاجية العالية باستخدام قراءات مضان.

التدفق الخلوي هي تكنولوجيا الفيزيائية الحيوية المستخدمة في عد الخلايا، والفرز، وكشف العلامات البيولوجية، وهندسة البروتينات 18. عندما يتم حقن محلول عينة من الخلايا الحية أو الجسيمات في قياس التدفق الخلوي، يتم ترتيب الخلايا في تيار واحد التي يمكن بحثها من قبل نظام الكشف عن الجهاز (الشكل 1). تدفق الأول الكريات أداة أنتجت في عام 1956 19 الكشف عن معلمة واحدة فقط ولكن أجهزة قياس التدفق الخلوي الحديثة ليزر متعددة وأجهزة الكشف عن مضان التي تسمح للكشف عن أكثر من 30 المعلمات الفلورسنت 20،21.الفلاتر والمرايا (البصريات الانبعاث) مباشرة مبعثر خفيفة أو ضوء الفلورسنت من الخلايا لشبكة إلكترونية (الضوئي وأجهزة الكشف) التي تحول ضوء يتناسب مع شدته. ويتم تحليل البيانات الرقمية باستخدام برامج متخصصة ويتم عرض الإنتاج الأساسي باعتباره نقطة مؤامرة 21.

figure-introduction-4893
الشكل 1: مبادئ فيزيائي حيوي من تدفق الفرز الخلوي يتم دفع الخلايا واحدة من خلال فوهة تحت ضغط عال داخل تيار من السوائل غمد الذي ينقلهم عبر واحدة أو أكثر من نقاط الاستجواب الليزر. ينحرف شعاع ضوء من الخلايا تمر ويتم إرسالها ضوء جمعها في الاتجاه إلى الأمام (إلى الأمام مبعثر، FCS) إلى الثنائي الضوئي الذي يحول الضوء إلى إشارة يتناسب مع حجم الخلية. يتم جمع ضوء أيضا في زاوية 90 درجة إلى طريق الليزر وإرسالها إلى أجهزة الكشف عن (وتسمى أيضا صمام تضخيم ضوئي (PMT)).يتم توجيه هذا الضوء من خلال المرايا مزدوج اللون التي تسمح للكشف عن إشارة الجانب مبعثر (SSC)، مما يعكس تحبب داخل الخلايا، والانبعاثات الفلورسنت إذا fluorochromes متحمس موجودة في الخلية. يتم تمثيل ثلاثة أجهزة الكشف عن (الأخضر والأصفر، والأحمر) مع مرشحات مختلفة الطول الموجي ممر الموجة، والسماح للكشف في وقت واحد fluorochromes مختلفة. ورقمنة الإشارات المختلفة من خلال جهاز كمبيوتر خارجي وتحويلها إلى بيانات التي سيتم تحليلها لتحديد خصائص الخلايا. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

وقد استغل القدرة الإنتاجية العالية من أجهزة قياس التدفق الخلوي لقياس التعبير غشاء النسبي المؤتلف من النوع البري والاتجار نقص الجهد بوابات L من نوع كا V 1.2 القنوات ومفارز المرتبطة في الخلايا الحية. كدنا] يبني المشتركوالموسومة دينغ للبروتينات مضاعفة للقيام في وقت واحد حاتمة خارج الخلية غير الفلورسنت التي يمكن الكشف عنها بواسطة الأجسام المضادة مترافق فلوري كتيمة وfluorophore الخلايا التي هي فلوري جوهري. كلا حاتمة خارج الخلية، وإدراجها في حلقة خارج الخلية من البروتين، وfluorophore داخل الخلايا، وإدراجها بعد C-محطة، وتحول مع البروتين. في هذه السلسلة من التجارب، وهندسة كا بروتين الخامس α2δ1 إبداء هيماغلوتينين خارج الخلية (HA) حاتمة (YPYDVPDYA) الكشف من قبل FITC (فلوريسئين ثيوسيانات) بردة -conjugated مكافحة HA و mCherry كما fluorophore الخلايا الذاتية. لتحديد مستوى التعبير سطح الخلية النسبي للmCherry-كا الخامس α2δ1 بروتين HA الموسومة، وخلايا تم حصادها المؤتلف التعبير عن بروتين الانصهار بعد ترنسفكأيشن، وملطخة FITC مترافق الماوس وحيدة النسيلة المضادة للHA العلامة حاتمة antibodص (الشكل 2). FITC هو مركب الفلورسنت العضوي الذي هو أصغر بكثير من صحفيين الانزيم وبالتالي ليس من المرجح لتتداخل مع وظيفة بيولوجية. mCherry- الكالسيوم الخامس α2δ1-HA overexpressed في TSA-201cells، وتنتج عن زيادة قدرها 3-سجل كبيرة في مضان FITC وmCherry مضان على قطع ثنائية الأبعاد 22. وبالنظر إلى أن حاتمة HA يقع في جزء الخلية من البروتين، وكثافة مضان لFITC التي تم الحصول عليها في وجود خلايا سليمة تعكس المؤشر النسبي للتعبير عن سطح الخلية من البروتين HA الموسومة. إمكانية الوصول إلى حاتمة HA في بنيات يتم التحقق بشكل منهجي عن طريق قياس إشارة FITC بعد permeabilization الخلية. يخدم هذا الإجراء أيضا لإثبات مجموع تعبير البروتين تطبيع منذ كثافات مضان النسبية لFITC قدرت في الخلايا permeabilized قابلة للمقارنة نوعيا إلى القيم النسبية مضان FOص mCherry تقاس في ظل ظروف permeabilized وغير permeabilized 22،23. من المهم أن نلاحظ أن الطيف مضان جوهري هو تحول نحو القيم العليا بعد permeabilization إلا أن القيمة الوحيدة التي أبلغ عنها هو التغير في كثافة مضان بالمقارنة مع بناء السيطرة. وتقدر التغيرات النسبية في كثافة مضان لبنيات الاختبار باستخدام كثافة ΔMean الإسفار (ΔMFI) القيم لكل fluorophore (mCherry أو FITC). تم تصميم التجارب لقياس كثافة مضان الاختبار بناء بالنسبة للكثافة مضان من بناء سيطرة أعرب تحت نفس الظروف للحد من الاختلافات التجريبية في مضان لا يتجزأ من الأجسام المضادة fluorophore مترافق. درست اثنين من البروتينات الغشاء بنجاح باستخدام هذا الاختبار: الوحيدات تشكيل المسام من L-نوع الجهد بوابات قنوات الكالسيوم الكالسيوم V 1.2 14،22 وفي سلسلة مختلفة منالتجارب، مساعد خارج الخلية كا الخامس α2δ1 فرعية 22،23. تم استخدام بروتوكول التالية لتحديد التعبير سطح الخلية من الكالسيوم الخامس α2δ1 فرعية من القلب L من نوع كا V 1.2 قناة ظل ظروف السيطرة وبعد الطفرات التي تؤثر على تعديل posttranslational من القناة الايونية. تحت ظروف تجريبية موحدة، ومضان سطح الخلية من FITC يزيد شبه خطيا مع التعبير عن كدنا] الترميز لmCherry-كا الخامس البروتينات α2δ1-HA (الشكل 5 من مرجع 22).

figure-introduction-9194
الشكل 2: تمثيل تخطيطي لوضع العلامات الكلي والغشاء في التدفق الخلوي بروتوكول تجريبي ويبين المخطط بعض الخطوات الرئيسية اللازمة لقياس نسبي تعبير كامل وسطح الخلية من القنوات الأيونية المؤتلف التي كتبها فلوريداآه الخلوي. و transfected الخلايا مع المزدوج معلم البناء mCherry-كا الخامس α2δ1-HA في TSA-201 الخلايا (1) وملطخة قبل أو بعد permeabilization (2). يتم الحصول على البيانات Multiparameter في قياس التدفق الخلوي (3) للتحليل متعدد المتغيرات (4). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Protocol

1. يبني المضاعفة معلم الحمض النووي

  1. إدراج حاتمة HA (YPYDVPDYA) في رابط خارج الخلية كا الخامس α2δ1 بين D676 و R677 من قبل الموقع الموجه الطفرات (الشكل 3B) 20. استخدام gccggattatgcgGGAAAACTCCAAACAACC التمهيدي إلى الأمام وعكس acatcatacggataTCAATAAATTCATTGAAATTTAAAAGAAATTC التمهيدي.
  2. Subclone تسلسل كدنا] من ها كا الخامس α2δ1 الموسومة في ناقلات التعبير عن pmCherry N1 الثدييات تهدف إلى التعبير عن بروتين تنصهر إلى N-محطة من mCherry بين المواقع ساسي وسالي (الشكل 3B) 20.
    ملاحظة: المناسبة وظيفة قناة لا بد من اختبار مع بناء للسيطرة على استخدام أساليب الكهربية القياسية 24.

2. بوساطة الحويصلية ترنسفكأيشن عابر (30 دقيقة، يتم تنفيذ جميع الخطوات تحت تدفق رقائقي هود)

  1. يوم 1: لوحة لنصف مليون تسا-201 الخلايا (أو HEKT) في35 أطباق ثقافة ملم مع 2 مل من Dulbecco والأساسية الدنيا والمتوسطة عالية الجلوكوز (DMEM-HG) تستكمل مع 10٪ مصل بقري جنيني (FBS) و 1٪ المتوسطة (PS) ثقافة البنسلين ستربتومايسين. عد الخلايا باستخدام عدادة الكريات القياسية. تقييم قابلية الخلية من جزء من العينة الخلية باستخدام التريبان الأزرق. لوحة خلايا كافية للوصول إلى 90٪ التقاء في وقت ترنسفكأيشن.
  2. يوم 2: تغيير مستنبت مع 2 مل من جديد قبل تحسنت (37 درجة مئوية) مستنبت دون PS.
  3. لكل عينة ترنسفكأيشن، وإعداد اثنين من 1.5 مل أنابيب. في أنبوب 1، وتمييع 4 ميكروغرام من الحمض النووي في 250 ميكرولتر من انخفاض متوسط ​​المصل. في أنبوب 2، مزيج 10 ميكرولتر من كاشف ترنسفكأيشن بوساطة الحويصلية مع 250 ميكرولتر مستنبت خفض المصل. المزيج بلطف كاشف ترنسفكأيشن قبل الاستخدام.
  4. احتضان لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  5. الجمع بين محتويات أنبوب 1 و 2 أنبوب، مزيج بلطف واحتضان لا يقل عن 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  6. إضافة الجسيمات الشحمية / DNوالمجمعات إلى الخلايا المستزرعة وبلطف تهز الطبق الثقافة إلى المزيج.
  7. احتضان عند 37 درجة مئوية تحت 5٪ CO 2 الغلاف الجوي لمدة 24 ساعة.

3. تلون الخلايا للالتدفق الخلوي (3 ساعات)

  1. إعداد عينات الخلايا
    1. يوم 3: إزالة المتوسطة من الطبق الثقافة بعناية وغسل الخلايا مع 400 ميكرولتر من قبل حرارة (37 درجة مئوية) 0.05٪ التربسين 1X-EDTA (ثنائي أمين الإيثيلين رباعي حمض الخل).
    2. إضافة 400 ميكرولتر من التربسين-EDTA واحتضان الطبق عند 37 درجة مئوية تحت 5٪ CO 2 الغلاف الجوي لمدة 5 دقائق للسماح للخلايا لفصل من الطبق.
    3. وقف انزيم الهضم عن طريق إضافة 1 مل من مستنبت البارد دون PS وتغسل جميع الخلايا من السطح عن طريق pipetting بلطف 4-5 مرات. تجنب الإفراط في الهضم والإفراط pipetting لللحد من موت الخلايا.
    4. جمع الخلايا في أنابيب 1.5 مل ومكان على الفور على الجليد. استخدام حلول الباردة الجليد والحفاظ على الخلايا عند 4 درجات مئوية لمنع تدخيلمن السطح المستضدات. تقليل الإضاءة للحد من photobleaching من إشارة الفلورسنت.
    5. أنابيب الطرد المركزي في 400 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. نضح بعناية وتجاهل طاف.
    6. إعادة تعليق بيليه في 1 مل من 1X الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) لإعداد تعليق خلية واحدة.
    7. لفترة وجيزة دوامة الأنابيب بلطف شديد وكرر الخطوات من 3.1.5 و 3.1.6 لإزالة مستنبت.
    8. إعادة تعليق بيليه في 600 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني 1X وضبط تركيز الخلية إلى الحد الأدنى من 3 × 10 6 خلية / مل.
    9. تقسيم الخلايا في اثنين الجديدة 1.5 مل أنابيب لتلطيخ خارج الخلية والخلايا. وتشمل الضوابط المناسبة للتمييز تلطيخ محددة من تلطيخ غير محددة.
      ملاحظة: الجسم المضاد isotype السيطرة يساعد على تقييم مستوى تلوين الخلفية ويجب أن تتطابق بشكل مثالي الأنواع المضيفة كل الأجسام المضادة الأولية، ونمط إسوي وfluorophore. استخدام isotype السيطرة والأجسام المضادة مترافق في الوقت نفسهتركيز البروتين.

figure-protocol-4742
الجدول 1: الانسياب الخلوي عينات السيطرة التجربة لغير permeabilized وpermeabilized الخلايا كل تجربة يجب أن تشمل ضوابط السلبية التالية: (1) خلايا Nontransfected (بدون الأجسام المضادة، مع نمط إسوي أو مع الأجسام المضادة مترافق). (2) خلايا Transfected مع البروتين من الفائدة subcloned في البلازميد دون التأسيسي تألقي داخل الخلايا فلوري (pCMV- الكالسيوم الخامس α2δ1-HA) أو مع بناء الموسومة مضاعف (pmCherry-كا الخامس α2δ1 وحضنت دون الأجسام المضادة، مع نمط إسوي أو مع الأجسام المضادة مترافق). وتستخدم الضوابط لون واحد للحصول على تعويضات من تداخل الانبعاثات تألقي. يتم تشغيل الضوابط نفسها لغير permeabilized وpermeabilized الأوضاع في كل سلسلة من التجارب.

  1. تلطيخ الخلايا السطحية سليمةخلايا حية
    1. قسامة 1 × 10 6 خلية / 100 ميكرولتر في أنابيب 1.5 مل.
    2. إضافة FITC مترافق المضادة وحيدة النسيلة المضادة للHA الأجسام المضادة في 5 ميكروغرام / مل، ودوامة قبل احتضان الخلايا على منصة الروك (200 دورة في الدقيقة) في الظلام في 4 درجة مئوية لمدة 45 دقيقة.
      ملاحظة: تم تحديد تركيز الأمثل من الأجسام المضادة في التجارب المعايرة الأولية (الشكل 4).
    3. إزالة الخلايا من الظلام وإضافة 900 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني 1X / أنبوب. أجهزة الطرد المركزي في 400 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية.
    4. نضح طاف و resuspend بيليه في 1 مل من برنامج تلفزيوني 1X، دوامة والطرد المركزي في 400 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية.
    5. تكرار غسل (الخطوة 3.2.4) مرتين لإزالة أي أجسام مضادة غير منضم. إذا تم استخدام الأجسام المضادة الأولية اللامقترن، واحتضان مع الأجسام المضادة الثانوية المناسب.
    6. بعد غسل النهائي، resuspend الخلايا في 500 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني 1X ونقل تعليق خلية واحدة في 5 مل التدفق الخلوي الأنابيب. إبقاء الخلاياالصورة في الظلام في 4 درجات مئوية حتى تشغيل العينة.
    7. تشغيل العينات على الكريات التدفق. للحصول على أفضل النتائج، وتحليل الخلايا على قياس التدفق الخلوي في أقرب وقت ممكن وفي موعد لا يتجاوز 24 ساعة بعد.
  2. تلطيخ الخلايا: التثبيت، Permeabilization، وتلطيخ
    1. قسامة 1 × 10 6 خلية / 100 ميكرولتر في 1.5 مل الأنابيب وأجهزة الطرد المركزي في 400 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية.
    2. تجاهل الخلايا وطاف resuspend في 100 ميكرولتر من محلول التثبيت-permeabilization مباشرة من الأسهم.
    3. احتضان في الظلام في 4 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.
    4. إضافة 100 ميكرولتر من العازلة 1X permeabilization غسل الطازجة (تمييع 10X العازلة permeabilization الغسل في المقطر H 2 O). دوامة والرواسب الخلايا باستخدام جهاز للطرد المركزي الطاولة في 400 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية.
    5. نضح وتجاهل طاف.
    6. كرر الخطوات من 3.3.4 و 3.3.5.
    7. إضافة FITC مترافق المضادة وحيدة النسيلة-HA مكافحة الأجسام المضادة في 5ميكروغرام / مل في 100 ميكرولتر من العازلة 1X permeabilization الغسل، ودوامة قبل احتضان الخلايا في الظلام في 4 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
      ملاحظة: يتم تنفيذ تلطيخ الخلايا باتباع نفس الإجراء واحدة تستخدم لتلوين سطح الخلية. بوساطة سابونين permeabilization الخلية ومع ذلك، فإن عملية عكسها بسرعة، ولذلك فمن المهم أن تحل محل برنامج تلفزيوني 1X العازلة مع 1X بيرم / غسيل للحفاظ على الخلايا في الوجود المستمر للسابونين خلال تلطيخ الخلايا.
    8. إزالة الخلايا من الظلام، وإضافة 100 ميكرولتر العازلة permeabilization الغسل. أجهزة الطرد المركزي في 400 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية.
    9. نضح بعناية طاف و resuspend بيليه في 100 ميكرولتر العازلة permeabilization الغسل، دوامة والطرد المركزي في 400 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية.
    10. تكرار غسل (الخطوة 3.3.9) واحد مزيد من الوقت لإزالة أي أجسام مضادة غير منضم.
    11. بعد غسل النهائي، resuspend الخلايا في 500 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني 1X ونقل الخطيئةتعليق خلية غلي إلى 5 مل التدفق الخلوي الأنابيب. إبقاء الخلايا في الظلام في 4 درجات مئوية حتى حقن العينة إلى قياس التدفق الخلوي.
    12. تشغيل العينات على الكريات التدفق. تشغيل عينات ثابتة على الكريات في أقرب وقت ممكن ولكن في موعد لا يتجاوز 1 في الاسبوع بعد تلطيخ. تشغيل الخلايا غير permeabilized وpermeabilized في نفس اليوم.

4. التدفق الخلوي

  1. تدفق عداد الكريات خلية إعداد فارز يوميا
    1. تشغيل البرنامج التدفق الخلوي. قبل التجربة ومعايرة والإعداد قياس التدفق الخلوي فارز خلية لضمان الأداء الأمثل أداة (أي الليزر والبصريات يؤدون طبقا للمواصفات، ليزر والتدفق الخلوي يتم محاذاة بشكل صحيح) باستخدام الخرز إعداد الصك.
    2. استخدام فوهة 100 ميكرومتر مع 20 رطل ضغط غمد.
      ملاحظة: ليس لدى فوهة إلى تغيير على مقاعد البدلاء تدفق عداد الكريات.
    3. تعيين معدل تدفق الكريات وفقا لإنتاج موادمواصفات إيه. غاية معدلات تدفق عالية ستنخفض حساسية في الكشف عن الاختلافات في مضان.
    4. اختر الزرقاء (488 نانومتر لإثارة فلوريسئين Isothiocayanate أو FITC) والأصفر والأخضر (561 نانومتر لإثارة mCherry) ليزر. جمع FITC وmCherry مستويات مضان مع نانومتر 530/30 ومع 610/20 نانومتر ممر الموجة مرشح على التوالي.
    5. الحصول على مبعثر إلى الأمام (FCS) مقابل الجانب مبعثر (SSC) مؤامرة نقطة للخلايا غير ملوثين باستخدام مقياس خطي. ضبط تضخيم كل كاشف لتصور خلايا في الربع السفلي الأيسر من مؤامرة نقطة.
  2. قراءة عينة من خلايا سليمة غير permeabilized-
    1. تعيين P1gate للخلايا غير permeabilized الحية التي ترسم شكل حر حول الخلايا لتحليلها باستثناء حطام الخلايا والمجاميع الخلية، مما يحد من إشارة مضان إلى خلايا سليمة.
      ملاحظة: لايف / الأصباغ استبعاد الميتة يمكن استخدامها لتسهيل وضع بوابة على الخلايا الحية. تعيين 10000 الأحداث لتسجيلفي P1 بوابة توقف. تعيين هذا إلى عدد أكبر من الأحداث إذا دعت الحاجة إلى ذلك.
    2. الحصول mCherry مقابل FITC يومين المعلمة كفاف مؤامرة للكشف عن تألق ذاتي أساسي من خلايا غير ملوثين. استخدام على نطاق ونصف لوغاريتمي لإظهار القيم السلبية وتحسين قرار بين السكان 25. ضبط الجهد كل كاشف لضبط الخلايا السلبية غير ملوثين في الجزء السفلي من الوحدات العشرة الأولى من المؤامرات كثافة سجل مضان.
    3. الحصول على جميع العينات سليمة غير permeabilized باستخدام إعدادات أنشئت في 4.1.5 و4.1.6 وجمع FSC، SSC وإشارات في الكشف عن مضان.
    4. تصدير وحفظ الملفات * .fcs لاستخدامها في التحليل باستخدام التدفق الخلوي برامج التحليل.
  3. قراءة عينة من خلايا Permeabilized
    1. نقل بوابة P1 لتحديد الخلايا الحية في عينات permeabilized وضبط FSC والجهد SSC كما هو موضح في 4.1.5 و4.1.6.
    2. الحصول على جميع العينات permeabilized وجمع FSC، SSC لإشارات الثانية في الكشف عن مضان.
    3. تصدير وحفظ الملفات * .fcs لاستخدامها في التحليل باستخدام التدفق الخلوي برامج التحليل.
  4. تحليل البيانات
    1. إطلاق التدفق الخلوي ملفات برامج التحليل واستيراد * .fcs المحفوظة في 4.2.4 و4.3.3.
    2. انقر على العينة الأولى المدرجة في إطار مساحة العمل. نافذة جديدة سميت على اسم رقم أنبوب يفتح تلقائيا. بدء عملية المحاصرة في حبكة محكمة أمن الدولة مقابل FSC. رسم بوابة (P1) باستخدام رمز البيضوي حول الخلايا الحية، والقضاء على أي حطام، الخلايا الميتة، أو المجاميع التي لها مبعثر إلى الأمام مختلفة والتشرذم الجانب من الخلايا الحية
    3. لرسم يومين المعلمة كفاف مؤامرة من mCherry (المحور الصادي) مقابل FITC (محور س) كثافة مضان من الخلايا الحية، انقر فوق لأول مرة على محور س واختيار FITC-A قناة، ثم انقر على ذ -axis واختيار PE-mCherry-A القناة. انقر على أيقونة "رباعية" لوضع علامة رباعي في حافةخلايا utofluorescent في كل قناة مضان.
      ملاحظة: بوابة مقامة حول الخلايا إيجابية FITC وmCherry هي بوابة P2. يشار إلى السكان الخلية سلبي مضان باسم بوابة P3. انظر الشكل 5 للأسلوب النابضة التمثيلي المستخدمة في هذه المقالة.
    4. حدد P2 P3 والبوابات وانقر على أيقونة "إضافة الاحصائيات" في إطار مساحة العمل الأصلي. انقر على "الكونت" (عدد الخلايا إيجابية)، وانقر على "المتوسط" (متوسط ​​مضان شدة كل تألقي) أو "الوسيط" (الأوسط الإسفار كثافة كل تألقي) الإحصاءات ضمن قائمة من الخيارات. انقر على أيقونة "إضافة الإحصاء" مرة أخرى. يتم نقل جميع هذه القيم تلقائيا إلى إطار مساحة العمل الأصلي.
      ملاحظة: "يعني" يستخدم فقط إذا كانت كثافة مضان تتبع التوزيع الطبيعي. في كل حالة أخرى، انقر فوق علامة التبويب "الوسيط". مؤسسة التمويل الأصغر وبالتالي يمكن أن تشير إلى مضان يعني كثافهذ أو وسيطة الإسفار كثافة.
      ملاحظة: الخطوة التالية هي تطبيق المعلمات والإحصاءات بوابات "لجميع عينات بحثها من قبل الكريات.
    5. في إطار مساحة العمل، واستخدام الماوس لسحب وإسقاط البوابات وإحصاءات المعلمات على خط علامة جميع العينات.
    6. إنشاء تقرير دفعة من المؤامرات ثنائية الأبعاد كفاف (mCherry مقابل FITC) ورسوم بيانية (خلية عد مقابل كثافة مضان) للخلايا غير permeabilized وpermeabilized (أرقام 6A - B).
    7. من الإحصاءات إنشاؤه في الخطوة 4.4.4، وحساب كثافة مضان متوسط ​​(MFI) لكل تألقي للخلايا الملون. من هذه القيمة، وطرح قيمة مؤسسات التمويل الأصغر التي تم الحصول عليها من خلايا غير ملوثين لتحديد السطح والتعبير الكلي للبروتين من الفائدة.
    8. عن القيم ΔMFI لكل fluorophore (mCherry وFITC) (الشكل 6C - D). تطبيع ΔMFI قياس لكا V α2δ1 بناء المسوخ إلى القيمة ΔMFI التي تم الحصول عليها FITC وmCherry مع بناء WT.
      ملاحظة: القيمة المطلقة للكثافة مضان يمكن أن تختلف بشكل كبير تبعا لمجموعة من الأجسام المضادة والقدرات التقنية لكل عامل مختبر، وبالتالي الحاجة إلى تطبيع كثافة مضان من بناء متحولة باستخدام بناء WT.

النتائج

توضح هذه المقالة بروتوكول يمكن الاعتماد عليها لتحديد مساحتها الكلية وخلية من القنوات الأيونية المؤتلف وأعرب في TSA-201cells بتدفق اللونين الخلوي الفحص. وكمثال على ذلك، كان كميا سطح الخلية النسبي ومجموع تعبير البروتين لV α2δ1subunit الكالسيوم. من أجل أ?...

Discussion

تم تطبيق هذا التدفق الفحص القائمة على الخلوي بنجاح لقياس مستويات الكلية وسطح الخلية النسبية للمفارز fluorescently المسمى تشكيل المسام وما يرتبط بها من قنوات الكالسيوم الجهد بوابات 14،22،26. يتم استخدام أفضل ما عند التحقيق في تأثير الطفرات الوراثية، وبالتالي يتطلب أن ك...

Disclosures

The authors declare that they have no competing financial interests.

Acknowledgements

We thank Mr. Serge Sénéchal and Dr. Jacques Thibodeau for sharing their expertise and granting us access to their flow cytometry and cell sorting platform. This work was completed with the operating grant 130256 from the Canadian Institutes of Health Research, a grant-in-aid from the Canadian Heart and Stroke Foundation, and support from the "Fondation de l'Institut de Cardiologie de Montréal" to L.P.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Q5 Site-Directed Mutagenesis KitNew England BiolabsE0554SCan be substitute with QuickChange site-directed mutagenesis Kit (Agilent, #200523).
Tubes 1.5 mlSarstedt72-690-001
Tubes 15 ml Sarstedt 62-554-002
Disposable graduated Tranfer Pipets VWR160001-192 
100 mm culture dishCorning430167For standard culture of HEKT cells.
35 mm culture dishFalcon353001For standard culture of HEKT cells.
Serological pipette 1 mlSarstedt86.1251.001
Serological pipette 5 mlSarstedt86.1253.001
Serological pipette 10 mlSarstedt86.1254.001
Serological pipette 25 mlSarstedt86.1285.001
Dulbecco's high-glucose mediumLife Technologies12100-046Warm in 37 °C water bath before use.
Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated, US originLife Technologies16140-071
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml)Life Technologies15140-122
Lipofectamine 2000 Life Technologies11668-019For liposomal transfection. Can be substituted with calcium phosphate transfection.
Opti-MEM I Reduced Serum MediumLife Technologies31985-070Warm in 37 °C water bath before use.
Trypsin-EDTA (1x) 0.05%, phenol redLife Technologies25300-062
1.5 ml microtubesSarstedt72.690.001
 Phosphate Buffered Saline 1xFisherBP661-10Can be "home-made".
Anti-HA FITC conjugated antibodySigmaH7411
IgG1−FITC Isotype Control antibodySigmaF6397
BD Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Solution KitBD Biosciences554714Fixation/Permeabilization. Permeabilization/Wash solution, store at 4 °C.
HemacytometerFisher49105161
Trypan BlueFisher15250061To access cell viability.
Refrigerated Microcentrifuge, 5430REppendorf A14H172200
Forma Steri-Cycle CO2 IncubatorFisher370
Laboratory Platform RockerFisher545034
Water BathVWR89032-216
BD FACSARIA III BD Biosciences648282Flow cytometer.
FlowJo Software v10FlowJoFlowJo v10 DongleFor data analysis.

References

  1. Delisle, B. P., Anson, B. D., Rajamani, S., January, C. T. Biology of Cardiac Arrhythmias: Ion Channel Protein Trafficking. Circ. Res. 94, 1418-1428 (2004).
  2. Birault, V., Solari, R., Hanrahan, J., Thomas, D. Y. Correctors of the basic trafficking defect of the mutant F508del-CFTR that causes cystic fibrosis. Curr Opin Chem Biol. 17, 353-360 (2013).
  3. Balijepalli, S. Y., Anderson, C. L., Lin, E. C., January, C. T. Rescue of Mutated Cardiac Ion Channels in Inherited Arrhythmia Syndromes. J. Cardiovas Pharm. 56, 113-122 (2010).
  4. Gargus, J. J. Unraveling Monogenic Channelopathies and Their Implications for Complex Polygenic Disease. Am. J. Hum. Genet. 72, 785-803 (2003).
  5. Abriel, H., Zaklyazminskaya, E. V. Cardiac channelopathies: Genetic and molecular mechanisms. Gene. 517, 1-11 (2013).
  6. Behr, E. R., et al. Sudden arrhythmic death syndrome: familial evaluation identifies inheritable heart disease in the majority of families. Eur Heart J. 29, 1670-1680 (2008).
  7. Catterall, W. A. Structure and regulation of voltage-gated Ca2+ channels. Annu. Rev. Cell Dev.Biol. 16, 521-555 (2000).
  8. Peterson, B. Z., DeMaria, C. D., Adelman, J. P., Yue, D. T. Calmodulin is the Ca2+ sensor for Ca2+ -dependent inactivation of L- type calcium channels. Neuron. 22, 549-558 (1999).
  9. Dolphin, A. C. Calcium channel diversity: multiple roles of calcium channel subunits. Curr.Opin.Neurobiol. 19, 237-244 (2009).
  10. Dai, S., Hall, D. D., Hell, J. W. Supramolecular assemblies and localized regulation of voltage-gated ion channels. Physiol Rev. 89, 411-452 (2009).
  11. Gao, T., et al. Identification and subcellular localization of the subunits of L-type calcium channels and adenylyl cyclase in cardiac myocytes. J. Biol. Chem. 272, 19401-19407 (1997).
  12. Carl, S. L., et al. Immunolocalization of sarcolemmal dihydropyridine receptor and sarcoplasmic reticular triadin and ryanodine receptor in rabbit ventricle and atrium. J. Cell Biol. 129, 673-682 (1995).
  13. Abriel, H., Rougier, J. S., Jalife, J. Ion Channel Macromolecular Complexes in Cardiomyocytes: Roles in Sudden Cardiac Death. Circ. Res. 116, 1971-1988 (2015).
  14. Bourdin, B., et al. Molecular Determinants of the Cavb-induced Plasma Membrane Targeting of the Cav1.2 Channel. J. Biol. Chem. 285, 22853-22863 (2010).
  15. Raybaud, A., et al. The Role of the GX9GX3G Motif in the Gating of High Voltage-activated Calcium Channels. J. Biol. Chem. 281, 39424-39436 (2006).
  16. Burashnikov, E., et al. Mutations in the cardiac L-type calcium channel associated with inherited J-wave syndromes and sudden cardiac death. Heart Rhythm. 7, 1872-1882 (2010).
  17. Hennessey, J. A., et al. A CACNA1C Variant Associated with Reduced Voltage-Dependent Inactivation, Increased Cav1.2 Channel Window Current, and Arrhythmogenesis. PLoS ONE. 9, e106982 (2014).
  18. Adan, A., Alizada, G., Kiraz, Y., Baran, Y., Nalbant, A. Flow cytometry: basic principles and applications. Crit Rev Biotechnol. , 1-14 (2016).
  19. Graham, M. D. The Coulter Principle: Foundation of an Industry. J. Lab. Autom. 8, 72-81 (2003).
  20. Baumgarth, N., Roederer, M. A practical approach to multicolor flow cytometry for immunophenotyping. J. Immunol. Methods. 243, 77-97 (2000).
  21. Rothe, G., Sack, U., Tarnok, A., Rothe, G. . Cellular Diagnostics. Basics, Methods and Clinical Applications of Flow Cytometry. , 53-88 (2009).
  22. Bourdin, B., et al. Functional Characterization of Cavalpha2delta Mutations Associated with Sudden Cardiac Death. J. Biol. Chem. 290, 2854-2869 (2015).
  23. Tetreault, M. P., et al. Identification of glycosylation sites essential for surface expression of the Cavalpha2delta1 subunit and modulation of the cardiac Cav1.2 channel activity. J. Biol. Chem. 291, 4826-4843 (2016).
  24. Senatore, A., Boone, A. N., Spafford, J. D. Optimized Transfection Strategy for Expression and Electrophysiological Recording of Recombinant Voltage-Gated Ion Channels in HEK-293T Cells. J Vis Exp. (47), (2011).
  25. Herzenberg, L. A., Tung, J., Moore, W. A., Herzenberg, L. A., Parks, D. R. Interpreting flow cytometry data: a guide for the perplexed. Nat.Immunol. 7, 681-685 (2006).
  26. Shakeri, B., Bourdin, B., Demers-Giroux, P. O., Sauve, R., Parent, L. A quartet of Leucine residues in the Guanylate Kinase domain of Cavbeta determines the plasma membrane density of the Cav2.3 channel. J Biol Chem. 287, 32835-32847 (2012).
  27. Morton, R. A., Baptista-Hon, D. T., Hales, T. G., Lovinger, D. M. Agonist- and antagonist-induced up-regulation of surface 5-HT3A receptors. Br. J. Pharmacol. 172, 4066-4077 (2015).
  28. Hoffmann, C., et al. Fluorescent labeling of tetracysteine-tagged proteins in intact cells. Nat. Protocols. 5, 1666-1677 (2010).
  29. Cockcroft, C. J., Gamper, N. . Ion Channels: Methods and Protocols. , 233-241 (2013).
  30. Gonzalez-Gutierrez, G., Miranda-Laferte, E., Neely, A., Hidalgo, P. The Src Homology 3 Domain of the beta-Subunit of Voltage-gated Calcium Channels Promotes Endocytosis via Dynamin Interaction. J. Biol.Chem. 282, 2156-2162 (2007).
  31. Galizzi, J. P., Borsotto, M., Barhanin, J., Fosset, M., Lazdunski, M. Characterization and photoaffinity labeling of receptor sites for the Calcium channel inhibitors d-cis-diltiazem, (+/-)-bepridil, desmethoxyverapamil, and (+)-PN 200-110 in skeletal muscle transverse tubule membranes. J. Biol.Chem. 261, 1393-1397 (1986).
  32. Bezanilla, F. The voltage sensor in voltage-dependent ion channels. Physiol.Rev. 80, 555-592 (2000).
  33. Sigworth, F. J. The variance of sodium current fluctuations at the node of Ranvier. J Physiol. 307, 97-129 (1980).
  34. Bailey, M. A., Grabe, M., Devor, D. C. Characterization of the PCMBS-dependent modification of KCa3.1 channel gating. J. Gen. Physiol. 136, 367-387 (2010).
  35. Fletcher, P. A., Scriven, D. R., Schulson, M. N., Moore, E. D. Multi-Image Colocalization and Its Statistical Significance. Biophys. J. 99, 1996-2005 (2010).
  36. Lizotte, E., Tremblay, A., Allen, B. G., Fiset, C. Isolation and characterization of subcellular protein fractions from mouse heart. Anal. Biochem. 345, 47-54 (2005).
  37. Mattheyses, A. L., Simon, S. M., Rappoport, J. Z. Imaging with total internal reflection fluorescence microscopy for the cell biologist. J. Cell Sci. 123, 3621-3628 (2010).
  38. Yamamura, H., Suzuki, Y., Imaizumi, Y. New light on ion channel imaging by total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy. J. Pharmacol. Sci. 128, 1-7 (2015).
  39. Wible, B. A., et al. HERG-Lite-R: A novel comprehensive high-throughput screen for drug-induced hERG risk. J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 52, 136-145 (2005).
  40. Wilde, A. A. M., Brugada, R. Phenotypical Manifestations of Mutations in the Genes Encoding Subunits of the Cardiac Sodium Channel. Circ. Res. 108, 884-887 (2011).
  41. Milano, A., et al. Sudden Cardiac Arrest and Rare Genetic Variants in the Community. Circ Cardiovasc Genet. , (2016).
  42. Schnell, U., Dijk, F., Sjollema, K. A., Giepmans, B. N. G. Immunolabeling artifacts and the need for live-cell imaging. Nat. Meth. 9, 152-158 (2012).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

115

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved